MEMORIA PRÁCTICAS (CLÍNICA `VIRGEN DEL PILAR - SAN SEBASTIÁN) Sara Almudena Sánchez Hernández Licenciatura de Biología- Fundamental y Biotecnología

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1 MEMORIA DE PRÁCTICAS (CLÍNICA `VIRGEN DEL PILAR - SAN SEBASTIÁN) Sara Almudena Sánchez Hernández Licenciatura de Biología- Fundamental y Biotecnología

2 ÍNDICE Pág. MICROBIOLOGÍA... 3 HECES ORINAS... 3 EXHUDADO VAGINAL... 4 LÍQUIDO SINOBIAL... 4 EXUDADO ORAL... 4 EXUDADO URETRAL... 4 URETRAL-PENE... 5 HERIDA... 5 OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO... 5 BIOQUÍMICA (Analítica) PROTEINOGRAMA... 5 TÉCNICAS MANUALES... 6 HEMATOLOGÍA....6 COAGULACIÓN....6 PRUEBAS SANGUÍNEAS... 7 TÉCNICAS MANUALES... 7 VALORACIÓN PERSONAL INTRODUCCIÓN El laboratorio de la clínica Virgen del Pilar cubre las siguientes áreas: - Microbiología: procesamiento de muestras, identificación de gérmenes y realización de biogramas. - Hematología: aparato Coulter para dicha área, también coagulación, técnicas manuales y pruebas cruzadas. - Bioquímica: cuentan con aparatos de bioquímica, gases, iones, proteínogramas, también se realiza serología y técnicas manuales.

3 MICROBIOLOGÍA En este departamento se analizan distintos tipos de muestras. En algunos casos es necesario procesar la muestra para detectar los posibles gérmenes. Cuando en una placa aparecen colonias de un microorganismo que no sabemos identificar directamente, se realiza un API. Se suele hacer a parte un antibiograma que indica a qué antibióticos es resistente y a cuales es sensible. También se realizan algunas pruebas manuales como indicar si hay sangre oculta en heces, lo cual se realiza con un test predeterminado. Para muchos análisis de muestras, se hace tinción de Gram. PARÁSITOS EN HECES Reactivos: Lugol Fort (0.15ml o 3gotas) Merthidate Formalin (2.35ml) Procedimiento: Coger un poco de muestra con una turunda (bastoncillo) y observar al microscopio óptico. Esta observación es importante para ver si hay blastocistos porque se deterioran con el proceso, y también para determinar si hay parásitos. Si no se observan, se realiza el proceso de concentración. Éste consiste en: Mezclar muestra con los reactivos en un frasco de orina. Filtrar lo anterior en un tubo cónico de orina, utilizando un embudo con una gasa. Centrifugar 5 minutos. Tener en cuenta que los tubos deben estar equilibrados. Tirar el sobrenadante. Al precipitado, añadir solución salina. Centrifugar de nuevo, 5 minutos. Quitar el sobrenadante y añadir 3ml de formol al 10%. Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. Añadir 1.5ml de éter y agitar. Centrifugar 5 minutos. Observar el precipitado al microscopio óptico. CULTIVO DE HECES Sembrar en placa HEKT, para buscar Shigella y principalmente Salmonella, ya que es patógeno. Si crece, veremos colonias negras. También se utiliza placa CAM, para Campylobacter. Después de sembrar se incuba a 40º en cámara Gem box, que mantiene un ambiente microaerófilo, se observa a los dos días. Y por último se cultiva en medio selenito, medio enriquecido para Salmonella y Shigela, que tras 24 horas de incubación, se pasa a placa HEKT. Si salen colonias negras, hacemos un nuevo cultivo en HEKT con una colonia aislada. Volverán a salir colonias negras. En un tubo ponemos ureindol con arrastre de colonias de ésta segunda placa sembrada. Si cambia de color, pasa a violeta, significará que es ureasa positivo y no es Salmonella. Aun así, lo confirmamos con un API. Si en la placa CAM aparecen colonias que sospechamos pudieran ser Campylobacter, observamos al microscopio óptico para confirmar. ORINAS Se siembra con asa de siembra calibrada 1/1000 que esté estéril, en varias placas para detectar distintos microorganismos que pudieran ser patógenos o peligrosos: MCK (enterobacterias bacilares), COS (cocos) y CNA (bacilos y cocos).

4 Principalmente se siembran en las dos primeras, y se ponen a incubar en la estufa a 37º. Si crecen colonias pálidas se hace un API y un enterograma (ATB-UR) para ver a qué antibiótico es resistente o no. Las orinas también se observan al microscopio óptico. Se centrífuga 5 minutos a 2000rpm. El precipitado es lo que se observa. EXHUDADO VAGINAL La muestra llega en un tubo de plástico con turunda. Con ésta extendemos la muestra en una zona de las placas, después también en medio líquido y por último en un porta para la tinción de Gram. Sembrar por cuadrantes con asa de siembra previamente esterilizada, las placas en el siguiente orden: VCA3 para gonococo, New-GBS para Streptococcos B, GAR para Gardnerella, en SGC para Candidans, en MCK para enterobacterias. El medio líquido es Roiron para Tricomonas. Las dos primeras y Roiron se incuban en la estufa de 37º y las demás también pero previamente introducidas en una jarra de anaerobiosis. Detectar Streptococos B es muy importante en embarazadas. Si observamos que aparecen colonias naranjas es claramente positivo. También se puede hacer una prueba para ver si son colonias del grupo A. Es importante cuando presenta gran cantidad de leucocitos y alguna colonia hemolítica, ya que puede ser patógena. Si crece Garnerella veremos colonias que crecen poco y hay hemólisis difusa. Ponemos estas colonias en un porta y en el microscopio vemos cocobacilos teñidos de rojo, es decir Gram negativos, que invaden células. Si hay crecimiento en la placa de SGC, veremos colonias blanquecinas y hay que hacer filamentación para saber si las candidas son de la especie albicans. Esto se realiza en un tubito de cristal en el que ponemos suero humano (de persona normal, que no tome antibióticos) y un arrastre de colonias. Se incuba en la estufa. Las esporas son redondas pero al ponerse en contacto con el suero aparece filamentación. Se observará al microscopio óptico para determinarlo. LÍQUIDO SINOBIAL Se realiza tinción de Gram y se ven leucocitos pero no gérmenes. Se cultiva en placas y coincide: no crece nada. Las placas que utilizamos para ello son MSA2, COS y MCK. EXUDADO ORAL Sembramos con el bastoncillo o un asa estéril en una placa de SGC2, por cuadrantes. Lo que se pretende buscar son Candidans. EXUDADO URETRAL Suele ser un paciente que presenta muchos leucocitos. Le daremos valor a las colonias crecidas. Se siembra en medio New-GBS y si aparecen colonias un poco anaranjadas, se realiza la prueba de la bilisculina para ver si son enterococos. Se utiliza medio sólido inclinado en tubo, y será positivo si se pone negro.

5 URETRAL-PENE Las placas en las que se siembra son las mismas que para el exudado vaginal, y además en placa de CNA, que se incuba en anaerobiosis. HERIDA Se siembra en las siguientes placas: MCK, MSA2, CNA, COS y BHI; y también se realiza una tinción de Gram. todas se incuban en la estufa de 37º menos la de CNA. OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO a) El paciente es un hombre mayor. Tiene proliferación de leucocitos. Al hacer una extensión, como los linfocitos están alterados se rompen y al microscopio óptico vemos muchas células rotas grandes. Todo ello indica que padece leucemia crónica. b) Para ver si hay hongos en la piel, raspan de la espalda que es donde suelen estar las lesiones. Al microscopio observamos las escamas de la piel con bolitas. c) Tras una vasectomía, miramos al microscopio para ver si hay espermatozoides. De no los vemos, centrifugamos y volvemos a observar. De esta manera nos aseguramos de que no hay. d) Si al cultivar el exudado vaginal vemos que tiene hongos, vemos al microscopio óptico se es Candida albicans o no. e) Observamos el precipitado de orina. Vemos leucocitos, bacterias, células epiteliales de escamación, artefactos (pelos, suciedad, polvos de talco,...). Podemos determinar si el paciente padece piuria al observar muchos leucocitos. BIOQUÍMICA Las pruebas de bioquímica o analítica se realizan en un aparato llamado Synchron, en el que ponemos los tubos centrifugados con las muestras de sangre de los pacientes. Introducimos los datos de número de muestra, fecha, análisis a realizar (en algunos casos existen perfiles de pruebas determinadas, como para preoperatorios en los que se analizan siempre glucosa y urea). Las pruebas que se realizan en este aparato son para medir glucosa, urea, fosfatasa alcalina, creatinina, ácido úrico, colesterol total, HDL, LDL, triglicéridos, hierro, bilirrubina total y libre, transaminasas, amilasa, albúmina, PO4, calcio, proteínas totales. También se pueden realizar pruebas del metabolismo. En éstas se mide creatinina y ácido úrico. Las muestras son orinas periódicas de 24 horas y de 2 horas. A ambos tipos de muestra, en otro tubo, se añade ácido clorhídrico (en total 4 tubos, 2 con y 2 sin). También se hacen diluciones 1/10 para comparar. En otro aparato pequeño se miden los niveles de iones como calcio iónico, potasio, sodio, potasio, cloruro. La máquina aspira suero y mide esos valores. PROTEINOGRAMA Esta prueba se basa en que las distintas proteínas del suero sanguíneo se desplazan en un campo magnético a diferentes velocidades. La muestra se coloca sobre una banda humedecida, con la ayuda de un potro. Se introduce el tiempo y los amperios en la máquina. Lo dejamos 35 minutos en el aparato. El campo eléctrico hará que corran las proteínas a lo largo de la banda. Transcurrido el tiempo, se tiñe la banda manteniéndola en agitación para observar la altura a la que han

6 quedado las distintas proteínas y la intensidad de las rayas o bandas que determina la cantidad de proteína en el suero. Después de teñir se lava, ponemos líquido transparentador y secamos. En otro apartado introducimos la tira. La máquina la lee e imprime un gráfico de las proteínas indicando la cantidad y si dicho número está dentro de los límites normales. TÉCNICAS MANUALES Medir transferrina (prueba TIBC): En un tubo de plástico grande ponemos 1 ml de reactivo y 0.5 ml del suero. Usamos una pipeta de 500 μl. Dejamos reposar 5 minutos. Añadimos reactivo R7, que son unos polvos. Cerramos con parafilm y lo colocamos en el agitador. Transcurridos 20 minutos, centrifugamos 10 minutos a 3000 rpm. a continuación, el aparato de bioquímica mide el hierro. Medir magnesio: Se prepara en tubos pequeños de cristal. Preparamos un blanco (1 ml de reactivo), el patrón (1ml de reactivo + 10μl patrón) y las muestras (1ml de reactivo + 10μl de muestra). Lo dejamos 5 minutos y medimos en un aparato las concentraciones. Hemoglobina glicosilada: Se realiza para hacer seguimiento de un diabético o para saber si alguien tiene un problema de diabetes. Si el test da un valor alto, significa que ha tenido o tiene gran cantidad de glucosa en sangre. Los hematíes duran un mes y se hace el seguimiento. Con la sangre que se saca al momento no es fiable del todo por eso precisamente, por ser en un momento determinado, y puede tener niveles de glucosa normales o no. Con esta prueba determinamos niveles de glucosa con mayor seguridad. Se utiliza un tubo pequeño de cristal donde preparamos un hemolizado de la sangre muestra (50μl + 200μl). Agitamos para que sea homogéneo. Se realiza cromatografía por intercambio iónico del hemolizado, pasando después reactivos para empujarlo. Mediante espectofotometría, se mide la absorbancia a 415nm del líquido que cae finalmente. Introducimos anteriormente un control (reactivo + hemolizado sin pasar por la columna). HEMATOLOGÍA En este departamento mediante una máquina de citometría se mide la cantidad de células sanguíneas, e indica si los niveles son normales. Además se realizan otras pruebas: COAGULACIÓN Se mide los segundos que tarda la muestra en coagular. Para ello se utiliza una máquina que lleva tres reactivos, uno para medir el tiempo de coagulación de protrombina y fibrinógeno, y dos (uno específico y otro es cloruro cálcico) para medir tiempo de otro factor de coagulación (APTT). A las muestras de pacientes que están recibiendo medicación con sintrón para tener la sangre más líquida, sólo se realiza la primera prueba.

7 PRUEBAS CRUZADAS Se realizan cuando una persona va a recibir una transfusión de sangre. Antes de ello, se hacen tres pruebas indispensables: 1º.- Anticuerpos irregulares Esta prueba es importante para detectar anticuerpos raros. Por ejemplo si una mujer ha tenido un embarazo, pudiera haber creado ciertos anticuerpos que pudieran ser peligrosos en un nuevo embarazo; pero también hay que tenerlos en cuenta al realizar una transfusión. Para efectuar dicha prueba, en unos pocillos pequeños ya preparados para ello ponemos una gota de reactivo y 25μl de suero. Se introduce al calefactor 15 minutos. Centrifugar y observar si el suero ha precipitado, en cuyo caso es negativo, o no. 2º.- Grupo hemático Determinar el grupo sanguíneo: A, B, AB o 0; también para Rh. Utilizamos una pipeta de 100 μl. En una placa blanca ponemos tres gotas de sangre, y encima de cada una de ellas, una gota del reactivo correspondiente. En la gota que veamos aglutinación será positivo. 3º.- Grupo sérico Con esta prueba confirmamos el grupo hemático. Los reactivos son otros, pero determinamos lo mismo. Ponemos en un tubo pequeño de cristal una gota de reactivo y 100 μl de suero. Centrifugar y vamos dando golpecitos para ver si hay aglutinación. En este caso, será positivo el que no presente aglutinación. Si ya hemos realizado estos tres procesos, podemos llevar a cabo las pruebas cruzadas. Se realizan en día próximo a la transfusión que vaya a recibir. Se pone una gota de hematíes de la bolsa de sangre a transfundir con sangre del paciente. Centrifugar y observar si hay o no aglutinación. Si vemos que se forma una solución homogénea es que son compatibles. TÉCNICAS MANUALES: Existen kits para determinar si un paciente padece sífilis, hepatitis B, etc. Se usa el suero sanguíneo. VALORACIÓN PERSONAL Durante el tiempo que realicé éstas prácticas en una clínica, pude ver cómo funciona un laboratorio sanitario y las diversas pruebas que se realizan. Me ha resultado muy interesante, y gratificante. La relación con los compañeros ha sido muy buena. El interés mostrado por mi parte y por los que llevan responsabilidad para enseñarme ha sido excelente. De seguro es un buen factor para aprender. El trabajo realizado me han parecido muy interesantes y práctico para el mundo laboral, pues aprendes procedimientos, pruebas, etc que espero, sirvan en el futuro laboral.

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