Concept : Cell Yield. Experimental observation. Cell mass is proportional to available substrate. Slope = 7.2 µg/ml per mm.

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Emilia Prado Rico
hace 8 años
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1 Experimental observation Concept : Cell Yield Cell mass is proportional to available substrate Slope = 7.2 µg/ml per mm Glucose, mm

available substrate 300 250 200 Slope = 7.

2 Cell Yield Formal Definition Cell Yield is: Y x / s = Change in Cell Mass Substrate Consumed Y x / s = dx ds

3 Cell Growth in Batch Culture

4 Typical Growth Rates Organism Growth Rate Doubling time µ [h-1] [h] E. coli Yeast Hybridoma Insect Cells

5 Nature of Specific Growth Monod Kinetics µ = µ K s m S + S µ, 1/h How does one experimentally determine cell parameters? S, g/ L Population Growth Rate? Monod Kinetics. Dependence of Growth Rate on Limiting Substrate. Specific growth rate reaches a maximum value of 0.5 h-1. Value of K S here is 0.5 g L -1. Note that when S = 0.5 g L-1, µ is half of its maximum.

0 0 5 10 15 20 25 S, g/ L Population Growth Rate? Monod Kinetics.

6 Expresión y producción de proteínas Sistemas de expresión Bacteriano Hongos/levaduras Animales Plantas Insectos Otros Recuperación de proteínas Etiquetas de His Fusiones MBP

7 Objectivos de la expresión de proteínas en producción industrial Fermentación segura y bajo control Barata Alto nivel de proteína recombinante (g/l no mg/l) Facilidad de recuperar proteínas expresadas Que la proteína expresada no se degrade

nivel de proteína recombinante (g/l no mg/l) Facilidad de

8 Huespedes de expresión microbiano E. coli VENTAJAS Gran cantidad de vectores a usa (fago λ phage y plásmidos derivados de puc) Altisima eficiencia de transformación Fermentaciones muy bien conocidas Recuperación y lisis celular muy sencilla DISVENTAJAS Problemas de contaminaciones con pirógenos A veces baja expresión No glicosilas las proteínas Proteínas no se exportan

Altisima eficiencia de transformación Fermentaciones muy bien conocidas Recuperación y lisis

9 Un vector de E. coli plasmídico Cribado por color promotores de SP6 o T7 RNA polimerasas Selección de resistencia a Amp

10 [B] Heterologous biological expression systems (in vivo) 1) E. coli Advantages Relatively simple procedure Rapid Very high expression level Liepman and Olsen (2003) Plant Physiol. 131: IPTG Disasdvantages Codon usage Solubility (inclusion body, degeneration) Limitation in the length of cdna Lacks post-translational modification (glycosylation, phosphorylation etc.) Subcellular targeting of expression Two common promoter systems: - T7 promoter - IPTG (isopropyl thiogalactoside) inducible promoter periplasm cytoplasm The decision to target the expressed protein to a specific cellular compartment, that is, to the cytoplasmic space, periplasmic space or the culture medium, rests on balancing the advantages and disadvantages of each compartment extracellular

etc.) Subcellular targeting of expression Two common promoter systems: - T7 promoter - IPTG (isopropyl thiogalactoside) inducible promoter periplasm cytoplasm The decision to target the

11 Huesped de expresión microbiana Saccharomyces cerevisiae VENTAJAS Rendimiento de expresión moderado Glicosilación de Proteínas exp. Exporta Proteínas exp. Fermentaciónes muy bien conocidas Recuperación y lisis celular sencilla DESVENTAJAS Eficiencia de transformación baja-media Un rango limitado de vectores Genes expresados se deben incorporar de manera estable

Fermentaciónes muy bien conocidas Recuperación y lisis celular sencilla DESVENTAJAS

12 Huespedes de espresión microbiana Pichia pastoris and Kluveromyces sp. VENTAJAS Rendimientos de expresión moderadas Proteínas glicosiladas Proteínas exportadas Recuperación sencilla DESVENTAJAS Eficiencia de transformación media-baja Fermentaciones difíciles Limitado rango de vectores Genes de deben de incorporar estable Uso de codones inusuales

exportadas Recuperación sencilla DESVENTAJAS Eficiencia de transformación media-baja

13 Huespedes de espresión microbiana Bacillus VENTAJAS Rendimientos de expresión muy altos (>10 g/l) Fermentaciones sencillas Proteínas expoertadas Sistema de recuperación sencilla Ocurren naturalmente DESVENTAJAS Rango limitado de vectores Los vectores optimizados son privados No glycosila Sistema de transformación variables

recuperación sencilla Ocurren naturalmente DESVENTAJAS Rango limitado de

14 Expresión en células de insecto (Sistema específico huesped-vector; células de insecto en cultivo Sf9 y vectores de Baculovirus vectors VENTAJAS Glicosilación Escalable a volúmenes grandes DESVENTAJAS Un sistema de transformación altamente específico (Baculovirus) Cultivo fastidioso Tiempo de crecimiento my lento (tiempo de doblaje es 20h)

Escalable a volúmenes grandes DESVENTAJAS Un sistema de transformación altamente

15 Cultivo de células de plantas VENTAJAS Suspensiones celulares Se requiere baja aireación Protein dirigidas a la vacuola DESVENTAJAS Rango restringido de sistemas de transformación Agrobacterium para dicots Biolistica para monocots Virus de plantas específicos Crecimiento muy lento (d.t. 15h 48h) Muy sensible a estrés Crece de manera heterotrófica pero requiere luz para crecimiento óptimo

16 Cultivo de células animales VENTAJAS Glicosilación exacta Se pueden tranformar en lineas celulares Algunas crecen en suspensiones (p.e. células CHO) Algunas céulas derivadas de carcinoma (p.e. células HeLa) crecen muy rápido Expresión extracelular DESVENTAJAS La mayoría crecen adheridas Requerimientos complejos para crecimiento Tiempo de crecimiento muy lento (t.d h) Muy susceptible a contaminación Muy sensible a estreses

muy rápido Expresión extracelular DESVENTAJAS La mayoría crecen adheridas Requerimientos complejos para

17 Otros sistemas de expresión Sistema de expresión de tabaco Usa TMV Promotores específicos de tejido Se puede escalar Sistema de expresión en animal completo Transformación de embrion sin fertilizar Uso de promotores específicos de tejidos (p.e. promotor específico de la lactosa para la expresión sólo en la leche)

Transformación de embrion sin fertilizar Uso de promotores específicos de

18 Desarrollo de sistemas de expresión Plásmidos multicopia Múltiples marcadores de selección (ampicilina, tetraciclina, kanamicina ) Promotores diferentes (ITPG, Trp, inducible por temperatura, Tet) Multiples secuencias ori Etiquetas N o C terminal tags (p.e., poli-his) con sitios de ruptura

Promotores diferentes (ITPG, Trp, inducible por temperatura, Tet)

19 Vectores designados para la recuperación de proteínas: Etiquetas de His Vectores contienen poligca Proteínas tienen polyhis Recuperación con proteínas de afinidad Ni- NTA

20 Recombinant protein expression [A] Cell free systems (in vitro) - Rabbit reticulocyte lysate translation system - Wheat Germ Extract Contain the cellular components necessary for protein synthesis (trna, ribosomes, amino acids, and initiation, elongation and termination factors). - Coupled transcription/translation systems High protein yields to continuous-exchange cell-free (CECF) technology. A semi-permeable membrane separates two chambers that contain a reaction compartment for coupled transcription/translation from an enhanced E. coli lysate, and a feeding compartment for substrates and energy components. Protein synthesis can continue for up to 24 hours as substrates and energy components continuously diffuse across the membrane into the reaction compartment while inhibitory reaction by-products simultaneously diffuse away, into the feeding compartment. As with other open systems, researchers can add detergents, chaperones, labeled amino acids, cofactors, and protease inhibitors during the reaction and monitor protein quantities at any time. If desired, investigators can co-express multiple proteins by using several DNA templates in one reaction

A semi-permeable membrane separates two chambers that contain a reaction compartment for coupled transcription/translation from an enhanced E.

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