EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES

Transcripción

1 EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES

2 DNA a clonar mrnade la proteína de interés ESQUEMA DE CLONADO Digestión con enzimas de restricción Ligación Vector E. coli competentes Transformación Selección Screening Plantas transgenicas Bacterias modificadas Terapia génica Proteínas recombinantes

3 SINTESIS DE cdna SINTESIS 1 ERA CADENA 5 cap mrna AAAAAA(A) n A 3 datp dttp dgtp dctp Transcriptasa reversa DNA polimerasa cdna

4 PCR Primers: Forward incluye AUG F Reverse incluye STOP R Clonado en vector de expresión

5 PROMOTOR

6 PstI F PCR Primers: Forward incluye AUG Reverse incluye STOP R KpnI Clonado en vector de expresión

7 Sistemas de expresión E. coli Rápido, barato, fácil(cuando funciona) Fácil clonado Cultivo barato Rápido crecimiento Deficiente en modificaciones post-traduccionales eucariotas glicosilación, fosforilatcon, etc. Deficiente en ciertos trnas comunes a genes eucariotas Ciertas proteínas se pliegan mal y forman cuerpos de inclusión

8 Levaduras Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae Clonado en E. coli, luego se transforma el DNA en la levaduras Rapido crecimiento, no tan alta producción. Modificaciones post-traduccionales

9 Sistemas de expresión eucariotas Baculovirus / Células de insectos Clonado en E. coli, transfección células de insecto, Modificaciones post-traduccionales muy semejantea a mamiferos Señales de secreción, glicosilacón and fosforilación Expresa bien proteínas secretadas de membrana, e intracelulares Sistemas de células de mamiferos Autenticas modificaciones post-traduccionales Erythropoeitin (Epogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) CHO cells (Chinese hamster ovary) HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), BHK (baby hamster kidney cells) Companias : Genentech (S. San Francisco, CA, USA), Roche (Basel, Switzerland), Novartis (Basel, Switzerland) and Bayer (Berkeley, CA, USA), proteinas recombinantes de uso medicinal )

10 Ejemplos de sobrexpresión de proteínas para purificación PROMOTORES en general INDUCIBLES Bacterias: Lactosa o análogos IPTG Levaduras: Galactosa

11 Cromatografía de afinidad

12 Expresión y purificación de proteínas recombinantes MCS TAG Promotor

13 Proteínasde fusión Gene 1 gene of interest MET... LEU ARG THR-stop METVAL ILE... stop ATG... GTG CGA ACC TAA ATG GTG ATC... TAG Gene 1 gene of interest MET... LEU ARG THR MET VAL ILE... stop ATG... GTG CGA ACC ATG GTG ATC... TAG

14 Corte proteasa

15 Proteínas Humanas recombinantes Erythropoietin (EPO) Insulina Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) alpha-l-iduronidase (rhidu; laronidase) acetylgalactosamine-4-sulfatase (rhasb; galsulfase) Dornase alfa ( DNAsa) Tissue plasminogen activator (TPA) Glucocerebrosidase Ceredase by Genzyme Interferon (IF) Interferon-beta-1a Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) Viral recombinantes Proteína de envoltura de hepatitis B virus Molecular biology enzymes Factor X Taq Pol AMMV (Transcriptasa reversa) Enzimas de restricción

16 MUTAGENESIS La mutagénesis in vitro es usada para producir cambios en la información genética. Análisis de los subsecuentes cambios, en la expresión y actividad del producto ayuda a elucidar el efecto funcional de la mutación. Tipos Mutagenesis al azar Mutagenesis sitio dirigida

17 Al azar TaqDNAP I sin proofreading ( 0,1x 10-4 a 2x10-4 ) Manganeso aumenta velocidad de error [dntps] no equimolar Se transforma el producto mutado en E. coli y Levadura Screening por fenotipo

18 Clonado Screening Secuenciacion

19 Dirigida Figure 1A. PCR for Base Substitutions. Primers containing the base changes of interest as a non-complementary break in the primer sequence (indicated by the blue bubble in primer A) are used in a PCR reaction. As the primers are extended, the resulting amplification product incorporates the mutation, replacing the original sequence (shown as a blue bar in the PCR product).

20 Dirigida

21 Evolución dirigida Estabilidad estructural Termoestabilidad Mayor reactividad Selectividad enantiomero Solubilidad Expresión Forma de optimizar enzimas, para adaptar proteínas a las demandas industriales y para avanzar en ele entendimiento de las relaciones estructura función en las biocatalisis

22 Métodos para mutagenizar

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24 Objetivo: Evolución de citocromo P450, enzima con mas actividad Catálisis de oxidación de sustratos orgánicos. Mejoramiento de actividad peroxigenasa (oxidación usando peroxido). Hidroxilacion de alcanos, alquenos, alcoholes, ácidos grasos, amidas, hidrocarburos poliaromaticos y heterociclos Screen for P450cam aromatic hydroxylation activity using horseradish peroxidase (HRP) [9 ]. (a) Naphthalene is taken up by the E. coli cell where it is hydroxylated by P450cam. The resulting naphthol is oxidatively coupled by intracellularly coexpressed HRP and converted into fluorescent polymers, which remain associated with the cell. (b) Representative results of screening the first P450cam random mutant library usingfluorescence digital imaging (inset shows image of a section of an agar plate). Naphthalene hydroxylation activities, as measured by the total fluorescence generated during a fixed incubation period, are plotted in descending order. The range of total fluorescence of clones expressing wild-type P450cam is indicated with gray bar. Confirmed higher activity mutants are labeled.

25 Otro ejemplo Uso de selección genetica en E.coli, para aislar variantes termofilicas de Indolglicerol fosfato sintetasa, que permitiera a las células crecer mas rápido a 37 C

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