Evaluación inmunoserológica del paciente Viviana Lifschitz, Luis A. Merino

Transcripción

1 Evaluación inmunoserológica del paciente Viviana Lifschitz, Luis A. Merino La presencia de anticuerpos contra un antígeno en particular en el suero de un paciente o de antígenos en una muestra clínica se demuestra efectuando una reacción serológica. Para realizar estos estudios, se cuenta con una gran variedad de metodologías basadas en una reacción antígeno-anticuerpo, la cual puede ser puesta en evidencia mediante diferentes técnicas. La elección de una prueba inmunológica en particular, ya sea para realizar el diagnóstico de una enfermedad infecciosa o evaluar su evolución, se fundamenta en diferentes puntos: 1. Etapa probable de la enfermedad que se desea diagnosticar (aguda o crónica) 2. Sensibilidad y Especificidad de la reacción (se explicarán más adelante). 3. Costo de la prueba a aplicar (Generalmente se comienza el estudio con pruebas de screening o tamizaje las cuales son menos costosas). 4. Factibilidad de realización (debido a su complejidad algunas pruebas sólo se realizan en grandes laboratorios o centros de referencia) 5. Urgencia en la obtención de resultados (Algunas pruebas serológicos sólo insumen 3 a 5 minutos en su realización mientras que otras llevan varias horas hasta obtener el resultado) En la Tabla I, al final del capítulo, se presenta un resumen de las pruebas inmunoserológicas más empleadas y su utilidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. De acuerdo al objetivo que se persigue en su realización, las pruebas inmunológicas se clasifican en: a) Directas: cuando lo que se desea detectar son antígenos del microorganismo en una muestra b) Indirectas: cuando lo que se desea detectar son los anticuerpos formados contra un agente infeccioso en particular. En cuanto a la metodología empleada, las técnicas inmunológicas más utilizadas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas pueden clasificarse en: a) Precipitación b) Aglutinación c) Anticuerpos marcados d) Técnicas de inmunoblotting e) Pruebas de inhibición f) Fijación del complemento Influyen en el desarrollo de estas reacciones los siguientes factores: a) la concentración relativa de anticuerpos y antígenos, b) el ph del medio, la clase y concentración de iones, c) la presencia de sustancias interferentes, d) la temperatura, e) la calidad de los anticuerpos empleados en las técnicas directas y f) la calidad de los antígenos en las pruebas indirectas. Cuando lo que se intenta es estudiar la presencia de anticuerpos frente a un determinado agente infeccioso, podemos tener resultados cualitativos (el anticuerpo está presente o no) o cuantitativos (qué cantidad relativa de anticuerpos existen). En el primer caso, sólo se realiza una sola determinación cuyo resultado será positivo o negativo, en el segundo caso, 1

2 deben realizarse diluciones seriadas del suero del paciente (generalmente son diluciones al medio, p.e.: ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 128, etc. La prueba se aplica a todas las diluciones del paciente y se considera como título de anticuerpos a la inversa de la máxima dilución que presente un resultado positivo. Por ejemplo: si en una reacción dada tenemos resultados positivos en las diluciones ½, ¼, 1/8, 1/16 y 1/32, y negativos en las diluciones 1/64, 128, etc., el título de anticuerpos de ese paciente para esa reacción será de 32. En la mayoría de las reacciones en las cuales se titulan anticuerpos, especialmente en las utilizadas para diagnosticar infección aguda viral (p.ej. Rubéola, sarampión, etc), lo que se busca es un aumento de al menos 4 veces el título inicial, para ello se extrae al paciente una muestra de sangre en fase aguda y otra en el período de convalescencia y se realiza la titulación de anticuerpos en ambas muestras ( Muestras pareadas ). Ejemplo: si en fase aguda el paciente tiene un título de anticuerpos de 4 frente al virus de la varicela y en fase de convalescencia un título de 32, es evidencia de que el paciente sufrió una infección reciente por dicho virus. En otras enfermedades, principalmente aquellas poco frecuentes o frente a las cuales es poco probable que la población general haya estado expuesta y presente anticuerpos específicos, (P.e.: Herpes tipo II, SIDA), el solo pasaje de ser seronegativo a presentar serología positiva ya es evidencia de infección reciente (Seroconversión) Reacciones de precipitación Ocurren cuando el antígeno es una molécula soluble. Al unirse en cantidades equivalentes del anticuerpo, se forma una red de precipitación haciéndose visible la reacción. Son ejemplos de estas técnicas las de: a) Pocillos sembrados Fig. 1: Inmunodifusión doble: Ag (antígeno), Ab (anticuerpo). Ejemplo para detección de anticuerpos en el paciente. a) Inmunodifusión doble (IDD): el antígeno y el anticuerpo se enfrentan en gel de agarosa y luego de permitir su difusión durante 72 horas, la presencia de bandas de precipitación indica resultado positivo. (Figura 1). Esta prueba se aplica principalmente en la detección de anticuerpos dirigidos contra ciertos géneros de hongos como ser Aspergillus, Cándida, Paracoccidioides e Histoplasma. b) Contrainmunoelectroforesis (CIEF): se basa en el mismo principio que la IDR con la diferencia que la placa de agarosa se somete a un campo eléctrico, con lo cual se fuerza la migración del antígeno y los anticuerpos, acortando el tiempo de reacción y aumentando hasta veces la sensibilidad de la prueba (Figura 2). Esta prueba tiene aplicación principalmente en la detección de polisacáridos capsulares en LCR de pacientes con meningitis por Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis o Haemophilus influenzae tipo b. Fig. 2: Esquema de la técnica de CIEF 2

3 Gel que contiene el Ac Diámetro 2 Anillo de precipitación c) Inmunodifusión radial (IDR): permite cuantificar proteínas séricas. Se siembra el suero del paciente en pocillos practicados sobre un gel de agarosa conteniendo los anticuerpos contra la proteína (antígeno) que desea cuantificarse. La proteína difunde y va precipitando con el anticuerpo específico, dejando como resultado un halo de precipitación, ción, siendo la concentración de proteínas proporcional al cuadrado del halo de precipitación formado (Figura 3). Esta técnica no se utiliza para diagnosticar una enfermedad infecciosa sino para evaluar el estado inmune del paciente (Ver más adelante). Concentración del Ag Fig. 3: Esquema de los halos obtenidos en una reacción de IDR y del gráfico correspondiente que muestra la relación entre el cuadrado del diámetro y la concentración de antígenos (Proteínas) en la muestra. Una forma especial de las reacciones de precipitación es la reacción de floculación, en la cual el antígeno que se utiliza es lipídico y en vez de estar disuelto se encuentra emulsionado en una fase acuosa. Un ejemplo es la prueba de V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laboratory) para la detección de anticuerpos inespecíficos (reaginas) en pacientes con sífilis. Reacciones de aglutinación Estas reacciones pueden ser de dos tipos diferentes: a) Las que utilizan antígenos particulados (aglutinación directa o activa) como ser bacterias o parásitos. Tienen amplia aplicación, principalmente en la detección de anticuerpos anti Brucella (Reacción de Huddleson), anti Salmonella Typhi (Reacción de Widal), y para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades como la de Chagas y Toxoplasmosis. a) Aglutinación directa b) Aglutinación indirecta Antígeno eritrocitario Anticuerpo Eritrocito Sensibilizado Fig. 4. Esquema de partículas insolubles que reaccionaron con anticuerpos del paciente b) Las que utilizan antígenos solubles unidos a partículas que actúan como soporte inerte (aglutinación pasiva o indirecta) como ser hematíes o partículas de látex (Figura 4). En el caso particular en que los antígenos se fijen a hematíes la técnica se denomina hemaglutinación indirecta (HAI). Estas pruebas se realizan en portaobjetos o en policubetas; la formación de redes de aglutinación se manifiesta como grumos en las pruebas en portaobjetos (Figura 5) y como mantos en pruebas en policubetas (Figura 6). Fig. 5: Aglutinación indirecta en portaobjetos. Izquierda: prueba positiva Derecha: prueba negativa Una forma particular de técnica de aglutinación es la coaglutinación, en la cual se utilizan anticuerpos específicos unidos por su fracción Fc a la proteína A de Staphylococcus aureus (la bacteria actuaría de soporte inerte) y se utiliza preferentemente para detectar antígenos solubles de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus 3

4 agalactiae y Criptococcus neoformans en líquidos orgánicos como ser LCR. Fig. 6: Prueba de hemaglutinación en policubetas con diluciones seriadas del suero del paciente. El manto indica resultado positivo. El botón indica resultado negativo. El título de anticuerpos es la mayor dilución que arroja resultado positivo. Para cada suero se incluyen controles positivos (pos) y negativos (neg) Cuando la partícula que se utiliza para fijar los anticuerpos es un eritrocito, la técnica se denomina hemaglutinación reversa (Figura 7). Esta técnica se utiliza principalmente para detectar antígeno de superficie del virus de Hepatitis B (HBAgs) en suero de pacientes. La identificación serológica de bacterias a partir de colonias recuperadas sobre medios de cultivo sólidos se realiza mediante pruebas de aglutinación directa con antisueros comerciales (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella, Shigella) o mediante pruebas de coaglutinación (Estreptococos betahemolíticos). Estas pruebas permiten determinar el serotipo de la bacteria estudiada y es de suma importancia en clínica y en epidemiología Fig. 7: Reacción de hemaglutinación reversa Reacciones que utilizan anticuerpos marcados En ciertos casos, la unión entre un antígeno y un anticuerpo puede ponerse de manifiesto por el uso de un anticuerpo específico marcado con fluoresceína (inmunofluorescencia directa o IFD) o utilizando una antiinmunoglobulina marcada con fluoresceína (inmunofluorescencia indirecta o IFI). La marcación también puede realizarse con peroxidasa (reacción de inmunoperoxidasa), isótopos radiactivos (Radioinmunoensayo o RIA) o fosfatasa alcalina (Enzymelinked immunosorbent assay o ELISA también denominada enzimoinmunoensayo o EIA). Estas prue- Fig. 8: Esquema de las técnicas de inmunofluorescencia directa (A) e indirecta (B). 4

5 bas pueden utilizarse para la detección de antígenos (directas) o para la detección de anticuerpos (indirectas). a) Inmunofluorescencia directa: La muestra del paciente se fija a un portaobjetos y se agrega una solución de anticuerpos específicos marcados con fluoresceína. Luego de una incubación, se lava para eliminar restos de anticuerpos no reaccionantes y se observa con microscopio de luz UV. La presencia de elementos fluorescentes indica reacción positiva (Figura 8). Se aplica especialmente en el diagnóstico de sífilis, infecciones por virus respiratorios, uretritis y endocervicitis por Chlamydia trachomatis, etc. Fig. 9: Esquema del desarrollo de una técnica de E.L.I.S.A. para la detección de anticuerpos específicos contra un antígeno determinado b) Inmunofluorescencia indirecta: Se utilizan portaobjetos con el antígeno contra el cual se desea estudiar la presencia de anticuerpos. Se agrega el suero del paciente, se incuba y se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes. Finalmente se agrega una inmunoglobulina anti inmunoglobulinas totales, anti IgG o anti IgM y luego se observa al microscopio de luz UV. La presencia de elementos fluorescentes indica reacción positiva (Figura 8). Esta técnica puede aplicarse para la detección de anticuerpos del tipo IgG o IgM para diagnosticar un gran número de enfermedades infecciosas como ser Sífilis, Herpes, Listeriosis, Chagas, Toxoplasmosis, infecciones por Mycoplasmas, Chlamydias y Rickettsias, etc. Existe una prueba, en la cual se absorbe el suero del paciente con una cepa no patógena de Treponema pallidum para eliminar las reacciones cruzadas y luego se realiza, con ese suero libre de anticuerpos inespecíficos, una reacción de IFI. Esta técnica se denomina de anticuerpos fluorescentes absorbidos (FTAabs) y se aplica para confirmar los resultados positivos de la prueba de V.D.R.L. a) E.L.I.S.A. directo: permite detectar antígenos presentes en una muestra clínica. La muestra se coloca sobre un soporte sólido (papel, policubetas, esferas de vidrio, etc) que contiene fijados anticuerpos específicos contra el antígeno que queremos detectar. Luego de una incubación se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes y se agrega un anticuerpo marcado con una enzima, específico contra el antígeno en estudio. Luego de incubar, se lava y agrega un sustrato cromogénico para la enzima utilizada. La presencia de color indica una prueba positiva. Esta prueba tiene múltiples aplicaciones, siendo algunas de las más corrientes la detección de antígenos de Chlamydia trachomatis en muestra urogenitales, de Rotavirus en materia fecal, de Listeria en alimentos, etc. Esta prueba permite determinar además la concentración de diversas proteínas y hormonas en el suero del paciente por lo que se utiliza para cuantificar IgE, TSH, T3, T4, marcadores tumorales, etc. b) E.L.I.S.A. indirecto: permite detectar anticuerpos contra la mayoría de los agentes infecciosos conocidos, ya sean del tipo IgG o IgM (Figura 9). Se coloca el suero del paciente sobre un soporte sólido conteniendo el antígeno del microorganismo en estudio, se incuba, se lava y agrega una antigammaglobulina humana marcada con una enzima. Esta Ig puede ser anti inmunoglobulinas totales, anti IgG o anti IgM. Luego de una incubación, se lava y agrega el sustrato cromogénico para la enzima. La presencia de color indica una prueba 5

6 Fig. 10: Imagen de una policubeta para determinación cuantitativa de anticuerpos mediante técnica de E.L.I.S.A. positiva o sea presencia de anticuerpos en el paciente. Si esta prueba se realiza sobre diluciones seriadas del suero del paciente, podrá obtenerse el título de anticuerpos y poder seguir el curso de una infección (Figura 10). Entre las aplicaciones más corrientes están la detección de anticuerpos contra: H.I.V., Chlamydias, Mycoplasmas, Herpesvirus, Virus Dengue, Virus de la Rubéola, antígenos del virus de Hepatitis B, etc. Técnica de inmunoblotting Esta técnica, también de nominada Western-blot, se utiliza para detectar anticuerpos contra fracciones antigénicas proteicas específicas de un microorganismo. Si bien puede aplicarse en diferentes enfermedades infecciosas, el más frecuente es su uso para confirmar el diagnóstico de infección por Virus de la Inmunodeficiencia humana, ya que permite identificar contra qué antígeno del virus están dirigidos los anticuerpos presentes en el paciente. Básicamente, consiste en tiras de acetato de celulosa sobre la cual se ha realizado una electroforesis de proteínas virales. Sobre estas tiras se coloca el suero del paciente y luego de lavar se agrega una antiinmunoglobulina marcada con peroxidasa. Se incuba nuevamente, se lava y se agrega un sustrato cromogénico para la enzima peroxidasa. La presencia de anticuerpos se manifiesta por la aparición de color en el sitio de cada banda antigénica. (Figura 11) Estructura del HIV Tiras para Western-Blot Bandas asociadas al HIV gag p17, p24, p55 (Core) pol p31 (Endonucleasa), p51, p65 (Transcriptasa reversa) env gp41, gp120, gp160 A: control positivo fuerte B: control positivo débil C: control negativo D: muestra positiva Fig. 11: Técnica de Western-blot para confirmar el diagnóstico de infección por HIV. Pruebas de inhibición También podemos detectar anticuerpos basándonos en su capacidad para inhibir alguna actividad biológica de los microorganismos. Por ejemplo, la prueba de antiestreptoli- 6

7 sina O para el diagnóstico de secuelas postestreptocócicas en la que la toxina es neutralizada por los anticuerpos, impidiendo que destruya los hematíes. Ciertos virus poseen la capacidad de inducir cambios en la morfología de las células en un cultivo celular (efecto citopático). La presencia de anticuerpos en el paciente puede detectarse por inhibición del efecto citopático cuando se enfrenta una suspensión del virus, el suero del paciente y las células en cultivo. Algunos virus poseen la capacidad de aglutinar glóbulos rojos por acción de proteínas de su envoltura (hemaglutininas). Pueden detectarse anticuerpos en un paciente por inhibición de la hemaglutinación cuando se enfrenta el suero de dicho paciente, una suspensión del virus y glóbulos rojos. Tabla I: Utilidad de las diferentes pruebas inmunológicas en patologías más prevalentes Microorganismo Patología Técnica utilizada Objetivo Aspergillus fumigatus Aspergilosis pulmonar IDD Detectar Ac Brucella abortus Brucelosis Aglutinación directa Titular Ac Cándida albicans Candidemia IDD Detectar Ac Chlamydia trachomatis Uretritis, endocervicitis IFD, EIA directo, IFI, EIA IgG, EIA IgM Detectar Ag Titular Ac Chlamydia pneumoniae Neumonía Atípica IFI IgG, IFI IgM Titular Ac Chlamydia psittaci Psitacosis IFI IgG, IFI IgM Titular AC Citomegalovirus Hepatitis EIA IgG, EIA IgM Detectar Ac Clostridium botulinum Botulismo IDR Detectar toxina Escherichia coli Diarrea Aglutinación directa Serotipificación H.I.V SIDA EIA Western-blot Detectar Ac Confirmar EIA Haemophilus influenzae b Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag Helicobacter pylori Úlcera gástrica EIA IgG, EIA IgA Detectar Ac Histoplasma capsullatum Histoplasmosis IDD Detectar Ac Listeria monocytogenes Listeriosis Aglutinación directa, IFI Detectar Ac Mycoplasma pneumoniae Neumonía atípica IFI IgG, IFI IgM Titular Ac Neisseria meningitidis Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag Paracoccidioides brasiliensis Paracoccidioidomicosis IDD Detectar Ac Rotavirus Diarrea AL, EIA Detectar Ag Salmonella enterica Gastroenteritis Aglutinación directa Serotipificación Salmonella Typhi Fiebre tifoidea Aglutinación directa Detectar Ac Shigella spp Disentería Aglutinación directa Serotipificación Streptococcus agalactiae Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag Streptococcus pneumoniae Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag Streptococcus pyogenes Faringitis Coaglutinación Aglutinación directa Detectar Ag Serotipificación Toxocara canis Larva migrans visceral EIA Titular Ac Toxoplasma gondii Toxoplasmosis HAI, AD, IFI Titular Ac Treponema pallidum Sífilis IFD VDRL, FTAabs Detectar Ag Detectar/titular AC Tripanosoma cruzi Enfermedad de Chagas HAI, AD, IFI Titular Ac Virus Dengue Dengue EIA, IHA Detectar Ac Virus Hepatitis A Hepatitis A EIA IgG, EIA IgM Detectar Ac Virus hepatitis B Hepatitis EIA, CIEF, HAR EIA IgG, EIA IgM Detectar Ag HBs Detectar Ac Virus Rubéola Rubéola EIA IgG, EIA IgM, IHA Detectar/Titular Ac Virus sincitial respiratorio Neumonía IFD IFI, EIA Detectar Ag Detectar Ac Abreviaturas: EIA: enzimoinmunoanálisis, IFD: inmunofluorescencia directa, IFI, inmunofluorescencia indirecta, IHA: inhibición de la Hemaglutinación, HAI: Hemaglutinación indirecta, AD: aglutinación directa, HAR: Hemaglutinación reversa, IDD: inmunodifusión doble, CIEF: contrainmunoelectroforesis. FTAabs: inmunofluorescencia absorbida, AL: aglutinación de látex 7

8 En general, los resultados de una reacción serológica no deben ser interpretados en forma aislada, sino en relación a un contexto clínico y epidemiológico. EVALUACIÓN DE LAS PRUEBAS INMUNOLÓGICAS A la hora de elegir una prueba inmunoserológica y evaluar sus resultados debe tenerse en cuenta la especificidad y sensibilidad de la misma. Decimos que una prueba es más sensible cuando menor sea la cantidad de antígeno o anticuerpo detecte, es decir, cuando más precoz sea el diagnóstico que nos permite realizar. Por otra parte, una prueba serológica es más específica cuando menor capacidad posea para dar reacciones cruzadas (reacciones inespecíficas) o sea resultados positivos frente a antígenos o anticuerpos no buscados. Si realizamos una tabla imaginaria donde colocamos los resultados obtenidos para una determinada prueba serológica frente a un determinado grupo de pacientes tendremos las siguientes posibilidades: Resultados Pacientes Sanos Enfermos Positivos FP PV FP+PV Negativos VN FN VN+FN FP+VN PV+FN Total En la cual: Positivo verdadero (PV): resultado positivo en paciente enfermo. Falso positivo (FP): resultado positivo en un paciente sano. Verdadero negativo (VN): resultado negativo en un paciente sano. Falso negativo (FN): resultado negativo en un paciente enfermo. Sensibilidad es = PV x 100 PV+FN Observando las fórmulas podemos decir que: Especificidad es = PV x 100 FP+PV Una prueba serológica es más sensible cuando menos resultados falsos negativos arroje. Una prueba serológica es más específica cuando menos resultados falsos positivos arroje. A continuación daremos un ejemplo: se desea evaluar la calidad de una nueva técnica de ELISA para el diagnóstico de infección por Chlamydia trachomatis, en una población de 100 pacientes en los cuales se estudió la mediante cultivo en células HeLa (Método estándar o de referencia). Los resultados son los siguientes: Cultivo de Chlamydia trachomatis Negativo Positivo Test de Positivo ELISA Negativo PV = 56; FP = 1; VN = 40 y FN = 3 8

9 Sensibilidad = 56x = 95% Especificidad = 56x100 = 98% 1+56 EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD DE UN PACIENTE La evaluación inicial del paciente debe incluir una historia clínica completa con todos los antecedentes del paciente y de sus familiares y un examen físico detallado. Se puede sospechar una inmunodeficiencia por la presencia de infecciones crónicas, infecciones recurrentes, agentes infecciosos raros, curación incompleta o respuesta incompleta al tratamiento. Se sospecha un defecto de los linfocitos B ante infecciones a repetición como neumonía, sepsis y meningitis. Sugieren anormalidades de los leucocitos las infecciones primarias de la piel y osteomielitis crónica por Klebsiella o Serratia. Una evaluación inicial incluye: dosaje de concentraciones totales de IgG, M y A, recuento leucocitario total y diferencial (hemograma), pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada, estudio funcional de los neutrófilos, medición de la cantidad de complemento hemolítico (CH 50 ) y C3 y C4. Empezaremos por una evaluación del estado de las barreras físicas (presencia de quemaduras, heridas, vías endovenosas que alteren la continuidad del epitelio, etc.). Cuando existe una falla en este nivel es común encontrar infecciones recurrentes, abscesos cutáneos, neumonitis y septicemia. En las décadas del 60 y 70 eran frecuentemente debidas a S. aureus, al mejorar los tratamientos antibióticos este lugar fue ocupado por Pseudomonas aeruginosa y Enterobacterias en la década del 80 y actualmente se encuentran principalmente infecciones por Staphylococcus coagulasa negativos, Aspergillus spp y Candida albicans. Estas manifestaciones también se presentan cuando la falla se encuentra en los leucocitos polimorfonucleares y el sistema monocito macrófago. Agregaremos a la evaluación un hemograma para obtener la cuenta leucocitaria total y diferencial y estudios funcionales de opsonización (dosando C3 y anticuerpos), y capacidad de migración o respuesta a la quimiotaxis (técnica in vivo de la ventana cutánea de Rebuck), fagocitosis (viendo la ingestión de Candida spp, polisacárido de E. coli recubierto de aceite de parafina con colorante rojo), lisis (evaluando la destrucción de bacterias, prueba del NBT, quimioluminiscencia), y evaluación de los sistemas enzimáticos con coloraciones específicas y estudio de poblaciones con anticuerpos monoclonales. En casos de deficiencias del complemento, por defectos de producción o exceso de catabolismo, se observan infecciones recidivantes por bacterias piógenas (cocos Gram positivos) cuando el C3 se encuentra disminuido, o principalmente por gonococos y meningococos cuando la deficiencia es de C5 u otros factores del complemento. El nivel del complemento en el suero se puede determinar verificando la actividad hemolítica total del mismo al incubarlo con eritrocitos de carnero sensibilizados con anticuerpos de conejo anti-eritrocito de carnero. También se puede evaluar cada una de sus componentes por inmunodifusión radial (C3 y C4), nefelometría, RIA (properdina) y prueba de hemólisis (se colocan en exceso todas las proteínas del complemento, a excepción de la que se quiere dosificar). 9

10 Una disminución de C3 y C4 indicarían una activación del sistema complemento por la vía clásica mientras que una disminución de los niveles séricos de C3 y valores conservados de C4 indicarían la activación por la vía alterna. Por último, en el caso de deficiencias de la inmunidad humoral encontraremos principalmente infecciones del tracto respiratorio superior y neumonías por gérmenes como: S. pneumoniae (diplococo Gram positivo), Moraxella catharralis (cocos Gram negativos) y Haemophilus influenzae (bacilo Gram negativo). Los linfocitos B pueden estudiarse con: hemograma (recuento total de linfocitos) y estudio de subpoblaciones con anticuerpos monoclonales(en estudios de leucemias). Para estudiar los anticuerpos podemos realizar un dosaje de: proteínas totales y gama globulinas; proteinograma electroforético ( evaluación inicial para detectar deficiencias, o diferenciar aumentos policlonales de monoclonales), dosaje de inmunoglobulinas G, M y A totales por inmunodifusión radial y de Ig E por RIA, inmunoelectroforesis para estudio de componentes monoclonales o detección de proteína de Bence Jones en orina, etc. La evaluación de los distintos componentes de la respuesta inmune inespecífica puede realizarse con numerosas pruebas de laboratorio. También se dispone de estudios que nos permiten determinar la producción de anticuerpos contra un microorganismo en particular o buscar antígenos en las distintas muestras remitidas al laboratorio. La actividad biológica global del complemento en suero se puede medir por su capacidad para producir la lisis de hematíes sensibilizados con anticuerpos, mediante la activación de la vía clásica. Las actividades de los componentes individuales del sistema del complemento se pueden evaluar por su capacidad para ser tituladas en un sistema lítico dependiente del complemento que carece del componente sometido a prueba (se colocan en exceso los componentes del complemento menos el estudiado y un sistema de detección como ser glóbulos rojos recubiertos de anticuerpos) el grado de hemólisis dependerá de la concentración del componente en estudio y de su actividad, o medir su concentración usando reacciones de precipitación en gel (inmunodifusión radial) en esta técnica no se diferencian fracciones activas de inactivas. Los neutrófilos se evalúan primeramente con el hemograma, con el que se obtiene su concentración absoluta y relativa, y luego funcionalmente estudiando el proceso de fagocitosis. Análisis para las deficiencias del funcionalismo de los neutrófilos: Los defectos de la quimiotaxis, fagocitosis y muerte bacteriana determinan un aumento de la susceptibilidad del huésped a la infección. Probablemente, la enfermedad granulomatosa crónica representa el ejemplo mejor estudiado y mejor definido de enfermedad relacionada con una función defectuosa de los neutrófilos. Los PMN de pacientes con esta enfermedad poseen actividad fagocítica normal, pero muestran un defecto en el proceso de muerte de las bacterias. Los microorganismos implicados generalmente son catalasa positivos. El defecto reside en un metabolismo anormal del oxígeno, con reducción del consumo de oxígeno, reducción de la generación de peróxido de hidrógeno y superóxido, y ausencia de la estimulación por el shunt de la hexosa monofosfato. La pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno presente en la vacuola fagocítica del PMN queda inactivada rápidamente por los organismos catalasa positivos. La detección de esta anomalía se favorece empleando la prueba de reducción del colorante nitroazul de tetrazolio. El nitroazul de tetrazolio oxidado es incoloro, pero durante la fagocitosis se reduce y precipita en el citoplasma como azul de formazán. El fracaso para es- 10

11 timular el metabolismo oxidativo, como en el caso de la enfermedad granulomatosa crónica, impide la reducción del nitroazul de tetrazolio. En una prueba simple los PMN, látex y nitroazul de tetrazolio se colocan en forma de gota en un portaobjetos de vidrio y la reducción a formazán se verifica bajo microscopio. La normalidad de los resultados debe confirmarse siempre por un método cuantitativo más preciso. Una prueba similar consiste en la medición de la luz emitida durante la fagocitosis (quimioluminiscencia). La fagocitosis estimula el metabolismo oxidativo de los granulocitos a través de una descarga de luz (es decir, quimioluminiscencia), la cual se mide con un espectrómetro de centelleo líquido. Los defectos de la activación oxidativa disminuyen la cantidad de quimioluminiscencia. Se han identificado otros defectos con alteración de la actividad bactericida de los neutrófilos. Las deficiencias de mieloperoxidasa y glucosa 6 fosfato deshidrogenasa también conllevan un proceso de muerte bacteriana intracelular defectuoso. Los defectos adquiridos del proceso de muerte bacteriana intracelular pueden aparecer en ciertos pacientes tratados con fenilbutazona o corticosteroides o irradiados, así como consecuencia de una infección vírica. Antes de que acontezca la lisis bacteriana es necesario que haya tenido lugar la fagocitosis. La fagocitosis granulocítica puede medirse por la ingestión del polisacárido de Escherichia coli recubierto por gotas de aceite de parafina que contengan colorante rojo o de aceite. La presencia del colorante en el interior de los neutrófilos puede determinarse por espectrofotometría. Además de las pruebas in vitro de estimulación del metabolismo oxidativo y fagocitosis neutrófila, es posible medir el proceso de muerte bacteriana con una prueba bactericida. Los granulocitos aislados se incuban con suero (como fuente de opsoninas) y bacterias. A diferentes intervalos de tiempo, se extraen muestras de neutrófilos para medir la población bacteriana viable total, la población extracelular y los microorganismos asociados con las células en la mezcla de reacción. Aunque laboriosos, estos procedimientos pueden medir la actividad bactericida de los granulocitos. Las técnicas de citometría de flujo con anticuerpos monoclonales también se han mostrado útiles para la evaluación de las alteraciones de la fagocitosis. La ausencia de una o varias glicoproteínas adhesivas a la superficie de los granulocitos, identificadas por los anticuerpos monoclonales MAC 1, LFA 1 o p150,95, se asocia a infecciones recurrentes de los tejidos blandos y alteración de la curación de heridas, granulocitosis y función leucocitaria anómala, inclusive quimiotaxis, adherencia y fagocitosis de partículas recubiertas por complemento. Recuento de eosinófilos: los valores normales varían de 200 a 500 eosinófilos por milímetro cúbico de sangre. En las manifestaciones alérgicas del árbol respiratorio superior su concentración en moco nasal y esputo aumenta considerablemente, y su determinación ayuda a definir como de origen alérgico muchos casos de rinitis, bronquitis y asma. En cuanto a la inmunidad específica podemos estudiar las inmunoglobulinas y las poblaciones linfocitarias. Determinaciones útiles para la cuantificación de γ-globulinas séricas totales e inmunoglobulinas individuales. La electroforesis de las proteínas séricas continúa siendo una prueba inicial útil para valorar las concentraciones totales de γ-globulinas, así como para detectar aumentos monoclonales o policlonales. La electroforesis de zona se emplea para separar componentes en el suero, orina, líquido cefalorraquídeo y otros líquidos orgánicos. En la mayoría de los patro- 11

12 nes electroforéticos de proteínas séricas se observan cinco bandas. Dichas bandas incluyen albúmina y globulinas α 1, α 2, β y γ. Se pueden observar los siguientes patrones: 1) banda o zona normal de γ - globulina total, 0.6 a 1.2 g/dl. 2) Hipogamaglobulinemia: disminución o ausencia de banda Ig. 3) Hipergamaglobulinemia: intensificación y amplificación de la banda, lo que significa que dos o más de las inmunoglobulinas séricas principales están elevadas (Ig G, Ig A o Ig M); ello acontece en muchas enfermedades inflamatorias crónicas, tales como el lupus eritematoso sistémico y la hepatitis crónica activa. Este patrón no tiene validez diagnóstica, pero es útil para seguir el curso de muchas enfermedades. 4) Un componente M o pico monoclonal, cuyo isotipo debe ser identificado. Inmunoelectroforesis: es una técnica que combina los principios de la electroforesis de zona con los de las reacciones antígeno anticuerpo. Se efectúa en gel y en dos secuencias. En primer lugar, se separa la proteína por electroforesis de zona en un medio de soporte como agar o agarosa. Seguidamente los grupos de proteínas separados se hacen reaccionar con antisuero específico para obtener arcos de precipitación. Un corte largo y estrecho, paralelo a la dirección de la separación electroforética, se llena con antisuero; los antígenos y el anticuerpo difunden uno a través de los otros, y aparecen las líneas de precipitación en forma de arcos elípticos. La inmunoelectroforesis se emplea para separar e identificar antígenos de una mezcla compleja. La inmunoelectroforesis sérica que emplea antisueros anti IgA, anti IgM, anti IgG, anti-κ y anti-λ pueden determinar con precisión virtualmente todos los componentes M. La detección e identificación de la proteína urinaria homogénea de cadena ligera (proteínas de Bence Jones) puede llevarse a cabo mediante una combinación de electroforesis en acetato de celulosa e inmunoelectroforesis de orina concentrada. Inmunodifusión radial: permite determinar con precisión la concentración tanto de antígeno como de anticuerpo de una solución. En dos tipos de circunstancias, las pruebas de inmunodifusión radial pueden conducir a concentraciones equívocas de inmunoglobulinas. Si el suero contiene IgM monomérica de bajo peso molecular (7S), tal como puede ocurrir en la macroglobulinemia de Waldenström, se pueden hallar concentraciones incorrectamente elevadas de IgM, ya que la IgM 19S usada como estándar difunde con mayor lentitud que a igual concentración de IgM 7S. Como resultado la Ig M 7S forma un anillo de precipitación mayor que la misma cantidad de IgM 19S. La situación opuesta acontece cuando en el suero hay altas concentraciones de factor reumatoide IgG 7S. La interacción del factor reumatoide con la región Fc de la IgG produce complejos de IgG que difunden más lentamente que la IgG nativa, resultando un anillo menor de precipitación y, por ende, una subestimación de las concentraciones totales de IgG. El dosaje de Ig E total requiere de métodos que permitan detectar cantidades del orden 0,004 por 100 ml, por ello se recurre al RIA. Su elevación moderada refuerza la presunción diagnóstica de un proceso de tipo alérgico, los títulos altos de IgE con o sin eosinofilia sugieren la presencia de parasitismo. La medida cuantitativa en suero para IgE específicos para el alergeno requiere métodos especiales para detectar las cantidades extremadamente pequeñas (picogramos por mililitro) que se encuentran en los pacientes. La técnica estándar es la prueba del radioalergosorbente (RAST). Éste es un sistema de dos fases (sólido/líquido) que utiliza un alergeno insolubilizado que se incuba primero con el suero del paciente y después con anti IgE humana marcada con isótopos radioactivos para detectar los anticuerpos específicos para el alergeno del isotipo IgE. Las desventajas de estos métodos in vitro son biológicas y técnicas. La cantidad de anticuerpo IgE sérico no es necesariamente un reflejo directo del anticuerpo con relevancia bio- 12

13 lógica unido a células cebadas. El resultado de la prueba es falso positivo en pacientes con un nivel total alto de IgE, debido a unión inespecífica, y es falsamente bajo en pacientes desensibilizados con niveles altos de anticuerpo IgG. Estudios cuantitativos de los linfocitos Tanto las células B como las células T presentan características particulares de antígenos de superficie y receptores, y cada una de estas clases celulares es responsable de fases específicas de la respuesta inmune. Bajo microscopía óptica y electrónica los linfocitos B y T son morfológicamente idénticos, aunque difieren en ciertas propiedades físicas, tales como densidad y adherencia a ciertas superficies (nylon, lana). Los linfocitos humanos de la sangre periférica pueden ser asignados a las categorías de B, T o célula nula sobre la base de ciertas características de la superficie celular. La inclusión en una u otra categoría se efectúa mediante pruebas con células mononucleares de sangre periférica aisladas por centrifugación en soluciones Ficoll Hypaque, o con sangre total si se emplea la citometría de flujo láser. Dentro de las células mononucleadas, casi todo son linfocitos, y de ellos hasta un 80% se identifican como células T con base en su capacidad para formar rosetas con eritrocitos de carnero, o con base en la presencia de antígenos de superficie específicos de la célula T identificados por anticuerpos monoclonales. Del 10 a 15% son células B, identificadas por presentar moléculas de inmunoglobulinas incorporadas en su superficie que pueden detectarse con facilidad con antisuero marcado con fluoresceína contra las inmunoglobulinas humanas, o mediante antígenos de superficie específicos para la célula B. La célula B posee un receptor de superficie para el componente C3 del complemento y un receptor para la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulinas. Los linfocitos no identificados como células T o B se llaman células nulas. Esta población engloba a las células asesinas naturales, una población celular de gran importancia para la defensa del huésped contra las células malignas. Estudios funcionales in vitro Activación linfocitaria: se separan los linfocitos y se incuban con mitógenos (PHA, Con A, fitolaca), esto provoca la división celular en linfocitos funcionalmente normales. Se mide el grado de división a través de la síntesis de ADN a partir de precursores radiomarcados (timidina tritiada) o por evaluación morfológica y estableciendo el porcentaje de linfoblastos. Este procedimiento evalúa la sumatoria de los mecanismos involucrados en: reconocimiento del antígeno, interacción linfocito macrófago y mediadores solubles. Mide la capacidad funcional de los linfocitos T o B para proliferar después de una provocación antigénica. Se puede realizar con antígenos específicos como PPD, toxoide tetánico, suspensiones de cándidas, etc. Cultivo mixto de linfocitos (CML): Constituye una prueba especial de estimulación antigénica en la cual los linfocitos responden contra antígenos de histocompatibilidad de otra población linfocitaria. Las células estimulantes se tratan con radiación o mitomicina para que no puedan dividirse. Linfólisis mediada por células (LMC): Sirve para detectar linfocitos T citotóxicos. El primer paso es igual al de las pruebas anteriores, luego los linfocitos estimulados se enfrentan con 13

14 células blanco marcadas con 51 Cr. El grado de liberación del 51 Cr es proporcional a la lisis de células blanco, y este a su vez a la cantidad de linfocitos T citotóxicos. Reacciones inmunohistológicas: la presencia de antígenos o anticuerpos unidos a un tejido se puede estudiar mediante la tinción de cortes histológicos con anticuerpos específicos marcados con un colorante fluorescente (inmunofluorescencia) o con enzimas con sustratos cromogénicos (inmunoperoxidasa). Evaluación in vivo de la inmunidad celular La inmunidad celular se evalúa in vivo mediante pruebas de intradermorreacción. Para ello se emplean antígenos obtenidos de diversos microorganismo los cuales se aplican en forma intradérmica y se lee la reacción inmediata y la reacción retardada. La presencia de un eritema (zona enrojecida) dentro de las 24 hs alrededor del sitio de inoculación indica una respuesta alérgica (humoral) a alguno de los componentes del antígeno inoculado mientras que una pápula (induración) luego de las 48hs en el sitio de inoculación indica una respuesta celular debido a un contacto previo con el antígeno, ya sea por infección o por vacunación. Son ejemplos de estas reacciones las de Mantoux (tuberculosis), la de Mitsuda (lepra) y la melitina (brucelosis). Los antígenos utilizados y la forma de interpretación de estas pruebas se tratarán con cada tema en particular 14