Periodo mayo-octubre 2016 Pacientes de 2 a 14 años procedente de la policlínica de alergias del CHPR Se realizan 225 ensayos por inmunoblot de RIDA

Transcripción

1 Análisis de Paneles de Alergias por Inmunoblot en Laboratorio CHPR Periodo mayo-octubre 2016 Pacientes de 2 a 14 años procedente de la policlínica de alergias del CHPR Se realizan 225 ensayos por inmunoblot de RIDA qline de BioPharm. 5 Paneles pediátricos 112 Paneles alimentos (3VE y 3UY) 108 Paneles Inhalantes (1UY y 2UY) Se realiza un estudio descriptivo para los paneles inhalantes y de alimentos.

2 Selección de Alérgenos a ensayar Paneles inhalantes 1 UY y 2 UY. Ácaros del polvo doméstico. Hongos ambientales interiores y exteriores. Epitelios de animales. Pólenes de árboles, arbustos y gramíneas. Insectos. Latex.

3 Resultados Inmunoblot Ig E específica RIDA qline Panel inhalantes 108 Paneles de inhalantes (1 UY y 2 UY) 61 Positivos (56%)

4 Panel de Ig E especifica para Alimentos 112 pacientes 68 positivos (61%)

5 Conclusiones Primera experiencia en el laboratorio CHPR y los primeros aportes en el diagnostico etiológico de las alergias. Se observa la mayor cantidad de resultados positivos a inhalantes en Ácaros del polvo. Acorde a la zona geográfica de nuestro país, zona costera, templada, húmeda y con vientos que favorecen el crecimiento la propagación de los mismos. Hay que evaluar aquellos pacientes que muestran reacciones positivas en varios alérgenos estudiados para evaluar las posibles reacciones cruzadas que se dan por epitopes altamente conservados como ocurre en pólenes de ciertos árboles, arbustos y gramíneas. Las reacciones cruzadas también ocurrirían en alimentos como los resultados encontrados en panel de alimentos venezolanos que incluye Queso Gouda, siendo éste un alimento que se consume poco en nuestro país y menos aun en la población del Hospital por el alto costo. De la misma manera en ciertos mariscos y crustáceos, donde están descrito epitopes compartidos con determinados Ácaros del polvo. Habrá que evaluar en cada uno de estos pacientes la utilidad de los mismos en base a su historia clínica. Si bien la técnica cuenta con controles internos y calibradores en cada tira, no contamos con controles externos. En base a estos primeros estudios analizados y los resultados obtenidos sería conveniente fabricar paneles con aquellos alérgenos mas frecuentes para nuestra población, dado que la técnica cuenta con un menú de alérgenos muy amplio. La técnica de inmunoblot no está recomendada para fármacos, por lo que habría que incorporar nuevas técnicas como el test de activación de basófilos por citometría.

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7 Dra. Karina Flores Lassalle XVI Congreso Uruguayo de Patología Clinica Noviembre

8 Metodos de estudio de alergias In vivo Pruebas cutáneas Pruebas de provocación In vitro o ensayos de Laboratorio Humorales Celulares

9 Test in vivo: Pruebas cutáneas Constituyen el método mas sencillo, sensible y específico para corroborar una historia de alergia. Prick-test o Prueba intraepidérmica: es la prueba alérgica más utilizada. Se utiliza para investigar las reacciones de hipersensibilidad inmediata mediadas por IgE. Se seleccionan los alérgenos en relación al entorno, hábitos alimentarios y los síntomas. Prueba intradérmica, estudia hipersensibilidad inmediata y retardada. Prueba epicutánea o Prueba del parche, recomendada para las dermatitis alérgica de contacto o reacciones a fármacos. Para que una prueba tenga valor diagnóstico, se debe demostrar que la sensibilización al alérgeno es responsable de la clínica del paciente. Para ello es necesario la historia clínica o las pruebas de exposición con el alérgeno en distintos órganos diana (nasal, bronquial, conjuntival u oral) Las pruebas de provocación con alimentos o medicamentos son ampliamente usadas. Son métodos muy sensibles pero presentan inconvenientes con las reacciones adversas que pueden aparecer en los pacientes (diarrea, vómitos, mareos, reacción anafiláctica).

10 Características de las Pruebas in vivo: Las prueba cutáneas son de bajo costo y relativamente bajo riesgo. Son métodos muy Sensibles(detectan fácilmente la presencia de una reacción alérgica). Una prueba cutánea positiva no significa enfermedad (Sensibilización subclínica o latente). Hay que basarse en la historia clínica para ello. Son Específicas (permiten explicar que los síntomas de una persona son causados por un determinado alergeno). Existe fenómeno de Reactividad cruzada, que debe ser tenido en cuenta al interpretar los resultados, debido a que pueden restringirse dietas con exclusión de alimentos o recibir tratamientos injustificados. Se deben realizar con extractos de calidad, estandarizados y con concentraciones de alérgenos conocidos para evitar falsos resultados. Baja reproducibilidad dado que los extractos de alérgenos varian de un lote a otro. Emplear una solución control (C+: histamina, C-: SF) para descartar reacciones inespecíficas. Se pueden realizar en todos aquellas personas con sospecha de enfermedad alérgica, especialmente si persiste o se agrava. La misma tiene utilidad pronóstica dado que una persona sensibilizado a múltiples sustancias se asocia con persistencia y gravedad. Finalmente son útiles para seleccionar aquellos alergenos en pacientes susceptibles de ser tratados con vacunas antialérgicas. No tienen utilidad para predecir si una persona sana o sin reacciones previas pueda ser alérgico (terreno atópico). Para ello hay que recurrir a estudios genéticos.

11 Cuándo recurrir a los estudios de laboratorio? 1. Cuando las pruebas cutáneas están contraindicadas: lactantes, dermatitis generalizada, dermografismo y urticaria. 2. Pacientes donde las pruebas cutáneas pueden ser peligrosas por la elevada sensibilización, especialmente a fármacos como la Penicilina. 3. Para apoyar el diagnóstico etiológicos ante pruebas cutáneas dudosas o de difícil interpretación. 4. En algunos tipos de enfermedades alérgicas donde la detección de IgE específica en suero constituye uno de los criterios diagnósticos (ej. Alergia a veneno de heminópteros). 5. Para el estudio de sensibilización a alérgenos que no pueden ser vehiculizados en los extractos que se preparan convencionalmente como son sustancias insolubles en agua, tóxicos, sensibilizantes potentes. 6. Cuando el paciente está siendo tratado con fármacos que atenúan las pruebas cutáneas (antihistamínicos o corticoides) y que no pueden suspenderse. 7. Cuando no existe infraestructura adecuada donde conservar los extractos o no contamos con personal capacitado disponible para realizar las pruebas cutáneas.

12 Técnicas de laboratorio en el diagnóstico de Alergias Buscan: Identificar el alérgeno responsable de los síntomas del paciente. Determinar el mecanismo inmunológico de la Reacción: inmediata o tardía. Identificar huésped sensible (Atopía).

13 MÉTODOS SEROLÓGICOS Y CELULARES Determinación de mediadores de la respuesta alérgica Triptasa Histamina Factores reguladores del complemento Determinacion de Anticuerpos Ig E total Ig E específica Ig G4 específica Evaluación de la respuesta celular a determinados alérgenos. Test de liberación de histamina Test de activación de basófilos Test de transformación linfocitaria

14 Determinación de Mediadores de la Reacción Alérgica TRIPTASA. Proteína mas abundante de los mastocitos. Al activarse los mismos liberan grandes cantidades de triptasa e histamina a los tejidos y a la sangre. Cada persona tiene un nivel basal en suero propio y estable en el tiempo. Tiene utilidad clínica en las reacciones anafilácticas graves que ocurren en alérgicos al veneno de heminópteros y en pacientes durante una cirugía donde los anestésicos pueden enmascarar el proceso anafiláctico. El seguimiento es útil en el diagnóstico diferencial de otras patologías donde permanecen niveles elevados (Insuficiencia renal o hepatica, mastocitosis sistémica).

15 Determinación de Mediadores de la Reacción Alérgica HISTAMINA Sustancia almacenada en los gránulos de los mastocitos y basófilos. Es el principal mediador de la reacción alérgica Técnica compleja y poco fiable ya que se degrada rápidamente (2 minutos). Además muchos alimentos de la dieta o una inadecuada maniplulación de la muestra pueden inducir elevaciones de la concentración dehistamina, independientemente de la reaccción alérgica. Actualmente en desuso. FACTORES Y ENZIMAS DE COMPLEMENTO Poco utilizadas. Utilidad en el AngioEdema.

16 Determinación de IgE total Por nefelometría o inmunoturbidimetría. Tiene un valor limitado como método de cribado para las enfermedades alérgicas. Las concentraciones de IgE varían con la edad. Valores superiores a 100 UI/ml se consideran altos. Factores no inmunológicos como el tabaquismo pueden aumentar el valor de IgE. Además, cuando se comparan individuos alérgicos y sanos las concentraciones medias son mayores en el grupo de los alérgicos pero la dispersión es muy amplia, por lo que las 2 campanas e superponen. De forma que un paciente alérgico puede tener niveles de IgE sérica total dentro de valores normales y un paciente sano tener niveles elevados de IgE total. Un valor muy elevado de IgE una vez descartadas las parasitosis adquiere mas relevancia y es muy sugestivo de alergia.

17 Determinacion de Ig E especifica Al igual que las pruebas cutáneas detectan sensibilización a un alérgeno, pero no predicen la importancia clínica. Tienen menor Sensibilidad que el Prick-test. Los tests de laboratorio más utilizados cuando los estudios in vivo no se pueden realizar. En los últimos años han mejorado notablemente las técnicas en: Reproducibilidad y fiabilidad ligados a la automatización. Presentan variación en la concentración de IgE en función del alérgeno. Resultados negativos en respuestas no mediadas por IgE. Sueros con alta concentración de IgE total pueden determinar Falsos + por interacciones no inmunológicas con el alérgeno.

18 Tecnicas para Determinar IgE específica: 1. RAST (RadioAllergoSorbent Test) Fue la primer técnica utilizada para la detección de IgE específica. Muchos métodos modernos y automatizados derivan de esta técnica. El alérgeno de interés se une covalentemente a un disco de papel. Se coloca suero con IgE especifica de la muestra problema. Se añade Ac. anti IgE marcada con Radioisótopos formando un complejo que se lee en un contador gamma. La radiactividad generada es proporcional a la cantidad de IgE especifica. Se compara con la lectura obtenida de sueros de referencia. Método semicuantitativo que utiliza unidades arbitrarias de RAST/mL en una escala que va del 0 al 6, considerándose positivos los mayores a 3. No tiene buena Reproducibilidad. Costo elevado. Uso de material radiactivo.

19 2.EIA determiar IgE específica: La mas comercializada es CAP-System Método automatizado cuantitativo basado en la técnica de FEIA. Se utilizan conjugados anti-ige marcados con b-galactosidasa y un sustrato que produce un fluorocromo. Es mas Sensible que el RAST con igual Especificidad RIDA Allery Screen (Inmunoblot) Presenta 20 alérgenos pegados a la membrana de nitrocelulosa que se colocan en un canal de reacción. Se observa una reacción coloreada que da lugar a la aparición de una banda cuya intensidad se lee en un escáner, el cual cuantifica la señal.

20 Deteminación de IgG específica. La detección de Ac Ig G específicos frente a múltiples alimentos se puede medir en en laboratorio con técnicas modernas y diversas cuando se plantean reacciones de hipersensibilidad no mediadas por IgE. No se han sometidos a estudios rigurosos por lo que se desconoce si el resultado de las pruebas predicen o descartan enfermedades alérgicas. Actualmente se desconoce el significado de que algunos individuos posean concentraciones altas de estos Ac. frente a ciertos alimentos, ya que pueden encontrarse en sujetos normales así como en pacientes con otros trastornos digestivos (ej. colon irritable). Además, los resultados de dietas de eliminación de alimentos específicos en función de valores obtenidos por IgG son muy variables y por ahora no se encuentra un beneficio derivado de ellos, por lo que las Academias de Alergología Internacionales no recomienda estos estudios, ni las dietas de exclusión fundamentadas en ellas.

21 Test de Activación de Basófilos A partir del estímulo de los basófilos en sangre periférica con el alérgeno es posible detectar la presencia de IgE específica mediante varias técnica: * observación al microscopio de su degranulación, * medida de la cantidad de histamina liberada * detección de la activación por Citometría de flujo. La cuantificación por citometría de fluto de la activación in vitro de basófilos acopla procesos semejantes a los que suceden in vivo, como es la fijación de losa antígenos a la IgE de los receptores de la superificie de los basófilos. Cuando existe contacto los basófilos secretan una amplia variedad de mediadores bioactivos y generan la expresión de marcadores de activación en su membrana como el CD63 y CD203c. Mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-cd63 y CD203c marcados con fluorocromos se detectan aquellos basófilos activados Los mejores resultados de esta técnica se obtienen en el diagnóstico de alergias a medicamentos y donde los estudios de Ig E no ofrecen buenos resultados.

22 Test de Transformación Linfocitaria (TTL) Mide la proliferación de los linfocitos T de memoria en presencia de un Ag específico y la expresión de marcadores en su superficie. Utilidad en los estudios de hipersensibilidad reardada no mediados por IgE. Consiste en incubar la sangre entera con EDTA con el medicamento o sustancia potencialmente activadora y determinar posteriormente mediante Citometría del flujo el porcentaje de linfocitos CD69+, luego de la estimulación. El antígeno CD69 constituye uno de los primeros marcadores expresados por las células T activadas por una variedad de agentes mitogénicos o estiumulantes. El perfil de expresión de este antígeno de activación alcanza un pico máximo a las 8hs desde que se enfrentan los linfocitos con la droga a ensayar. En contraste, los marcadores expresados mas tarde, requieren de cultivo de tejidos e incubaciones largas (3-10dias) y son vulnerables a la distorsión de los resultados por artefactos in vitro. Es la técnica de menor uso por presentar una estandarización compleja, existe poco conocimiento sobre la concentración de antígenos necesaria en cada prueba, lo que puede generar que no se de una reacción celular adecuada (Falsos neg). La prueba es de alto costo. Estos factores restringen el uso en el laboratorio clínico de rutina.

23 Objetivo: evaluar validez, desempeño, seguridad y efectividad diagnóstica de técnicas inmunológicas in vitro para el estudio de alerginas a partir de 18 estudios entre los años 2000 y 2012.

24 METAANALISIS Del punto de vista inmunológico las pruebas de activación de basófilos e IgE específica deberían generar resultados similares en la tamización de alergias, debido al rol de las IgE en ambas. En una la Ig E específica se fija al antígeno implantado en una matriz donde se realiza la prueba de identificación, mientras que en la activación de basófilos la IgE se fija a la superficie de los mimos, permitiendo la reacción con alérgenos específicos. En la determinación de IgE específica, la sensibilidad global fue 72% y Especificidad 90%. La prueba de activación de basófilos mostró una sensibilidad 78% y una Especificicad 95%. El trabajo concluye que ambas pruebas son de gran utilidad clínica y diagnóstica en la medida que discriminan de forma correcta a las personas sanas de las enfermas. No se dispone de un numero de estudios suficientes en TTL para extraer resultados concluyentes.

25 Microarrays de alergenos El diagnóstico molecular por Biochips o Microarrays desarrollado para proteinas en año Diferencia la sensibilización frente a cada proteína, o alergenos (recombinante o naturales purificados)de elevada pureza y calidad fijados en el microchip usado como soporte (análisis molecular). Esto mejora la reproducibilidad y la precisión que los métodos convencionales de fuentes alergénicas completas Se basa en la hibridación de macromoléculas de IgE específica marcada frente a determinados componentes moleculares de varios alérgenos. Muy importante en pacientes que presentan múltipes alergias o sensibilizaciones, donde ayuda a conocer exactamente a qué molécula es alérgico. El diagnóstico desglosado de los componentes de los podría ayudar a conocer mejor los fenómenos de reactividad cruzada.

26 Microarrays El prototipo ISAC comercializado por Phadia es el primer microarray de plroteínas aplicado a la detección de Ig E específica compuesto con 103 alérgenos. Requiere solo 50 microlitros de sangre. Todavía se requieren ensayos de validación con poder estadístico metodológico para validar esta técnica. La composición de los paneles debe adecuarse para ciertas áreas geográficas. La evaluación de la Sensibilidad y Especificidad y Puntos de corte para cada alérgeno en series de pacientes verdaderamente alérgicos y en controles para cada proteína respresentada en el microarray constituye una necesidad real para situar esta prometedora herramienta en su justo lugar en en el diagnóstico alergológico en general y particularmente en las alergias alimentarias.

27 Reactividad cruzada Cuando una proteína distinta al alérgenos que originó la sensibilización genera un resultado positivo tanto in vitro como in vivo. Esto se basa en la similitud entre la superficie molecular de las lproteínas homólogas. Sin embargo se han descrito reacciones cruzadas entre especies no relacionadas filogenéticamente que comparten proteínas altamente conservadas en el reino animal y vegetal (panalérgenos). Hoy en día se conocen varios alérgenos responsables de reactividad cruzada entre alimentos, que se traduce en alergia asociada a varios miembros de una familia de alimentos relacionada taxonómicamente y también entre especies distantes con distintas vías de exposición como ocurre entre ácaros y mariscos, pólenes y alimentos vegatales o entre el látex y frutas. El análisis molecular por microarrays ha comprobado que los pacientes con IgE frente a epitopes lineales padecen alergias persistentes a alimentos y reacciones más graves que aquellos que poseen únicamente IgE frente a epitopes conformacionales que evolucionan a la tolerancia del alimento en menos tiempo. No debemos olvidar que los tests in vitro deben ser evaluados junto con la historia clínica del placiente ya que una sensibilización (detectada in vitro por la presencia de IgE específica) no implica necesariamente una respuesta clínica frente a dichos alérgenos.

28 MUCHAS GRACIAS