1.- INTRODUCCION 3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MODELO ESTANDAR DE PREPARACION

Transcripción

1 MEDIOS DE CULTIVO. TIPOS, CLASIFICACIÓN, ENUMERACIÓN, ELABORACIÓN GENERAL Y UTILIZACIÓN DE LOS MISMOS. TECNICAS DE INOCULACION, INCUBACION Y RECUENTO DE LA MUESTRA BIOLOGICAS. 1.- INTRODUCCION 2.- MEDIOS DE CULTIVO CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO ESTERILIDAD DEL MEDIO CLASIFICACION SEGÚN SU ESTADO FISICO SEGÚN SU COMPOSICION SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO CONTROL DE CALIDAD 3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MODELO ESTANDAR DE PREPARACION 4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO AGAR SANGRE AGARCHOCOLATE AGAR MCCONKEY CALDO TIOGLICOLATO AGAR SCHAEDLER AGAR KANA-VANCO AGAR BBE AGAR SALMONELLA-SHIGELLA KLIEGER (KIA) AGAR SABOREUAD AGAR MUELLER-HINTON AGAR THAYER-MARTIN AGAR CLED 5.- INCUBACION 6.- INOCULACION SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO TUBO PLACA PETRI. 1

2 1.- INTRODUCCION Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Actualmente se han preparado más de medios de cultivo diferentes. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. 2.- MEDIOS DE CULTIVO La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de estractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias 2

3 ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustacnias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante) 3

4 2.2.- CLASIFICACION Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a su estado físico, composición, el uso al que se destinan: SEGÚN SU ESTADO FISICO Se dividen en sólidos, semisólidos y líquidos: Sólidos, presentan en su composición una agente solidificante (AGAR) en proporción de 12 a 15 gramos por litro. Semisólidos, presentan AGAR en su composición, pero a una concentración mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente solidificante Líquidos, no presenta ningún agente solidificante SEGÚN SU COMPOSICION Se dividen en empíricos, sintéticos y semisintéticos; empíricos, en su composición aparecen sustancias orgánicas sintéticos, en su composición aparecen sustancias químicas definidas semisintéticos, en su composición aparecen moléculas de naturales hidrolizadas SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivos e inhibidores, transporte y mantenimiento, uso general, para filtros de membrana. enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como sangre de caballo, etc. diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e indicadores para provocar la respuesta bioquímica conocida selectivos e inhibidores, además de los componentes de los medios diferenciales, contienen en su composición una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca. transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras biológicas. son medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células evitando los efectos destructivos de la oxidación. uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. filtros de membrana, son medios que permiten el examen de grandes volúmenes con un baja concentración de 4

5 microorganismos, la separación de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupción del microorganismo COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los constituyentes mas utilizados en la composición de los medios de cultivo son: agar, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero, bilis, sales biliares, gelatina, carbohidratos, indicadores, Agar, comercialmente se presenta en gránulos y polvos, la concentración en la que se encuentra en los medios de cultivo, dependerá del uso que quiera darse al medio. Peptona, es un producto de composición variable, obtenido generalmente de la hidrólisis ácida o enzimática de las proteínas vegetales o animales. Extracto de carne, contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las proteínas, vitaminas y minerales. Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente de aminoácidos y vitaminas del complejo B. Sangre, las mas utilizada es la de sangre o carnero, tiene que estar libre de agentes antimicrobianos para evitar la inhibición el crecimiento de los microorganismos. Se debe de comprobar siempre la esterilidad, así como la ausencia de citratos ya que inhiben el crecimiento de estafilococos. Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa de las bacterias, se emplea plasma humano o de conejo. Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adición de anticoagulante, eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo. Bilis, contiene varios ácidos biliares, como compuestos conjugados con aminoácidos, bilirrubina y biliverdina. Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y bacilos en forma de esporas, sin afectar el desarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos. Gelatina, proteína obtenida mediante extracción de material colágeno a partir de tejidos animales... Es un agente solidificante pero se emplea poco ya que bastantes bacterias provocan su licuación. Carbohidratos se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. 5

6 Indicadores, para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en ph básico y amarillo en ph ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas) CONTROL DE CALIDAD Los medios de cultivo pueden prepararse en el laboratorio a partir de diferentes ingredientes químicos o a partir de productos en polvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirse medios listos para su uso. El laboratorio debe asegurarse de que la calidad de los medios de cultivo y reactivos es apropiada para los ensayos realizados. Se recomienda que provengan de empresas certificadas según ISO El laboratorio debe asegurarse de que la certificación cubre todas las operaciones relevantes, entre ellas las de suministro y entrega, cuando estas influyan en la calidad de los productos, deberá solicitar también, una copia del certificado de registro ISO 9000 a los proveedores de los productos. El fabricante debería aportar, inicialmente, una "especificación de calidad" que incluya el mayor número posible de los puntos siguientes: caducidad del producto condiciones de almacenamiento control de esterilidad, incluyendo criterios de aceptabilidad controles de la eficacia, incluyendo el microorganismo usado, referencia de la colección de cultivos y criterios de aceptabilidad fecha de emisión de la especificación, plan y frecuencia de muestreo Se recomienda realizar controles adicionales con carácter aleatorio, para asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones requeridas. Estos controles pueden incluirse en el programa interno de control de calidad. Los medios de cultivo, productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales deben consumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio debe registrar la fecha de recepción, la fecha de caducidad y la fecha de apertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Todos los envases, especialmente los que contengan medios deshidratados, deben estar herméticamente cerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color. Los lotes de medios preparados según formula en el laboratorio deben verificarse para comprobar que facilitan el crecimiento de determinados cultivos microbianos procedentes de una colección 6

7 reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben el crecimiento de microorganismos no deseados, así como demostrar su esterilidad. Si se dispone de aislados bien caracterizados y reconocidos por otros laboratorios, pueden también ser utilizados como cepas para el control de calidad de los medios. En lugar de utilizar el método frecuente de cultivo en línea, se recomienda utilizar un procedimiento cuantitativo que consiste en inocular en el medio un número conocido, normalmente pequeño, de microorganismos y evaluar el número de microorganismos recuperados. Este método puede utilizarse para establecer el nivel de recuperación por debajo del cual se rechaza un lote. Atendiendo a los factores que hemos comentado el control de calidad se puede clasificar atendiendo, a su presentación y almacenamiento: Atendiendo a su presentación: Placa Petri : 2,5meses Tubo: 6 meses Vial : 6 meses Frasco : 8 meses Laminocultivos: 6 meses: Almacenamiento, encamaras frías a una temperatura entre 4-8 ºC 7

8 3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La preparación de los medios de cultivo deshidratados, es en esencia, una simple manipulación que pone especial atención en la calidad del medio y en la esterilidad del proceso. Si se utiliza un medio comercializado, las instrucciones de uso vienen detalladas en cada envase y debe seguirse de forma estricta. La preparación de los medios de cultivo, consta de tres partes, medios deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material (agua y esterilización). Respecto al agua, esta debe de ser destilada y no debe de contener cloro, además debe de presentar una conductividad adecuada y un contenido iónico tal como indican las especificaciones de agua purificadas de la USP MODELO ESTANDAR DE PREPARACION En la preparación de los medios de cultivo en un laboratorio de Microbiología, se siguen los siguientes pasos: Paso 1, se disuelve la cantidad de medio que aconsejan los manuales de microbiología del medio que se va a fabricar en el volumen de agua destilada o desionizada que se nos indique. La disolución se debe hacer calentando y agitando al mismo tiempo, cuando se trata de un medio de cultivo sólido o semisólido, hasta que se disuelva por completo. Si el medio de cultivo es líquido con una fuerte agitación e suficiente. Paso 2, se esteriliza el medio de cultivo, ya disuelto, en autoclave. Después de permanecer en el autoclave el tiempo requerido, (1litro de medio necesita 15 minutos de autoclave a 121ºC, ciclo de esterilización), se abre lentamente y se deja que se atempere. Paso 3, los medios se trasladan a una zona estéril, para irlos enfriando lentamente y añadirles, si procede, los suplementos requeridos para cada medio (sangre, antibióticos, vitamins,etc). Paso 4, se dosifica el medio de cultivo, la temperatura oscila entre 45-50ºC, en el tipo de envase que se vaya a requerir en condiciones totalmente asépticas. 8

9 4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO. A continuación se exponen los medios mas utilizados en el laboratorio de Microbiología con sus características AGAR SANGRE. El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre. La aportación de caseína y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y pépticos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Cándida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. Permite así mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre los glóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemolítica), parcial (hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteración (hemólisis gamma). La producción de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como ph o atmósfera de incubación. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO2. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO AGAR CHOCOLATE Este medio utiliza la misma base que el Agar Sangre. Antiguamente se añadían los hematíes a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden 9

10 crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio análogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, después de añadir antibióticos. El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio otros factores, en particular el factor V (nicotín-adenina nucleótido) termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla químicamente definida: el PolyViteX. El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los gérmenes encontrados en patología humana o veterinaria. La siembra de líquidos cefalorraquídeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero está particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patógenas y de los Haemophilus AGAR MCCONKEY El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos. Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. El artículo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripción detallada de su composición y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composición se ha modificado en numerosas ocasiones Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. El artículo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripción detallada de su composición y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composición se ha modificado en numerosas ocasiones. La fórmula del agar MacConkey II es de 1983 y se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el swarming de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. 10

11 La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contrario. colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) CALDO TIOGLICOLATO Es el caldo de enriquecimiento más utilizado en Microbiología. Contiene 0,075 % de Agar para evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa del caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor, disminuyendo aun más el potencial de óxido-reducción del medio. Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseína, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patógenas. Hay distintas fórmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de óxido-reducción (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y Hemina AGAR SCHAEDLER Schaedler + 5% sangre de cordero es un medio reductor está particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, así como la adición de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes. Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemólisis de los estreptococos puede disminuir. Sembrar lo más rápidamente posible la muestra a su llegada al laboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio que garantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco). Después de sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de anaerobiosis o bien en sistema individual AGAR KANA-VANCO Se utiliza para el aislamiento rápido de Bacteroides sp. Contiene 75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos 11

12 grampositivos. Contiene también sangre "lacada" de conejo que permite la pigmentación precoz de los Bacteroides sp pigmentados. Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no crecerán en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tinción Gram y confirmar la tolerancia al aire de todos los organismos aislados AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina) El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificación presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores. La mayor parte de las infecciones humanas producidas por bacterias anaerobias son debidas a gérmenes pertenecientes al grupo Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis y B. vulgatus). Es importante una rápida detección e identificación de estos microorganismos ya que se ha observado un incremento de la resistencia a antibióticos mayor que en otros grupos de anaerobios. El agar BBE permite una inhibición selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall. La diferenciación del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrólisis de la esculina con producción de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato férrico amónico) produciendo una coloración marrón oscuro-negro rodeando a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis. Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayoría de anaerobios excepto los del grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es útil para la detección de este grupo de microorganismos ya que por lo general son Esculina positivos. También pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos AGAR SALMONELLA-SHIGELLA Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se diseñó para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir el crecimiento de otros bacilos Gram-negativos (BGN) patógenos. 12

13 Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translúcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas. Bacteria Crecimiento Color bacterias Salmonella enteritidis bueno incolora Proteus mirabilis aceptable incolora Shigella flexneri regular incolora Enterococcus faecalis escaso incolora Enterobacter aerogenes regular crema/rosa AGAR KLIEGER (KIA) Se recomienda para la identificación de bacilos entéricos gramnegativos. Se basa en la fermentación de dextrosa y lactosa y en la producción de ácido sulfhídrico (H 2 S). Se recomienda para identificar posteriores cultivos de colonia tomados de medios primarios (Agar McConkey, Agar SS, etc). El rojo de fenol es el indicador de la producción de ácido y el sultafo ferroso es de la producción de H 2 S Bacteria Crecimiento Pendiente Base Gas H 2 S bacteriano E.coli Buena Amarilla Amarilla Si No (*) P.vulgaris Buena Rojo (**) Amarilla No Si S. eneteritidis Buena Rojo Amarilla Si Si (*) Amarillo: ambiente ácido (**) Rojo: ambiente rojo AGAR SABOREUAD Es un medio diferencial, recomendado para el cultivo y crecimiento de hongos. Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en las muestras a analizar, este medio tan solo depende de la reacción ácida (ph 5,6) Hongo Candida albicans Saccharomyces cerevisae Apergillus Níger Crecimiento Bueno Bueno Bueno 13

14 AGAR MUELLER-HINTON Específico para la realización de antibiogramas, existen dos variantes, Agar Mueller-Hinton/Sangre y Agar Mueller- Hinton/Chocolate, estas variaciones se realizan para obtener la sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganimos, St. Pneumoniae y Haemophilus spp. Respectivamente AGAR THAYER-MARTIN Es un medio empleado para el crecimiento de Neisseria spp, de muestras que contengan flora acompañante (bacterias y hongos). Básicamente, el medio es un Agar Chocolate con los factores V y X, al que se añaden cuatro antibióticos para que actúen de inhibidores (Vancomicina, Colistina, Anfotericina, Trimetopin) AGAR CLED Bacteria Crecimiento N. gonorrhoeae Bueno N. meningitidis Bueno C.albicans Inhibido Utilizado como medio diferencial para el aislamiento, enumeración e identificación de microorganismos en orina. Al tener deficiencia electrolítica, este medio inhibe la aglomeración de Proteus spp al no formar el sobrecrecimiento en lámina. El medio incluye lactosa, para detectar contaminantes coniformes que fermenten la lactosa, que hace que el medio en torno a la colonia vire a color amarillo. Bacteria Crecimiento Color E. coli Bueno Transparente P. mirabilis Bueno Transparente S. aureus Bueno Amarillo 14

15 5.- INCUBACION A la hora del crecimiento bacteriano, existen una serie de factores que pueden modificar dicho desarrollo, para la cual debemos de utilizar unos parámetros correctos de incubación para que posteriormente permita realizar una buena identificación CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal (aerobios estrictos). Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos (anaerobios facultativos) Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones HUMEDAD Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio LUZ AMBIENTAL La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 15

16 5.5.- ph La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un ph neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales TEMPERATURA Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios. 16

17 6.- SIEMBRA E INOCULACION. La siembra consiste en disponer las bacterias que queremos estudiar en un medio de cultivo de una forma adecuada, La siembra puede ser: Para aislamiento, para poder llevar a término el estudio de un microorganismo es condición necesaria aislarle del resto de microorganismos acompañantes. Otras técnicas, son pruebas que no permiten aislamento, en este caso se pueden utilizar tantos medios sólidos como líquidos SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO Se puede realizar atendiendo al instrumento con que siembre, bien asa de siembra, pipeta o hisopo. Asa de siembra, los tubos, del que se a va a sembrar y el que contiene el medio, se toman con la mano izquierda, colocando las bocas a la misma altura. Con la mano derecha se toma el asa de siembra, se esteriliza en la llama en posición vertical hasta que se ponga incandascente. Se destapan los tubos, tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasándolos por la llama, se introduce el asa en el material y se introduce en el medio de cultivo hasta el borde de líquido. Por ultimo se esteriliza el asa y el tubo se agita para una buena homogenización del inóculo. Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se utiliza la pipeta PASTEUR, se utiliza la técnica expuesta anteriormente, pero esta vez el inóculo el liquido. Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estéril y viene protegido dentro de un tubo de plástico SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO Atendiendo al tipo de medio sólido, nos podemos encontrar que sean en tubo, placa PETRI TUBO. El agar tiene que estar en posicion inclinada, dejando una lengüeta en la parte superior y en la parte inferior una parte más ancha. Se pueden realizar dos técnicas, por estría y picadura, en ambos casos nos dice las características bioquímicas de la bacteria a estudiar (fermentación de azucares, movilidad, reducción de metales, etc.) PLACA PETRI. Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y para la realización de antibiogramas. En este último caso, previamente se tiene que realizar una dilución de la muestra (con la bacteria totalmente aislada) y se siembra con el hisopo en el medio 17

18 en el cual se va a realizar el antibiograma, generalmente Mueller- Hinton, aunque atendiendo al tipo de bacterias podemos emplear agar sangre (hemólisis) y agar chocolate (factores X y V). 18