Anticuerpos anti HLA

Transcripción

1 Anticuerpos anti HLA Métodos de Detección TM. Manuel Jimenez S. Laboratorio de Histocompatibilidad Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles Departamento Laboratorio Biomédico

2 Introducción Las técnicas de Histocompatibilidad en el trasplante de órganos sólidos ha ido evolucionando desde que la técnica de Crossmatch fue descrita por primera vez por el Dr. Paul Terasaki. Sin embargo, el objetivo final de estas técnicas se mantienen inalterables en el tiempo: Entregar una estimación confiable del riesgo inmunológico de un receptor para trasplante, en el contexto de sus potenciales donantes, como un complemento a la evaluación clínica. De esta manera se hace imperativo para los servicios clínicos entender la compleja e interactiva naturaleza de las técnicas disponibles en el laboratorio de Histocompatibilidad.

3 Anticuerpos anti-hla Los anticuerpos HLA específicos presentes en el receptor al momento del trasplante o que se desarrollan como producto de este, son serios factores de riesgo que disminuyen la función del injerto y la sobrevida del paciente. Hasta un tercio de los pacientes en lista de espera para trasplante poseen anticuerpos preformados anti HLA. Francia 25% Chile > 50% PRA E. Unidos 32% (2007) 30% J Am Neprhrol 21: , 2010 (2008) 26.5% (2009) 26.9% (2010) 29.7 % Trasplantation Proceedings, 43, (2011)

4 Vías de sensibilización Receptores de trasplante pueden sensibilizarse por tres vías: Transfusiones Embarazos Trasplantes previos Vacunas, Infecciones bacterianas, virales, fúngicas

5 Métodos de detección Técnicas celulares Técnicas de fase sólida -PRA CDC (anticuerpos linfocitotóxicos) -Crossmatch CDC -Crossmatch Citometría de Flujo -ELISA - Flow PRA -Lúminex (X-MAP)

6 Detección de anticuerpos linfocitotóxicos PRA-CDC El suero a estudiar se enfrenta a un panel celular. Corresponden a linfocitos tipificados para antígenos HLA ABDR. Estos linfocitos son conservados en nitrógeno líquido a -192ºC. Este panel debe ser representativo de la distribución de antígenos HLA de la población. Detecta la presencia de anticuerpos linfocitotóxicos anti HLA clase I.

7 El suero del receptor es mezclado con los linfocitos del panel en pocillos individuales. Se añade complemento y un colorante vital. Si el suero posee anticuerpos que se unen a la superficie celular con suficiente densidad: se activa el complemento. Se produce la muerte celular que es identificada mediante el colorante vital. Se lee en microscopio

8 Lectura de Placas de PRA-CDC 1 Reacción (Negativa) 2 Reacción 4 Reacción (Negativa) (Positiva) 0-10%Células muertas 11-20%Células muertas 21-50%Células muertas 6 Reacción (Positiva) 8 Reacción (Positiva) 51-80%Células muertas %Células muertas

9 Nº de células con reacción positiva x 100 % de PRA Nº total de células del panel Interpretación CDC c/s DTT

10 VENTAJAS -Criticada por su baja sensibilidad, el PRA es una medida de la sensibilización anti HLA. -Es un indicador útil para estimar el riesgo de rechazo agudo y potencial rechazo hiperagudo. -Es una buena técnica para detectar Ac IgG que fijan complemento (IgG1-IgG3). -Equipamiento sencillo -Bajo costo en comparación con otras técnicas. -Refleja mejor que otros test la situación que ocurre en vivo. DESVENTAJAS -El % de PRA en un mismo paciente puede variar dependiendo del panel que se esté usando, lo cual no significa un cambio en la cantidad de anticuerpo. -Paneles comerciales pueden no necesariamente representar la frecuencia HLA de la población. -Baja sensibilidad -Falsos positivos resultantes de la participación de anticuerpos no HLA, autoanticuerpos (anticuerpos IgM) - Falsos negativos en el caso de bajos títulos de anticuerpo (no se activa el complemento)

11 Detección de Anticuerpos anti-hla por métodos de fase sólida Estas metodologías de fase sólida utilizan únicamente moléculas de HLA solubles o recombinantes. Ofreciendo así la disponibilidad de discriminar entre anticuerpos anti HLA de los no HLA, como también discriminar entre anticuerpos clase I de Clase II.

12 -Las moléculas purificadas de HLA se encuentran adheridas a medios de fase sólida (plataformas ELISA) o a microesferas (Lúminex o Flow PRA). -Estas unirán sólo anticuerpos anti HLA presentes en el suero del receptor. -Para detectar estos anticuerpos unidos al antígeno purificado, se utiliza un conjugado enzimático (ELISA) o un conjugado de anticuerpos anti IgG marcados con un fluorocromo. (microesferas) -Esta detección de anticuerpos anti HLA se reflejará por densidad óptica (ELISA) o detección de fluorescencia (microesferas). Estas últimas pueden ser analizadas por Citometría de flujo (Flow PARA) o sobre la plataforma de Lúminex.

13 Lúminex Tecnología XMAP

14 Tecnología XMAP

15 Tecnología XMAP Red laser reads the bead, i.e. the target Green laser detects the amount of the target

16 Detección de Anticuerpos anti HLA Lúminex Screening: Determina cualitativamente Clase I y/o II entregando resultados: Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase I Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase II Especificidad ID Especificidad Clase I 50 haplotipos de diferentes individuos Especificidad Clase II 30 haplotipos de diferentes individuos Especificidad con Antígenos Individuales Single Clase I 93 antígenos purificados de líneas celulares Single Clase II 70 antígenos purificados de líneas celulares

17 Estudio con Antígenos Individuales

18 Luminex Single / PRA virtual Programa de calculo de PRA utilizando la frecuencia de antígenos HLA ABDR en la población cadavérica donante de órganos en Chile

19 Ejemplos R1 vpra: 5% Anti: A25, A34, A43, A66, B37, DR103 R2 vpra: 62% Anti: A2, DR4 R3 vpra: 0% Anti DQ2, DQ4, DQ5(1), DQ6(1), DQ8(3)

20 Anticuerpos anti HLA en Luminex Ventajas Discrimina entre anticuerpos anti HLA clase I y II Detecta Anticuerpos fijadores y no fijadores de complemento Permite análisis complejos perfiles de anticuerpos en pacientes hipersensibilizados Otorga la posibilidad de definir mismatch aceptable y no aceptables Crossmatch Virtual Eficaz herramienta monitoreo post trasplante

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22 Basic Histocompatibility Testing Methods, Kathryn J. Tinckam,

23 Crossmatch En 1969 un artículo publicado por Patel y Terasaki, demostraron inequívocamente que el factor de mayor riesgo en el rechazo hiperagudo en el trasplante de órganos sólidos, fue la presencia de DSA en el suero del receptor. Esto se convirtió en el mayor descubrimiento para los Laboratorios de HLA, estableciendo el Crossmatch citotóxico en LT como un requisito técnico antes de trasplantar. Resultados positivos se establecieron como una contraindicación a trasplantar. La técnica original poseía una estimación de falsos positivos de un 20%, demostrando que no era los suficientemente especifica ni sensible para detectar los anticuerpos relevantes. Desarrollando a través del tiempo ensayos que fueran solucionando estas limitantes.

24 Crossmatch por citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) -El Crossmatch corresponde a una reacción entre el suero de receptor y los linfocitos del donante en presencia de complemento y colorante vital. -Al igual que en Screening citotóxico, el resultado es considerado positivo si una considerable población celular muere con la activación del complemento. -Frente a la problemática de la incapacidad de detectar bajos títulos de anticuerpos, se han hecho mejoras para mejorar su sensibilidad. Así, la globulina anti humana (AHG), es añadida a la reacción, la cual se une a los ac unidos en la superficie celular, aumentado la densidad permitiendo que el complemento se active.

25 Interpretación Resultados de XM CDC Linfocitos T (AHG) Linfocitos B Anticuerpos presentes Negativo Negativo No se detectan ac. contra antígenos HLA del donante. Positivo Positivo Ac. Anti HLA clase I Ac. Anti HLA clase I y II Ac. No-HLA Negativo Positivo Ac. Anti HLA clase II Ac. Anti HLA clase I débil. Ac. No-HLA Positivo Negativo Probablemente Ac. No-HLA Contraindica Trasplante

26 Crossmatch por Citometría de Flujo -Fue descrito por primera vez en Detecta anticuerpos independiente de si fijan o no complemento. -A la incubación de células y suero se le añade un conjugado de ac anti IgG humana y fluorocromo, el cual se unirá solo a los ac unidos a la superficie celular. -Anticuerpos dirigidos contra proteínas especificas de linfocitos T Y B marcados con distintos fluorocromos pueden ser añadidos permitiendo definir célula blanco. -Los resultados son expresados como positivo o negativo basados en la diferencia de fluorescencia entre el suero paciente y el suero control negativo.

27 Linfocitos T Expresión de resultados: Linfocitos B Diferencia de fluorescencia

28 Valores de referencia positividad Alo Crossmatch Citometría de Flujo- ISP. Mediana +2DS Sangre, Ganglio, Bazo RMF MESF LT CD3 + > 1.0 > 1876 LB CD19 + > 2.0 > 4595 RMF: Ratio en Mediana de Fluorescencia: Suero Paciente/Suero Control Negativo

29 Ventajas de FCXM Sensibilidad, 5-10x sobre XM-CDC/AHG Se analiza mayor número de linfocitos con mayor pureza. Puede cuantificarse la concentración de los anticuerpos que producen positividad (ratio- MESF) Detecta anticuerpos fijadores, y no fijadores de complemento Detecta bajos niveles de anticuerpos Utilidad en receptores de riesgo inmunológico

30 Interpretación de los resultados Transplatation Reviews, 23 (2009) 80-93

31 Drogas Inmunosupresoras Interferencias en FCXM Resultado Falso Positivo/Negativo Modificación FCXM Tymoglobulina LT Beads M-280 Rituximab LB Aumento Concentración Pronasa IgIV LT/LB Aumento Lavados post incubación Anticuerpos NO HLA Resultado Falso Positivo Modificación FCXM Autoanticuerpos (IgG) LT/LB Auto XM Agregados de IgG LB Inactivación suero 56ºC

32 Basic Histocompatibility Testing Methods, Kathryn J. Tinckam,

33 DSA: Relevancia Clínica El reciente desarrollo de las técnicas de fase sólida para la detección de anticuerpos ha mejorado la resolución y la especificidad de los resultados. Es importante que interacción de todas estas técnicas permitan determinar la relevancia clínica de los resultados, identificando el impacto real en la sobrevida del injerto.

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35 -92 XM -52 sueros -Fuerte correlación FCXM vs. MFI - >3000 MFI FCXM (+)

36 Correlación de resultados en la detección de anticuerpos anti HLA entre el Crossmatch por Citometría de Flujo y Lúminex. Laboratorio de Histocompatibilidad Departamento Biomédico Instituto de Salud Publica de Chile

37 FCXM Donante Vivo FCXM Positivos FCXM Negativos DSA= 46 (93.9%) No DSA= 3 (6,1%) DSA= 1 (0,4%) No DSA= 265 (99.6%) FCXM Donante Cadáver FCXM Positivos FCXM Negativos DSA= 24 (75.0%) No DSA= 8 (25,0%) DSA= 3 (3,1%) No DSA= 94 (96.9%)

38 Conclusiones del Trabajo Del análisis general de los datos, se puede observar una buena correlación entre el estudio de anticuerpos y el FCXM. En el 98,9 % de los casos frente a FCXM (-) no se detectaron DSA. En 87,8 % de los casos un FCXM (+) se correlaciona con la detección de DSA por Lúminex en el suero del receptor. De las discrepancias observadas, principalmente por FCXM Falsos Positivos, al correlacionarlos con antecedentes clínicos y otros elementos diagnósticos de laboratorio, disminuyen de un 2,5% (11 casos / n=444) a un 1% (4 casos / n=444).

39 Conclusiones Cada test en el laboratorio de Histocompatibilidad posee sus propias fortalezas y debilidades, pero ningún test puede predecir por si solo el riesgo inmunológico del trasplante. Los valores de cutoff establecidos por cada laboratorio no indica relevancia clínica del anticuerpo Incluyendo en nuestros resultados, garantías de calidad y una mejora constante en las técnicas de histocompatibilidad, el laboratorio sigue teniendo el marco ideal para involucrar los resultados de sus ensayos directamente con la práctica clínica El Laboratorio de Histocompatibilidad tiene el compromiso de seguir evolucionando de un laboratorio de Crossmatch a uno capaz de proveer mejores elementos para el aseguramiento del riesgo inmunológico al equipo clínico.

40 Gracias