UNIVERSIDAD DE SALAMANCA FACULTAD DE BIOLOGIA VERÓNICA LAMAS ALVAREZ

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE SALAMANCA FACULTAD DE BIOLOGIA VERÓNICA LAMAS ALVAREZ JULIO-AGOSTO DE 2007

2 INDICE - INTRODUCCIÓN - DESARROLLO DE LAS PRACTICAS - OTRAS TÉCNICAS REALIZADAS - RESULTADO DE LAS PRACTICAS

3 1. INTRODUCCION Las prácticas se realizaron en el laboratorio del Hospital Recoletas de Palencia. Ubicado en Avenida Simón Nieto nº 31. Durante el periodo del 2 de julio al 24 de agosto de El tutor de las mismas fue Don José Manuel Geada, analista del laboratorio. El objetivo de las prácticas era el manejo de los aparatos correspondientes a hematología, coagulación, bioquímica e iones, así como el procesamiento de muestras bacteriológicas e identificación de gérmenes. 2. DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS En el laboratorio trabajan el biólogo especialista en análisis clínicos y los técnicos de laboratorio. Durante mi estancia, trabajé con ellos en todas las áreas de análisis clínicos que allí se hacían. El trabajo del laboratorio consiste en analizar las muestras que proceden, por un lado, del propio hospital (tal es el caso de los pacientes ingresados); y por otro, de los pacientes que acuden a las consultas que pasan allí mismo los médicos. Éstas últimas pueden ser ambulatorios o urgentes. Tanto en uno como en otro caso los pacientes proceden de compañías privadas; aunque también se procesan las muestras de pacientes preoperatorios de varices derivados del Sacyl. Todas las muestras llegan al laboratorio junto a una petición que indica el tipo de pruebas que se requieren de las mismas. En dicha petición también figuran los datos del paciente y un número de identificación que coincide con el que llevan las muestras del paciente. Todos estos datos son registrados tanto en papel, en un libro de registro, como en un ordenador. Una vez registrada la muestra, se procede a realizar con ella los análisis oportunos HEMATOLOGÍA HEMOGRAMA Lo primero que se hace todos los días antes de procesar las muestras es pasar 3 controles de sangre. Uno bajo, otro normal y otro alto, y anotar los datos de la serie roja y la serie blanca que dan cada uno. Una vez pasados se continúa con las muestras de los pacientes. Para el hemograma, la muestra de sangre del paciente se inyecta en tubos EDTA, tubos en los que la sangre está sin coagular. Antes de poner en contacto los tubos con la aguja de la máquina de hemogramas, se agitan un poco manualmente, con cuidado. Después se introduce en la máquina el número de identificación de la muestra, se quita el tapón del tubo y se deja que la aguja de la máquina tome del tubo la sangre que necesita para llevar a cabo el análisis. La máquina va a dar el número de eritrocitos, hematocrito, hemoglobina, HGM, VGM, CHCM, ADE, plaquetas, linfocitos, leucocitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos y monocitos.

4 Todos los datos son volcados directamente al ordenador, al paciente correspondiente. Cuando alguno de los valores se sale de lo normal se realizan extensiones sanguíneas. Así se observa la sangre al microscopio y se calcula la fórmula leucocitaria. Estos parámetros sanguíneos son muy importantes para el control de los pacientes, sobre todo cuando hay enfermedades como leucemias o anemias COAGULACIÓN La máquina de coagulación sirve para estudiar parámetros como tiempo de cefalina (TTPA), tiempo de protrombina o el tiempo de fibrinógeno. Parámetros importantes que sirven para estudiar enfermedades del corazón y controlar a pacientes que toman sintrón. En este caso, la sangre se inyecta en tubos que se centrifugan para que se separe el suero. Con una pipeta se toma el suero y se introduce en una cubeta con el número de identificación del paciente y ésta se coloca en la máquina. Controlando que los reactivos de la máquina estén en buen estado y programándola de la forma adecuada, se obtienen dichos parámetros. 2.2 BIOQUIMICA Para las pruebas de bioquímica hay una máquina específica. Todos los días, antes de pasar las muestras, se realiza una purga a la misma y se pasa un control. Así se ve el estado de los reactivos. Si alguno en el control da valores que se salen de los rangos establecidos, se reajusta o se cambia. En este caso, la muestra de sangre del paciente se inyecta en tubos en los que la sangre se coagula. Una vez coagulada se centrifugan para separar el plasma, del cual se toman 500 microlitros y se inyectan en una cubeta identificada. La cubeta se pone en un sector y éste en la máquina. Pueden ponerse 3 sectores a la vez en la máquina, y en cada uno hay espacio para 7 cubetas. Para cada muestra, se programa la máquina con el número de identificación de la misma, su posición en el sector y los parámetros que se quieran estudiar de ella. Una vez llevado a cabo el análisis, la máquina expresa los resultados en papel y los vuelca al ordenador, a su paciente correspondiente. Con este aparato se detectan concentraciones de lípidos en sangre como TAG, HDL, LDL y parámetros bioquímicos como glucosa, urea, creatinina, acido úrico, bilirrubina total y directa, GOT, GGT, GPT, fosfatasa alcalina, proteínas totales, CPK etc IONES Del mismo tubo del que se obtiene el plasma para la bioquímica se toman 50microlitros para hacer el análisis de iones. Con una pipeta especial, que tiene para tomar dos tipos de muestra, se cogen 50microlitros de plasma por un lado y 50microlitros de reactivo por otro. Siguiendo las instrucciones precisas, se descarga la pipeta en la máquina de iones y ésta dará los valores de K +, Cl - y Na + de la muestra.

5 ORINA Las muestras de orina llegan al laboratorio en frascos estériles cerrados, con el número de identificación del paciente; junto a la petición y al resto de muestras (si las hubiera) del mismo. Con ellas por un lado se emplean tiras reactivas para medir la densidad, ph, nitritos, leucocitos, proteínas, glucosa, cetonas, urobilinógeno, bilirrubina y sangre. Y por otro, se estudia el sedimento tras la centrifugación. Para observar la presencia o ausencia de bacterias, hongos, cristales, leucocitos o eritrocitos, y así detectar si hay infección de orina o algún tipo de afección renal MICROBIOLOGÍA Se deben tener en cuenta una serie de pasos fundamentales en cualquier análisis de este tipo: - Recogida correcta de la muestra evitando contaminaciones - Correcto tratamiento y siembra de la muestra en medios de cultivo que permitan la identificación del microorganismo causante de la infección. - Identificación de las colonias de manera visual y al microscopio. Para este último caso es necesario realizar las adecuadas tinciones. - Realización de otras pruebas bioquímicas de identificación si es necesario - Antibiograma para determinar el tratamiento más adecuado para el paciente. - Registro de todos los datos obtenidos en el ordenador, en la petición del paciente correspondiente Recogida de muestras El modo de recoger la muestra va a depender del tipo de la misma: - los exudados se recogen con un hisopo, y es la enfermera la encargada de llevarlos al laboratorio. - Las muestras de sangre son obtenidas también por las enfermeras en el hospital. - Las muestras de esputo, orina y heces son recogidas, por regla general, por el propio paciente. Es importante informarle a éste del modo en que debe hacerlo para que los resultados obtenidos sean válidos. Como las muestras se recogen en el propio hospital, por lo general, no va a haber problemas de deterioro de las mismas durante su transporte hasta el laboratorio. Aun así, hay que tener cuidado y tomar las medidas necesarias para que no se contaminen Siembra de muestras Hay que tener en cuenta el tipo de muestra de la que se trata y el estudio que queremos hacer con ella para hacer la siembra en los medios de cultivo más adecuados. Urocultivo (cultivos de orina) Los medios más utilizados son: - CLED (cistina lactosa deficiente en electrolitos). Con el cual se pueden identificar:

6 E. coli: colonias amarillas/azules dependiendo que sean fermentadoras de lactosa o no. Proteus spp Pseudomonas spp Klebsiella spp Enterococcus faecalis Staphylococcus spp Hongos - CPS ID2 (medio criogénico). Permite la identificación directa de E.coli, Enterococcus, Klebsiella y Proteus. Colonias de color rosa a Burdeos a translúcidas con centro rosa a burdeos; presunción de E.coli. Colonias de color azul-verdoso (coloración franca) y observación de cocos Gram+ mediante examen directo: género enterococcus Colonias de color azul-verdoso (coloración franca) y observación de bacilos Gram- mediante examen directo: grupo KES Colonias incoloras a marrón-anaranjado: posible Proteus. Habría que hacer pruebas bioquímicas para identificar al microorganismo. Tanto en uno como en otro medio la siembra ha de hacerse con un asa calibrada de 1:1000. Así se realiza un contaje más fácil del número de colonias. Para que se considere infección han de crecer más de 100, lo que significa que hay más de UFC/ml. Se sumerge el asa en la orina, y manteniéndola verticalmente, se descarga realizando una estría sobre un radio de la placa. A continuación, sin recargar el asa, se realizan estrías perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa. Una vez sembrada, la placa se identifica con el número de identificación del paciente y se pone a incubar en una estufa a 37º C durante 24h. Al cabo de las cuales se observa el crecimiento de las colonias. Coprocultivo (cultivo de heces) Los medios empleados son: Para heces no diarreicas: Levine (EMB) y SS (Salmonella-Shigella). Para heces diarreicas: EMB, SS, Sangre ANC y CAM (Campylobacter) Los patógenos a investigar son: -Salmonella: las colonias son incoloras o de color amarillo pálido con o sin centro negro en medio SS. Incoloras en Levine (EMB). Las colonias sospechosas en SS se resiembran en SM ID2. Las sospechosas en SM ID2 (color rosa, malva) confirmación por látex Salmonella. -Shigella: incoloras o color rosa pálido o naranja sin centro negro. Incoloras en Levine (EMB). No fermentadoras de lactosa. -Campilobacter: crece en medio CAM. Se identifican mediante observación directa porque son Bacilos Gram- curvos. - Staphilococcus aureus

7 Flora saprofítica en heces: -80 % E.coli y coliformes -14% Enterococos -4% Streptococcus y Staphylococcus -1% Proteus spp - 1% Otros En el caso de heces diarreicas, se toma directamente la muestra con el asa de siembra. El mismo tipo de asa calibrada que para el urocultivo. Pero cuando las heces no son diarreicas, se toma 1g de la misma y se diluye con 3ml de suero fisiológico. Se agita bien en un vórtex y de ahí se toma la muestra con el asa calibrada. La siembra en los medios se hace por estrías. Una vez sembrados, se identifican todos con el número de identificación del paciente y se ponen a incubar. Todos, excepto el medio CAM, se incuban en la estufa a 37º C durante 24h. CAM debe ponerse a incubar en una jarra de anaerobiosis al 5-10% de CO 2 en una estufa a 42-43º C durante 48-72horas. Se dan por positivos aquellos medios en los que se observe crecimiento de colonias. Hemocultivo (cultivo de sangre) El medio utilizado es Hemoline diafásico (Biomerieux); que consta de un medio para aerobios y otro para anaerobios. Son una especie de botellas de vidrio que contienen el medio de cultivo y en las que se inyecta la sangre del paciente. Investigación de bacterias aerobias y anaerobias facultativas: - los medios se ponen a incubar en la estufa a 35-37º C durante 24h - se hace tinción de Gram del caldo - se resiembra a las 24h, 4 y 6 días de incubación en medios como: Sangre común (COS) y Chocolate PVX (5-10 % CO 2 ) Investigación de bacterias anaerobias: - los medios se ponen a incubar en jarras de anaerobiosis a 35-37º C - se hace tinción de Gram del caldo - se resiembra a los 3, 5 y 7 días de incubación (puede ser necesario prolongar el tiempo de incubación hasta 2 semanas). Tanto en uno como en otro caso se dan por positivos aquellos medios en los que haya crecimiento de bacterias. Exudados Los medios empleados son: - Chocolate (PVX) (5-10% CO 2 ) - Sangre (ANC) - Levine (EMB) - Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol (SGC)

8 Dependiendo del tipo de exudado los patógenos a investigar son diferentes: - Faríngeo y amigdalino: Streptococcus Beta-hemolitico Grupo A (Sangre ANC) Staphylococcus aureus (Sangre ANC) Neisseria meningiditis (Chocolate PVX) Neisseria gonorrhoeae (Chocolate PVX) Enterobacterias (Levine BEM) Hongos (Sabouraud SGC) - Ótico Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Pseudomonas aerunginosa Enterobacterias Levaduras y hongos - Conguntival Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Enterobacterias Neisseria Levaduras - Vaginal y uretral Neisseria gonorrhoeae Haemophilus ducreyi Clamydia trachomatis Trichomas vaginalis Levaduras (Candida albicans) Gardnerella vaginalis Anaerobios: habitualmente no se investigan ni en vagina ni en uretra Identificación: Streptococcus Beta-hemoliticos son Bacitracina resistentes, a excepción de Streptococcus Pyogenes que es sensible. Neisseria son diplococos Gram- Haemophilus influenciae son bacilos Gram- S. aureus son catalasa y coagulasa positivos Levaduras: ha de confirmarse su morfología por tinción de Gram Candida albicans da el test de filamentación positivo. El resto de levaduras no. Clamydia trachomatis de determina por tinción Giemsa Trichomas vaginalis se determina por tinción Giemsa y examen directo Esputo Los medios empleados son: - Sangre (ANC) - Levine (EMB) - Chocolate (PVX)

9 - Sabouraud (SGC) Los patógenos a investigar: -Streptococcus pneumoniae: streptococo alfa-hemolítico sensible a Optoquina - S. aureus - Haemophilus influenzae - Entreobacterias - Pseudomonas - Levaduras Pruebas de identificación bioquímicas Un aspecto muy importante a tener en cuenta es la diferenciación entre Streptococcus y Staphylococcus. Ambos son Gram+ pero para distinguir uno de otro se lleva a cabo la prueba de la catalasa. Catalasa positivos son los Staphylococcus, y negativos los Streptococcus. Dentro de Staphylococcus es necesario ver si son Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis, y para ello se hace la prueba de la coagulasa. Si son coagulasa positivos, son S. aureus; si no, S. epidermidis. Además también son importantes las tinciones. Ya se ha mencionado la tinción de Gram o la de Giemsa, o el test de filamentación como pruebas complementarias que ayudan a la identificación Antibiograma Esta prueba se realiza para determinar a qué antibióticos es resistente la bacteria del paciente. Lo cual es importante para la curación de la infección del mismo. El procedimiento es sencillo. Se toma una colonia aislada de los medios de crecimiento y se siembra con ella una placa con el medio Miller-Hilton. Una vez hecho esto, se colocan unas piezas de cartón impregnadas con los antibióticos a estudiar. Se identifica la placa con el número de identificación del paciente y se deja incubando 24h en la estufa. Tras este período se observan los halos de inhibición y se anotan aquellos antibióticos a los que sean sensibles. 3. OTRAS TECNICAS REALIZADAS 3.1 ASLO, PCR Y FACTOR REUMATOIDE Éstos son parámetros que se determinan con unos kits ya preparados. Siguiendo las instrucciones que vienen en los mismos se observa que haya o no aglutinación. Determinándose así la presencia o no de antígenos en sangre. En el caso de que la aglutinación diese positivo, se hacen diluciones para determinar la cantidad de antígenos. 3.2 MONONUCLEOSIS Se utiliza un Kit comercializado para la detección de esta enfermedad. De nuevo se siguen las instrucciones para determinar si hay o no aglutinación.

10 3.3 GASOMETRÍAS Hay un aparato específico para estos análisis. La muestra de sangre del paciente se extrae con unas jeringuillas especiales y llega al laboratorio, donde con mucho cuidado se inyecta en el aparato. Éste nos va a medir entre otros parámetros la concentración de oxígeno y dióxido de carbono. 3.4 VELOCIDAD EN SANGRE La muestra de sangre del paciente llega al laboratorio en tubos específicos en los que la sangre no coagula. La sangre se extrae del tubo con una pipeta graduada, y ésta se deja en vertical en una gradilla especial. Se anotan los milímetros que baja la sangre en la pipeta al cabo de una primera hora y al cabo de una segunda. Ésta bajada sirve para calcular la velocidad en sangre, parámetro que contribuye a la determinación de algunas infecciones. 3.5 TEST DE TROPONINA Se utiliza un kit comercializado para determinar la presencia o no de troponina en sangre. Siguiendo las instrucciones se ve si el test es positivo o negativo. Es una prueba importante que ayuda a determinar si el paciente está sufriendo o no un infarto. Por ello la prueba ha de hacerse con urgencia, y en caso de positivos, avisar al médico inmediatamente para que actúe en consecuencia. 3.6 GRUPO SANGUINEO Se establece el grupo sanguíneo de cada muestra de sangre usando los reactivos Anti A, Anti B y el reactivo para el Rh. Dependiendo de si la sangre aglutina o no se determina el grupo sanguíneo del paciente y el Rh correspondiente. La determinación del grupo sanguíneo es fundamental en pacientes a los que se les debe hacer pruebas cruzadas. 3.7 PRUEBAS PARA DETERMINAR SALMONELLA Y BRUCELLA Existen también kits comerciales en los que por aglutinación se puede determinar la presencia de algunas especies de salmonella o de brucella. Tanto en un caso como en otro, solo hay que seguir las instrucciones del kit y ver si hay aglutinación o no. Evidentemente no se deben realizar únicamente estas pruebas para dicha determinación sino que son complementarias a otras. 3.8 HECES Se realizan otras pruebas con las heces además de coprocultivos: - Test de sangre oculta: la prueba se lleva a cabo con un kit específico y siguiendo las instrucciones del mismo. - Análisis de parásitos y huevos de parásitos: se lleva a cabo siguiendo un protocolo específico.

11 4. RESULTADO DE LAS PRÁCTICAS Mi experiencia en las prácticas ha sido muy positiva. No solo porque el personal del laboratorio ha sido agradable en el trato conmigo, sino por todos los conocimientos que día tras día he adquirido. He aprendido el mecanismo básico de funcionamiento de un laboratorio de análisis clínicos de un hospital, algo muy importante de cara a un posible futuro laboral en el mundo hospitalario. Aprendí a ver que las maquinas cometen errores y la importancia de consultar libros y guías para realizar los análisis, sobre todo al microscopio. Lo importante es siempre la fiabilidad de los resultados que se emiten desde el laboratorio pues a partir de ellos los médicos tratarán a los pacientes.