Instrucciones de Uso. Sistemas Dynal AllSet + y CombiSet + SSP

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1 Instrucciones de Uso Sistemas Dynal AllSet + y CombiSet + SSP 0088

2 ÍNDICE Página PROPÓSITO DE USO.. 3 RESUMEN Y EXPLICACIÓN PRINCIPIOS DE LA METODOLOGÍA REACTIVOS Suministrados con el kit de tipaje Conservación ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 5 EQUIPO NECESARIO NO SUMINISTRADO POR DYNAL. 5 PROCEDIMIENTO Recogida y Preparación de Muestras Preparación de la Amplificación por PCR Amplificación por PCR PCR mediante electroforesis en gel de agarosa... 9 LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO DATOS ESPERADOS.. 10 Control de Calidad Test de Control Interno Interpretación de los Resultados Interpretación utilizando Dynal SSPTool.. 11 RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS BIBLIOGRAFÍA GARANTÍA.. 14 MARCAS REGISTRADAS UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO PATENTES UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO PARA CONTACTAR CON DYNAL...15 Página 2 de 15

3 Sólo para Diagnóstico In Vitro PROPÓSITO DE USO Determinación del tipo de Alelo HLA (Human Leukocyte Antigen, Antígeno Leucocitario Humano) de Clase I o Clase II mediante ADN. RESOLUCIÓN DE LOS TIPOS Kits de Baja Resolución : El tipaje de los alelos se determinará a nivel genérico, o nivel de grupo alélico, lo que en general concuerda con las especificidades definidas serológicamente. Kits de Alta Resolución : O kits de subtipaje, proporcionan alta resolución o genotipado a nivel alélico. RESUMEN Y EXPLICACIÓN Casi todas las técnicas de tipaje de tejidos basadas en el ADN utilizan la técnica 1 de PCR para amplificar el locus HLA investigado. En la mayoría de estos métodos de tipaje de tejidos basados en el ADN, la PCR se utiliza como un paso de preamplificación previo al tipaje para incrementar la cantidad de ADN molde. El procedimiento de tipaje delete HLA requiere una postamplificación para discriminar los distintos alelos. Al contrario que otros métodos basados en la PCR, la Metodología 2,3,4,5 SSP utilizada por Dynal Biotech Ltd AllSet + y CombiSet + SSP discrimina los diferentes alelos durante el proceso de PCR. Esto reduce la duración del proceso de postamplificación a una simple determinación por electroforesis en gel. PRINCIPIOS DE LA METODOLOGÍA El método Dynal SSP es una técnica basada en la PCR, que utiliza Cebadores Específicos de Secuencia (Sequence Specific Primers, SSP), para un tipado de tejidos basada en el ADN. Los productos Dynal SSP contienen un conjunto de mezclas de cebadores donde cada mezcla delete contiene uno o más pares de cebadores específicos, es decir, el cebador específico del alelo y/o grupo de alelos junto con un par delete control que hibrida con secuencias no alélicas de las muestras. El par cebador control actúa como un control interno de la PCR para verificar la eficiencia de las amplificaciones de la PCR. Dynal SSP se basa en el principio por el cual un cebador que hibrida perfectamente resultará más eficiente en la reacción de la PCR que otro que hibride con uno o varios errores en su extremo 3. La especificidad del sistema de tipaje es parte del paso de amplificación de la PCR, y el proceso de postamplificación de las muestras queda reducido al mínimo. La determinación de los alelos consiste básicamente en valorar si la amplificación ha tenido o no lugar, es decir, en la visualización y detección de la amplificación por electroforesis en gel de agarosa. La técnica PCR-SSP proporciona un alto grado de resolución porque cada par iniciador identifica dos sitios ligados, polimórficos y situados en cis. El método aporta alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. Página 3 de 15

4 REACTIVOS Reactivos suministrados en todos los Kits Dynal AllSet + SSP o CombiSet + SSP Elementos 1. Placas de PCR con Mezclas de Iniciador SSP pre-alicuoteado y liofolizado Descripción Cada pocillo de la placa de PCR contiene una solución de cebador SSP liofilizado, compuesta por cebadores específicos de alelo y/o grupo, además de un par de cebadores control que hibrida perfectamente con secuencias no alélicas. El par iniciador control amplifica un fragmento de un gen conservado presente en todas las muestras. 2. Tapas de PCR Tapas para sellar las placas de PCR 3. Master Mix (el nº de viales incluido en el kit depende del nº de reacciones por test ver tabla) Nº de reacciones de PCR por test Nº de viales de Master Mix incluidos en el (todas de 1,8 ml) Concentración 1 x lista para su uso. La Master Mix se ha optimizado para ser utilizada con AmpliTaq DNA Polymerase (Roche Molecular Systems, Inc.) Información sobre formulación disponible en hla@dynalbiotech.com 4. Instrucciones de Uso del Producto / Folleto de Información Específica sobre el Lote del Producto 5. Tabla de Interpretación Instrucciones de Uso del Producto / Folleto de Información Específica sobre el Lote del Producto (ISLP) Tabla para determinar qué alelo o grupo de alelos identifican las distintas mezclas. Conservación 1. Las placas de PCR y el Master Mix deben conservarse entre 2-8 C. 2. No congelar los reactivos 3. Si se conservan correctamente, estos reactivos y mezclas de cebadores serán estables hasta la fecha de caducidad indicada en el Folleto de Información Específica sobre el Lote del Producto. Página 4 de 15

5 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para Diagnóstico In Vitro 2. Todos los trabajos realizado con Dynal AllSet + y CombiSet + SSP deben efectuarse conforme a las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio y ajustándose a las normas locales, como a los estándar de la EFI (European Federation for Immunogenetics, Federación Europea de Inmunogenética) o las normas CPA (Clinical Pathology Accreditation). 3. Advertencia: Riesgo Biológico. Maneje todas las muestras como potenciales transmisoras de enfermedades. Cualquier manipulación debe efectuarse con guantes y protección adecuada. 4. Advertencia: Riesgo Biológico. En la preparación de las muestras deben utilizarse tubos con tapa de rosca para evitar que la muestra se salga y prevenir cualquier posible contaminación. 5. Advertencia: Riesgo Biológico: Todas las muestras deben manejarse como potencialmente infecciosas utilizando procedimientos de seguridad como los indicados en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6 (Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos) y en el Documento M29-T 7 de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico). Limpie y desinfecte cuidadosamente todas las superficies de trabajo con lejía al 1% (NaClO). Esterilice en autoclave antes de su eliminación todo equipo o material que haya estado en contacto con muestras clínicas. 6. Advertencia: Riesgo Biológico: El bromuro de etidio utilizado para teñir ADN es potencialmente carcinógeno. Lleve siempre guantes de nitrilo cuando manipule geles teñidos y bromuro de etidio. 7. Precaución: Lleve protección ocular anti-uv y no mire directamente a la fuente de luz UV con los ojos desprotegidos al observar o fotografiar los geles. 8. Precaución: Las pipetas utilizadas para las manipulaciones post-pcr no deben usarse en la preparación del material pre-pcr. 9. Precaución: Contaminación. Evite que se produzca una contaminación microbiana al tomar alícuotas de los frascos de reactivos. Lleve siempre guantes para evitar el riesgo de contaminación de la muestra. Se recomienda utilizar pipetas desechables estériles y puntas de pipeta con filtro. No utilice reactivos con turbidez o contaminación bacteriana evidentes. 10. Precaución: Eliminación. Elimine los reactivos no utilizados y los desechos de acuerdo con las regulaciones nacionales, federales, estatales y locales. 11. Existe una Hoja de Información sobre Seguridad del Material (MSDS, Material Safety Data Sheet) que puede descargar en o solicitarla a su suministrador local de productos Dynal. (Para ponerse en contacto con Dynal, dirigirse a la última página de este prospecto) EQUIPO NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO POR DYNAL BIOTECH: 1. Pipetas manuales (p.ej. Eppendorf, Gilson). 2. Puntas de pipeta con filtro desechables para las pipetas. 3. Mezclador Vortex. 4. Microcentrífuga. 5. Rejilla de almacenaje para placas de microtubos de PCR. 6. Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9600 o 9700, o cualquier otro termociclador homologado con especificaciones equivalentes. 7. Placa calentadora / microondas para el calentamiento de las soluciones de agarosa. 8. Aparato de Electroforesis (p.ej. ABgene Electro-Fast Stretch 108 Complete, AB-0708). 9. Transiluminador UV. 10. Sistema de captación y documentación fotográfica del gel. 11. Polimerasa Recombinante Taq (Dynal recomienda AmpliTaq ). 12. Agarosa adecuada para electroforesis. 13. Bromuro de Etidio. Página 5 de 15

6 PROCEDIMIENTO NOTA: Este procedimiento debe llevarse a cabo en dos áreas del laboratorio (Amplificación Pre-PCR y Amplificación Post-PCR) como se indica en las siguientes instrucciones. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Precaución: Maneje todas las muestras como potenciales transmisoras de agentes infecciosos. a) NO SE RECOMIENDA EL USO DE SANGRE HEPARINIZADA 8 b) El ADN puede extraerse de células humanas nucleadas mediante la técnica preferida. c) Para obtener una mejor amplificación por PCR-SSP y resultados óptimos de tipado, utilice ADN altamente purificado (OD 260:280, relación ). d) La concentración final del ADN antes de la PCR-SSP debe ser de aproximadamente 50 ng/µl e) El ADN extraído debe ser diluido en dh 2 0 f) El ADN puede conservarse a una temperatura igual o inferior a -20 C durante un largo período de tiempo (> 1 año) sin que esto afecte negativamente a los resultados. El ADN conservado a +4 C durante un largo período de tiempo se degradará, dando lugar a la aparición de más artefactos, p.ej. amplificaciones no específicas. PREPARACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR (Efectuada en el área Pre-PCR) Para efectuar una determinación simple, haga la siguiente mezcla para PCR. Consulte los volúmenes necesarios en la tabla de la página siguiente (dependiendo del nº de reacciones de PCR por test) Master Mix Muestra de ADN (a 50 ng/µl) ADN Polimerasa AmpliTaq (a 5.i.u./µl ) Mezcle bien Añada 10 µl de la mezcla de PCR anterior a cada pocillo de la placa del kit Dynal AllSet + o CombiSet + SSP Ponga los tapones a los tubos de PCR y ciérrelos bien para asegurar que todos están totalmente sellados. Se puede utilizar una herramienta específica de tapado. Se pueden utilizar también hojas de sellado adhesivas compatibles con la PCR. Las muestras quedan así preparadas para la amplificación por PCR Conserve los reactivos sobrantes del kit a 2-8 C. Página 6 de 15

7 Tabla de Cálculo para las Mezclas de PCR: Reacciones PCR por test Solución MM (µl ) AND muestra (µl ) AmpliTaq (µl ) ,6 0, ,4 0, ,2 0, ,0 0, ,8 0, ,6 1, ,4 1, ,2 1, ,0 1, ,8 1, ,4 2, ,2 2, ,0 2, ,8 2, ,6 2, , ,2 3, ,0 4, ,8 4, ,6 4, ,0 9,00 NOTA: Para obtener un número impar de reacciones de la PCR por test, que no aparece en la tabla anterior, tome el siguiente número par (p.ej. si se trata de 13 reacciones de PCR por test, consulte los cálculos para 14 reacciones de PCR). Página 7 de 15

8 DISPOSICIÓN DE LA PLACA Asegúrese de que la orientación de la placa es correcta añadiendo la mezcla de iniciador en el pocillo número uno (también identificado por medio del uso de un colorante azul), con el número de lote escrito en el lateral e.g HLA-X IGNORE CUALQUIER OTRO NÚMERO DE LA PLACA PREPARACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR (Efectuada en el área Post-PCR) 1. Coloque la placa de AllSet + o CombiSet + SSP en el termociclador. Programe el termociclador según los parámetros siguientes: Paso Temperatura Tiempo Acción ( c) (sec.) Desnaturalización Desnaturalización 10 ciclos Desnaturalización Hibridación 20 ciclos Extensión Desnaturalización Hibridación Extensión Diríjase al manual del fabricante si se necesita información específica sobre el termociclador. 2. Inicie el programa. 3. Cuando se ha completado el programa, retire las muestras del termociclador. NOTA: No lleve el ADN amplificado a la zona de amplificación Pre-PCR. Página 8 de 15

9 UTILIZACIÓN DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Nota: Se recomienda utilizar el mismo tampón tanto para la confección del gel como para la electroforesis, es decir, si se utiliza tampón TBE (Trisborato-EDTA) 0,5 x en el gel, utilice también TBE 0,5 x como tampón de la electroforesis. 1. Prepare un gel de agarosa al 2% (w/v) (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) en tampón TBE 0,5 x. a) Disuelva la agarosa (2g/100 ml de tampón TBE 0,5 x) calentándola en el microondas hasta que esté totalmente disuelta. Enfríelo a 60 C. Añada bromuro de etidio hasta una concentración final del gel de 0,5 µg/ml. b) Cree un gel de 3-4 mm de espesor con pocillos de 3 mm de profundidad. Déjelo reposar al menos 15 minutos. 2. a) Transfiera el gel de agarosa a una unidad de electroforesis horizontal. El gel debe cubrirse con TBE 0,5 x hasta una altura de entre 1-2 mm. Retire el peine con cuidado Cargue todo el producto de la PCR ordenada, directa y cuidadosamente sobre el gel. 3. Corra los geles en tampón TBE 0,5 x. Corra los minigeles (un gel con menos de 1cm entre electrodos) durante 10 minutos a 15 V/cm y los geles más grandes durante 15 minutos a 10 V/cm. Para calcular el voltaje, mida la distancia (en centímetros) entre los ELECTRODOS en el baño de electroforesis (la longitud del gel NO ES IMPORTANTE). 4. Examine el gel con luz UV y conserve la documentación fotográfica. 1. El mismo tampón TBE 0,5 puede utilizarse varias veces, pero el resultado obtenido será mejor con un tampón nuevo. ATENCIÓN: El Bromuro de Etidio es un potente agente mutágeno. Utilice guantes de nitrilo y protección ocular cuando se manipulen geles o soluciones que contengan Bromuro de Etidio. Página 9 de 15

10 LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO 1. Debido a la alta sensibilidad analítica de la PCR, debe tenerse especial cuidado de preservar la pureza de los reactivos y las mezclas de amplificación. Asegúrese de que el trabajo en el laboratorio se efectúa de manera unidireccional y que el amplicón de PCR no se lleva al área de preparación de la PCR. La pureza de los reactivos se puede mantener únicamente por medio de buenas prácticas de laboratorio, y el funcionamiento del test sólo se garantiza si se cumplen estrictamente los procedimientos especificados en este prospecto. 2. Los Tests Dynal AllSet + y CombiSet + se han desarrollado utilizando sólo muestras de sangre entera no heparinizada o muestras de ADN purificado. No se ha evaluado el funcionamiento con otro tipo de muestras. 3. Las muestras de ADN proporcionan el molde para el proceso de amplificación por PCR, y su calidad en términos de pureza y concentración debe estar inscrita en el rango establecido por este procedimiento. 4. Con este producto puede utilizarse cualquier termociclador homologado cuyas especificaciones sean equivalentes a las de una Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 o Asegúrese de que todos los instrumentos y equipos estén calibrados según las recomendaciones del fabricante. DATOS ESPERADOS Control de Calidad El Control de Calidad y la actualización de los productos para tipaje tisular basados en ADN son muy importantes. Los oligonucleótidos sintetizados tienen que ser ampliamente probados frente a ADN procedentes de líneas celulares conocidos. Las soluciones de cebador tienen que probarse tanto frente a ADN positivos como negativos con secuencias altamente similares. El procedimiento de control de calidad es el siguiente: Test del cebador sintetizado frente a un conjunto de ADN procedentes de líneas celulares conocidas bien caracterizadas. Test de las soluciones de cebador específico frente a un conjunto de ADN positivos y negativos Test del equipo de SSP completo. Test del producto final. Control Positivo Interno de la PCR El par de iniciación control 9 se incluye para verificar la eficiencia de la reacción de PCR. Su presencia confirma que la falta de una amplificación específica en una reacción determinada es debida efectivamente a la ausencia de ese polimorfismo en la muestra de ADN, y no debida a un fallo de la amplificación por PCR. Debido a las diferentes concentraciones y temperaturas de hibridación de los pares de cebadores específicos comparados con el par de cebadores de control interno: - La intensidad de la banda de control disminuye a menudo en presencia de una amplificación específica y - Los cebadores de control interno son más sensibles a las condiciones de PCR no óptimas y pueden utilizarse para controlar la eficiencia de la PCR. La amplificación fallida de los fragmentos de control interno en las calles sin amplificación específica debe considerarse como señal de un sistema no óptimo. Diríjase a la sección de resolución de problemas para ver las posibles razones de ello y las soluciones para corregirlo. En el Folleto de información del producto específica para cada lote e incluido en cada kit, podrá encontrar datos concretos relacionados con el Control positivo interno. Página 10 de 15

11 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los alelos se asignan como consecuencia de la amplificación de un producto de PCR específico. Una amplificación específica en una calle determinada indica que la muestra de ADN contiene el alelo, o un alelo en un grupo de alelos, definidos por el par iniciador en esa reacción de PCR. La tabla de interpretación suministrada con cada lote de producto puede ser utilizada para asignar qué alelos o grupo de alelos identifican las respectivas soluciones de cebadores. En muchos pero no en todos los Kits SSP Dynal AllSet + o CombiSet +, cada alelo o grupo de alelos se amplifica por medio de más de una solución de cebadores. Es importante verificar que todas las demás soluciones de cebadores que deberían ser positivas por portar ese alelo o grupo de alelos son efectivamente positivas. Aunque los alelos se asignan como consecuencia de la amplificación de un producto de PCR, los tamaños relativos de los productos de PCR pueden ser de ayuda a la hora de interpretar la determinación del SSP. Los tamaños aproximados de los productos de PCR específicos pueden utilizarse con el fin de distinguir una amplificación verdaderamente positiva de: - artefactos por dimerización de iniciadores (primer dimers) - arrastre desde de pocillos adyacentes - amplificaciones no específicas En la tabla de interpretación suministrada con cada Kit Dynal AllSet + y CombiSet + SSP se facilita la secuencia de los tres nucleótidos terminales, lo que determina la especificidad del extremo 3 de ambos iniciadores, directo e inverso. En los productos de HLA Clase I se proporciona la posición del nucleótido en el 2º, 3º y 4º exón de hibridación del extremo 3 de los iniciadores. En los Kits AllSet + Clase II HLA SSP se proporciona la posición del codón correspondiente al extremo 3 de los iniciadores. Si se dispone de la secuencia de un nuevo alelo que no está incluido en la tabla de interpretación, la información sobre la secuencia del iniciador puede ser utilizada para descubrir el patrón de amplificación del nuevo alelo. En este caso, contactar con el Departamento de Servicio Técnico vía e- mail: hla@dynalbiotech.com o por fax: Interpretación utilizando Dynal SSPTool Dynal SSPTool es un programa informático especialmente diseñado para ayudar en la interpretación de los resultados. Cada tabla de interpretación de un lote específico de cada kit individual AllSet + y CombiSet + SSP está registrada en la base de datos del programa. La base de datos se actualiza continuamente cada vez que se distribuyen nuevos lotes de producto. Para cualquier duda e información sobre la introducción de resultados y el uso del programa informático, consulte la sección de ayuda del SSPTool. Para hacer el pedido de una copia gratuita de Dynal SSPTool (código de producto ), póngase en contacto con el representante local de Dynal Biotech. Página 11 de 15

12 RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS PROBLEMA RAZÓN SOLUCIÓN No existe amplificación (ni de los fragmentos de control interno ni amplificación específica) Poca cantidad de ADN El ADN contiene inhibidores de la PCR, p.ej. proteínas, etanol (provenientes del proceso de precipitación). El ADN se ha extraído de sangre heparinizada El ADN se ha disuelto en un tampón que contiene EDTA Fallo eventual de amplificación Error al cargar el gel Si los tapones de los tubos de PCR no están bien cerrados se puede producir evaporación y, subsecuentemente, un fallo de amplificación Uso de pipetas no calibradas Compruebe que el volumen y la concentración del ADN utilizado son correctos. Compruebe la calidad del ADN. Siga exactamente los pasos del método de extracción recomendado por el fabricante. Pruebe algún método alternativo de extracción del ADN Extraiga el ADN de nuevo Utilice sangre no heparinizada, intente tratamiento con heparinasa ( Ver Ref. 8) Repita la extracción del ADN y disuelva el ADN en agua estéril Asegúrese de que todos los tapones están bien cerrados Utilice herramienta específica de tapado Compruebe que se ha cargado el número correcto de pocillos y que cada uno contiene aproximadamente el mismo volumen de mezcla de PCR Calibre de forma rutinaria todas las pipetas según las instrucciones del fabricante Error al pipetear Pipetee con cuidado La muestra de ADN, la Taq polimerasa o las premezclas de PCR no han sido mezcladas correctamente antes de usarlas Mezcle brevemente por medio del vortex antes de usarlas Señal débil de los Compruebe la calidad del ADN. Repita la extracción del ADN con fragmentos de control ADN impuro soluciones recientes. interno Amplificación no específica (ladders or smears) Señales de amplificación cada vez más débiles con el tiempo Poca cantidad de ADN Temperatura de hibridación demasiado alta, el termociclador no está bien calibrado La cantidad de la ADN polimerasa termoestable es muy pequeña La calidad de la ADN polimerasa termoestable es baja ADN impuro (Algunas mezclas de iniciador tienen una alta tendencia a dar amplificaciones no específicas, consulte las notas al pie en cada tabla de especificidad) La solución de bromuro de etidio para la tinción del gel de agarosa es antigua Compruebe la concentración del ADN y ajustela a 50 ng/µl Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Una termocicladora que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe calibrarse cada 6 meses. Utilice más enzima en las reacciones de PCR Utilice Amplitaq de Perkin-Elmer Todos los fragmentos más grandes que el fragmento de control interno pueden descartarse Compruebe la calidad del ADN Repita la extracción del ADN La ausencia de ADN también puede causar smears Prepare una nueva solución de bromuro de etidio para mejorar la tinción del gel. Una de las lámparas UV está rota Compruebe el funcionamiento del equipo de luz UV. Falsos negativos en las amplificaciones Falsos positivos en las amplificaciones Patrones de amplificación extraños Temperatura de hibridación demasiado alta, el termociclador no está bien calibrado Pueden ser causados por contaminación ADN Impuro Temperatura de hibridación demasiado baja, el termociclador no está bien calibrado Se ha utilizado una tabla de interpretación equivocada El modelo de amplificación contiene un falso positivo Alelo nuevo que no aparece en la tabla de interpretación Bandas indistinguibles y borrosas Puede que el tampón esté caliente El peine utilizado tiene las ranuras demasiado anchas Utilice peines finos (4x1 mm) Las muestras con Se han utilizado tampones diferentes amplicón no se pueden El tampón de electroforesis es incompatible con el amplicón de PCR. cargar correctamente Presencia de burbujas de aire en la pipeta Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Un termociclador que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe calibrarse cada 6 meses. Use guantes, puntas de pipeta con filtro, utilice zonas diferentes para pre y postpcr. Manipule las muestras correctamente durante todo el proceso. Compruebe la existencia de contaminación utilizando los iniciadores de control de contaminación de Dynal (código de producto ) Compruebe la calidad del ADN. Repita la extracción del ADN con soluciones recientes. Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Un termociclador que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe calibrarse cada 6 meses. Compruebe que el número de lote del producto coincide con el de la tabla de interpretación utilizada. Compruebe que todas las amplificaciones específicas son de tamaño correcto o si un artefacto (arrastre, primer-dimer) ha sido interpretado como una amplificación Repita el tipaje. Si es posible reproducir el nuevo patrón de amplificación, contacte con el representante local de Dynal Biotech para información sobre el patrón de amplificación de estos alelos. Utilice el tampón TBE recomendado. Córralo a menor voltaje Utilice el tampón recomendado TBE 0,5 x tanto para el gel como para el tampón de electroforesis. Pipetear correctamente Página 12 de 15

13 BIBLIOGRAFÍA 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science Dec 20;230(4732): ) Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. & Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8), ) Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), ) Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation [see comments]. Tissue Antigens 39(5), ) Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. & Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR- SSP). Tissue Antigens 46(5), ) Richmond, Y. and McKinney, W. (eds.) Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. HHS Publication Number (CDC) ) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, ) Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet Jun 11;343(8911): ) Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens Feb;39(2):68-73 Página 13 de 15

14 GARANTÍA La garantía de los productos se aplica sólo al comprador original y se refiere a la cantidad y los contenidos que constan sobre los viales y el etiquetado externo, hasta su fecha de caducidad. Esta garantía limita la obligación de Dynal Biotech exclusivamente con el comprador al reemplazamiento a expensas de Dynal Biotech de cualquiera de los productos con defectos de fabricación, que serán devueltos a portes pagados a Dynal Biotech, o devolverle, a elección de Dynal Biotech, el precio de la compra en efectivo. Cualquier reclamación sobre daños causados a la mercancía durante el transporte será realizada a la empresa transportista. Esta garantía no se aplicará a ningún producto que haya sido alterado una vez fuera de Dynal Biotech, ni tampoco a cualquier producto sometido a uso o manipulación incorrectos. CUALQUIER OTRA GARANTÍA, EXPRESA, IMPLÍCITA O ESTATUTARIA, QUEDA EXCLUIDA POR ESTA AFIRMACIÓN, INCLUYENDO PERO NO LIMITANDO LA GARANTÍA DE COMERCIALIZACIÓN O LA GARANTÍA DE CONVENIENCIA PARA UN PROPÓSITO EN PARTICULAR. La máxima obligación de Dynal Biotech está limitada en cualquier caso al precio de los productos vendidos por Dynal Biotech. EN NINGÚN CASO DYNAL BIOTECH SERÁ RESPONSABLE DE NINGÚN DAÑO ESPECIAL, ACCIDENTAL O CONSECUENCIAL. Algunos estados no permiten la existencia de límites en la garantía o en el cumplimiento de la garantía en ciertas transacciones. En dichos estados los límites establecidos anteriormente no se aplicarán. Este producto no puede ser reempaquetado, reformulado o revendido en ningún caso sin el consentimiento escrito del gerente de Dynal Biotech Ltd. en el Reino Unido. MARCAS REGISTRADAS UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO Dynal es una marca registrada de DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norway AllSet y AllSet + son marcas registradas de DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norway DynaMix es una marca registrada de DYNAL BIOTECH Ltd., U.K. CombiSet y CombiSet + son marcas registradas de DYNAL BIOTECH., U.K. SSPTool es una marca registrada de DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norway AmpliTaq es una marca registrada de Roche Molecular Systems, Inc. USA. Electro-Fast es una marca registrada de Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene ) GeneAmp es una marca registrada de Roche Molecular Systems, Inc. USA PATENTES UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO * Los productos Dynal SSP se venden bajo licencia de ZENECA Ltd. ARMS al amparo de la Patente Europea Nº y con la correspondiente patente mundial. ARMS es una marca registrada de ZENECA Ltd. ** Este producto es adecuado para su utilización en el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR ) cuyas patentes pertenecen a Roche Molecular Systems Inc. y F. Hoffmann-La Roche Ltd (Roche ). La licencia para la utilización de estas patentes de uso de la técnica de PCR no está incluida implícita ni explícitamente en la compra de este producto. Para más información sobre la obtención de licencias para el uso del proceso de PCR en los Estados Unidos, póngase en contacto con el Director de Licencias de Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, o fuera de los Estados Unidos con el Gerente de Licencias de PCR en F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basilea, Suiza. Fabricado por Dynal Biotech Ltd., U.K. Desarrollado por Dynal Biotech Ltd., U.K. Página 14 de 15

15 INFORMACIÓN DE CONTACTO Dynal Biotech Ltd., 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, U.K. Tel: , Fax: Internet: Dynal Biotech A.S.A DYNAL BIOTECH GmbH PO Box 114 Smestad, Bramfelder Chaussee 41 N-0309, Oslo, Norway Hamburg, Germany Tel: Tel: Fax: Fax: Internet: Dynal Biotech Inc. Dynal Biotech S.A. HLA Diagnostics Division Centre de Transfert de I U.T.C., 555 Andorra Glen Court 66 Avenue de Landshut Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA Compiègne, France Toll Free: DYNAL TT ( ) Tel: Tel: Fax: Fax: dynal.france@wanadoo.fr hla.us.cust.serv@dynalbiotech.com Dynal Biotech Pty PO Box 204, Carlton South, Victoria 3053, Australia Tel: Tel: Fax: NZ Freecall: techserv@dynal.com.au Para obtener información sobre los distribuidores de los productos Dynal en cualquier lugar del mundo, póngase en contacto con Dynal Biotech Ltd Copyright 2003 Dynal Biotech Ltd., U.K. Todos los derechos reservados. Impreso en Rev. 000 Página 15 de 15