3. Materiales y métodos

Transcripción

1 Proyecto: Caracterización molecular de la maquinaria de procesamiento del extremo 3 del RNAm en Entamoeba histolytica Registro: Director: Dra. Laurence A. Marchat 1. Resumen En eucariontes, la cola de poli(a) en el extremo 3 de los transcritos es un elemento esencial en la regulación de la expresión génica, ya que está involucrada en casi todos los aspectos generales del metabolismo del RNAm: participa en el transporte del RNAm procesado del núcleo al citoplasma, confiere estabilidad al RNAm y promueve su eficiente traducción. Además, se ha demostrado que su eliminación es la primera etapa de las principales vías de degradación de los transcritos. En este trabajo, reportamos la identificación y caracterización de un gen que codifica para una posible poli(a) exorribonucleasa de la familia CAF1/POP2 (EhPOP2/CAF1) en Entamoeba histolytica. El análisis de la secuencia aminoacidica y su comparación con proteínas homologas de otros organismos muestra que EhPOP2/CAF1 posee el dominio CAF1 ( aa) y el dominio de ribonucleasa H ( aa) característicos de estas proteínas. La proteína EhPOP2/CAF1 recombinante expresada en bacterias se utilizó para generar anticuerpos específicos en conejo, los cuales reconocieron la proteína en el citoplasma de los trofozoítos en ensayos de microscopia confocal. Mediante ensayos de RT-PCR, demostramos que la expresión del RNAm del gen EhPOP2/CAF1 varía en el ciclo celular, mostrando una mayor expresión en la fase M, lo que sugiere la existencia de una relación entre los niveles de expresión de EhPOP2/CAF1y la regulación del ciclo celular. 2. Introducción La cola de poli(a) en el extremo 3 de los transcritos es un elemento esencial en la regulación de la expresión génica, ya que está involucrada en casi todos los aspectos generales del metabolismo del RNAm: confiere estabilidad al RNAm (existe una relación directa entre la longitud del tracto de poli(a) y la vida media de los transcritos), participa en el transporte del RNAm procesado del núcleo al citoplasma y promueve su eficiente traducción (interactuando con factores de inicio de la traducción) (Sachs et al., 1997). La cola de poli(a) también tiene un papel esencial 1

2 en la regulación de la degradación del RNAm, ya que la desadenilación es la primera etapa en las principales vías de degradación del RNAm (Couttet et al., 1997; Van Hoof et al., 1999). La formación de la cola de poli(a) consta de dos principales etapas: el corte del transcrito primario y la reacción de poliadenilación, en donde participan varios complejos multiproteicos identificados como CPSF, CstF, CF Im, CF IIm, PAP y PAB en mamíferos. Estas proteínas reconocen secuencias cis-reguladoras en el 3 UTR (Untranslated Region) del RNAm para formar un multicomplejo de procesamiento, cuyo ensamble precede el corte endonucleolítico y la poliadenilación del extremo 3 (Keller et al., 1997). En eucariontes, la desadenilación del extremo 3 del RNAm implica la actividad de varias ribonucleasas D, entre las cuales destacan las proteínas de la familia CAF1/POP2. También, se ha reportado que las proteínas CAF1/POP2 están asociadas al inicio de la transcripción, formando parte del complejo heptamérico Ccr4-NOT, el cual es un regulador global de la transcripción (Tucker et al., 2001; Daugeron et al., 2001). Además, se ha demostrado que POP2/CAF1 participan en la regulación del ciclo celular, mediante la interacción con proteínas reguladoras como son BTG2, DBF2 o CLB2 (Morel et al., 2003; Liu et al., 1997). Recientemente, el análisis de la regulación postranscripcional del gen EhPgp5, uno de los genes responsables del fenotipo de resistencia a múltiples drogas en E. histolytica, el parásito protozoario entérico responsable de la amibiasis humana, nos llevó a demostrar la importancia de la cola de poli(a) del extremo 3 del RNAm en la regulación de la expresión de este gen (López-camarillo et al., 2003). Utilizando la información generada por el proyecto de secuenciación del genoma de E. histolytica, identificamos en las bases de datos ( y genes que codifican para proteínas de la maquinaria de corte, poliadenilación y desadenilación del extremo 3 del RNAm en este parásito (López-Camarillo et al., 2003) e iniciamos la caracterización de algunos factores, como por ejemplo la poli(a) polimerasa que fue objeto de eludió de un proyecto CGPI anterior (García-Vivas et al., 2003). 2

3 En este proyecto, nos enfocamos al estudio de la proteína homóloga a la POP2/CAF1, ya que es un factor clave en la degradación de la cola de poli(a) del RNAm, y por lo tanto en la estabilidad del RNAm en eucariontes. Se clonó y se caracterizó molecularmente el gen que codifica para la proteína EhPOP2/CAF1 de E. histolytica. La proteína recombinante expresada en bacterias se utilizó para generar anticuerpos en conejo, con los cuales se inmulocalizó la proteína en el citoplasma de los trofozoítos. Finalmente, demostramos que existe una expresión diferencial del RNAm del gen EhPOP2/CAF1 a través del ciclo celular del parásito. 3. Materiales y métodos 3.1. Cultivos de E. histolytica Los trofozoítos (clonas A y L6 de la cepa HM1:IMSS) se cultivaron axénicamente en el medio TYI-S-33. Los trofozoítos de la clona L6 se cultivaron en presencia de 200 µg/ml de colchicina por 24 h y se cosecharon a las 0, 3, 8 y 14 horas para obtener poblaciones de trofozoítos sincronizados en las fases M, G1, S y G2 del ciclo celular Clonación, análisis de secuencia, expresión y purificación de la EhPOP2/CAF1recombinante La secuencia codificante completa del gen EhPOP2/CAF1 se amplificó por PCR usando oligonucleótidos específicos, DNA genómico de la clona A y la enzima DNA Taq polymerase high fidelity (2.0 U). El producto de PCR se clonó en los sitios de restricción BamHI y HindIII del vector pbs, y posteriormente se subclonó en el vector de expresión prset A (Invitrogen). Las construcciones se secuenciaron. La secuencia predicha de la proteína EhPOP2/CAF1 se analizó con los programas BLAST, ClustalW ( Prosite ( Pfam ( BioEdit ( y MEGA ( para identificar dominios conservados y regiones funcionales, así como realizar un análisis filogenético. El vector pret-a conteniendo el gen EhPOP2/CAF1 se utilizó para transformar bacterias E. coli BL21-PLysS. La proteína EhPOP2/CAF1 recombinante (rehpop2/caf1-6xhis) se expresó en bacterias (IPTG 1 mm; 3 horas a 37 ºC) y se purificó por cromatografía de afinidad con columnas de Ni 2+ -NTA (Qiagen). La identidad de la proteína fue confirmada por ensayos de Western blot usando 3

4 anticuerpos dirigidos contra la etiqueta de 6xHis (Roche) y el kit de inmunodetección ECL Plus (Amersham) Inmunolocalización La proteína r EhPOP2/CAF1 purificada (100 µg) diluida en el adyuvante de Freund se inoculó por vía intramuscular (cuatro veces, cada 7-10 días) a un conejo libre de patógenos. El anti-suero se utilizó en ensayos de Western blot con la proteína recombinante y en ensayos de inmunofluorescencía con microscopia confocal para determinar su localización subcelular en trofozoítos de la clona A RT-PCR Se obtuvo el RNA total de trofozoítos de la clona L-6 sincronizados en la diferentes fases del ciclo celular, usando el reactivo TRIzol (Gibco). La RT-PCR semicuantitativa se realizó con los mismos oligonucleótidos específicos. Los productos se analizaron por 6% PAGE y densitometría. 4. Resultados 4.1. Análisis de la secuencia nucleotídica y aminoacídica De manera interesante, identificamos en el genoma de la amiba dos genes cuyos productos comparten alta identidad (32-48%) y homología (54-64%) con los miembros de la familia CAF1 de levadura y humano. El gen EhPOP2/CAF1 se identificó en el locus 108.m00121 ( nt) mientras que el gen EhPOP2/CAF1-like esta en el locus 7.m00434 ( nt). Las proteínas predichas a partir de ambas secuencias presentan alta similitud con las proteínas eucarióticas de la familia CAF1, mostrando 38-48% de identidad y 55-65% de homología con las proteínas homologas de levadura, protozoarios, nematodos, plantas y vertebrados. EhPOP2/CAF1 y EhPOP2/CAF1-like son proteínas paralogas que comparten 80% de identidad. El gen EhPOP2/CAF1 (933 pb) codifica para una proteína de 311 aminoácidos con un punto isoeléctrico predicho de 4.78 y un peso molecular predicho de 35,674 Da. Como es el caso de muchos genes de amiba, el marco de lectura abierta no presenta intrones. El análisis de la proteína y su comparación con proteínas homologas muestra que EhPOP2/CAF1 posee las principales características de los 4

5 miembros de la familia de exorribonucleasas CAF1, es decir el dominio CAF1 ( aa) y el dominio de ribonucleasa H ( aa). Además, presenta varios sitios putativos de fosforilación que podrían ser importantes para la regulación de la actividad de la proteína. EhPOP2/CAF1 no posee señal de localización nuclear típico, lo que sugiere que E. histolytica podría estar usando otras secuencias para el transporte nuclear. El análisis filogenético mostró que EnPOP2/CAF1 y EhPOP2/CAF1-like están agrupadas con proteínas homologas de otros parásitos protozoarios, levadura y plantas, mientras que aparecen mas lejos de las proteínas de vertebrados Expresión de la proteina EhPOP2/CAF1 recombinante El gen EhPOP2/CAF1 se amplificó por PCR y se clonó en el vector de expresión pret-a. Este se utilizo para transformar bacterias E. coli y obtener la proteína recombinante EhCAF1, la cual fue reconocida por anticuerpos anti-his en ensayos de Western blot. La proteína se purificó por cromatografía de afinidad en una columna de níquel y se inoculó a un conejo para obtener el anti-suero. La calidad de los anticuerpos fue comprobada mediante el reconocimiento de la proteína recombinante en ensayos de Western blot Localización subcelular de EhPOP2/CAF1 Par estudiar la localización subcelular de EhPOP2/CAF1, realizamos ensayos de inmufluorescencía con microscopia confocal utilizando trofozoítos fijados y permeabilizados con triton. De manera interesante, el anti-suero reconoció proteínas localizadas en el citoplasma de los trofozoítos, lo que concuerda con la posible función biológica probable de la EhPOP2/CAF1, involucrada en la desadenilación y degradación del RNAm en E. histolytica. Sin embargo, debido a la alta similitud en secuencia que existe entre EhPOP2/CAF1 y EhPOP2/CAF1-like, no podemos descartar que los anticuerpos reconozcan a ambas proteínas en las células Expresión del RNAm del gen EhPOP2/CAF1 en el ciclo celular Por RT-PCR semi-cuantitativa, demostramos que la expresión del RNAm del gen EhPOP2/CAF1 varia en el ciclo celular. El RNAm se detectó en todas las fases del ciclo celular pero se observó una mayor expresión en los trofozoítos sincronizados 5

6 en la fase M. Es posible que la proteína EhPOP2/CAF1 tenga un efecto en la regulación del ciclo celular mediante la interacción con otras proteínas, como se reporto en levadura o humano, por ejemplo. O bien, puede ser que la expresión de EhPOP2/CAF1 sea regulada en el ciclo. 5. Referencias 1. Couttet et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: Daugeron et al., Nucleic Acids Res 29: Garcia-Vivas et al., Exp Parasitol 110: Keller et al., Curr Opin Cel Biol 9: Liu et al., Embo J 16, López-Camarillo et al., Exp Parasitol 110: López-Camarillo et al., J Biol Chem 278: Morel et al., J Cell Sci 116, Sachs et al., Cell 89: Tucker et al., Cell 104: Van Hoof et al., Cell 99: Impacto El estudio de los factores responsables de la formación y degradacion de la cola de poli(a) del RNAm en E. histolytica nos provee de conocimientos y herramientas moleculares, las cuales podrán ser utilizadas en el mejor entendimiento de la regulación de la expresión de genes involucrados en la resistencia a drogas o virulencia de este parásito, para diseñar nuevas drogas o vacunas en el futuro. La proteína EhPOP2/CAF1 es la primera poli(a) exorribonucleasa identificada y descrita en este parásito. Su caracterización molecular y funcional nos permitirá entender mejor como se lleva a cabo la desadenilación, una etapa esencial en las principales vías de degradación del RNAm en E. histolytica. En la realización de este proyecto, han participado varios estudiantes de la Maestría en Biomedicina Molecular de la ENMH asi como varios alumnos del programa PIFI. Un alumno obtendrá el grado en los próximos 6 meses. Con los resultados obtenidos, se ha generado una ponencia en un congreso internacional y una publicación internacional esta actualmente en preparación. 6

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