ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE

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1 MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº34 ISABEL ARIAS BUSTAMANTE OMAR CACERES REY EDUARDO SALAZAR LINDO MARIA LUZ ZAMUDIO ROJAS JOSE CARLOS HUGUET TAPIA [2000]

2 EDAD TITULO DE LA INVESTIGACION CODIGO OGITT: ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES ISABEL ARIAS BUSTAMANTE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS , Capac Yupanqui 1400, Jesús María, iarias@ins.gob.pe OMAR CACERES REY INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS , Capac Yupanqui 1400, Jesús María. EDUARDO SALAZAR LINDO HOSPITAL NACIONAL CAYETANO HEREDIA , Honorio Delgado. San Martín de Porres MARIA LUZ ZAMUDIO ROJAS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS , Capac Yupanqui 1400, Jesús María. JOSE CARLOS HUGUET TAPIA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS , Capac Yupanqui 1400, Jesús María. 2

3 EDAD RESUMEN La presencia y el rol de Escherichia coli Enteropatógena y Enteroagregativa, en diarrea persistente es desconocido en el Perú. A pesar que en el ámbito mundial se ha detectado alguna relación de esta bacteria con cuadros de diarrea, sobre todo persistente; en el Perú, éste patógeno no es considerado por muchos laboratorios como agente infeccioso importante, desconociéndose de ésta manera la prevalencia de éste agente en la población infantil. El presente estudio tiene como objetivo describir la frecuencia de E. coli Enteropatógena (EPEC) y Enteroagregativa (EAEC), en pacientes menores de cinco años con diarrea persistente, tipificando los aislamientos de EPEC y EAEC aislados de los diversos grupos de diarreas y establecer una correlación con la clínica. Se establecieron dos grupos de estudio, uno en el cual presentaron características de diarrea persistente y el otro grupo con diarrea aguda, con la finalidad de comparar frecuencias de E.coli. La metodología empleada en el estudio fue el cultivo microbiológico, serotipificación y análisis molecular mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ). Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de factores de virulencia ( Eagg ) en un % para la categoría de E. coli diarreogénica Enteroagregativa, en una población con diarrea persistente. Se obtuvo el % para los factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa en diarrea aguda. También se encontraron los factores de virulencia ( eae, bfp ) de la categoría de E. coli Enteropatógena en el 6.79 % y 4.12 %, dentro de la población con diarrea persistente y aguda respectivamente. 3

4 EDAD INTRODUCCION La diarrea persistente es considerada en la actualidad como un problema en salud publica, afectando niños menores de cinco años y principalmente lactantes(1). Se estima que anualmente, alrededor de unos 2,2 millones de niños mueren por deshidratación debido a la diarrea persistente que con frecuencia se agrava debido a la desnutrición (1y 2). En el Perú, se considera a la diarrea en todas sus formas como un problema grave, siendo los cuadros persistentes muy comunes asociados a diferentes factores, tales como fisiológicos y nutricionales del paciente, antecedentes de diarreas continuas y el factor infeccioso (1). La presencia específica de organismos patógenos en diarrea persistente ha sido demostrada en varias oportunidades, postulándose de esta manera al factor infeccioso como un importante condicionante dentro del cuadro de diarrea persistente en población infantil (9, 11, 12). En la actualidad se reconoce que E. coli Enteropatógena y E. coli Enteroagregativa, pueden estar involucradas y ser un importante factor en diarrea persistente en población infantil (9,11,12). Numerosos estudios de casos y controles han demostrado una mayor frecuencia tanto de E. coli Enteropatógena como Enteroagregativa en pacientes con diarrea persistente que otros cuadros de diarrea (1, 9, 10). Sin embargo, en el Perú la presencia de E. coli en coprocultivos es mal interpretada ya que se piensa que es una bacteria de flora normal y se ignora el verdadero potencial patogénico. De esta manera, queda un vacío de información acerca de la frecuencia con que E. coli Enteropatógena es asociada a cuadros de diarrea persistente, produciéndose además que la etiología real de una diarrea puede ser sesgada. En la actualidad las técnicas rutinarias realizadas en el Perú para identificación de E. coli no pueden distinguir con facilidad una bacteria patógena o no patógena. Adicionalmente, se ha observado que en los Centros de Salud existe una confusión en la definición de categoría patogénica de E. coli. A pesar que en las 4

5 EDAD últimas convenciones internacionales en microbiología se reconoce y se define a E. coli enteropatógena como aquella bacteria que posee dos genes específicos: el de la intimina (AE) y el de la fimbria (bfp), dejando a la serotipificación como un análisis referencial y no concluyente (13); en muchos centros de Salud se cree aun que el serotipo justifica la patogenicidad de esta bacteria. En consecuencia se reportan en muchos casos E. coli enteropatogena sólo teniendo en cuenta el serotipo y sin haber analizado la real patogenicidad de esta bacteria. Como resultado final de esta confusión, el tratamiento de la diarrea se basa con frecuencia sólo en la experiencia clínica, sin detectar al agente etiológico responsable del cuadro diarreico, teniéndose una información sesgada del problema. Se encuentran además escasos registros detallados acerca del estudio de E. coli enteropatógena, quedando un vacío de información acerca de la epidemiología de esta bacteria en el Perú. La E. coli enteroagregativa (EAEC) fue descrita por Cravioto y col, mediante el análisis de biopsias en microscopía electrónica (14). En estos análisis se observó un fenómeno de adhesión de las bacterias al epitelio intestinal con un patrón característico de agregación, formando además una película o Biofilm sobre el epitelio. Este mecanismo de adherencia más la presencia de una citotoxina característica de la bacteria produce un cuadro de diarrea (15). La identificación de esta bacteria se realiza principalmente por el cultivo celular del aislamiento, tratando de repetir el fenómeno producido in vivo (16). Sin embargo la metodología resulta un poco complicada de realizar por todos los laboratorios así que en la actualidad se emplean técnicas de amplificación molecular dirigidas a los genes característicos de esta bacteria, principalmente el gene de la adherencia y de la citotoxina (17). A pesar de las nuevas metodologías, el problema de identificación de EAEC persiste y no esta resuelto, ya que laboratorios locales no tienen capacidad para desarrollar técnicas moleculares o de cultivo celular. Una alternativa para el diagnostico primario de esta bacteria es la correlación clínica, epidemiológica y la 5

6 EDAD confirmación con el test de formación de Biofilm en tubo. Este método fue descrito por Albert (18). Objetivo General.- Describir la frecuencia de Escherichia coli enteropatógena (EPEC ) y E. coli enteroagregativa (EAEC), en diarrea persistente, de las cepas aisladas de muestras de niños menores de 5 años. Objetivos específicos.- - Encontrar frecuencias de EPEC y EAEC en pacientes con diarrea persistente mediante PCR y PCR Multiplex. -Tipificar los aislamientos de EPEC y EAEC aislados de los diversos grupos de diarreas por serologia. 6

7 EDAD MATERIAL Y METODOS Debido a que no se tiene mayor información sobre frecuencias de EPEC o EAEC en el Perú, se realizó un estudio de tipo descriptivo. El universo considerado en la población fueron niños menores de 5 años que asistieron al Hospital Cayetano Heredia de la DISA Lima Norte y Hospital Sergio Bernales - Collique. Se establecieron dos grupos de estudio, el primero que estuvo conformado por pacientes (niños igual o menores de cinco años) que presentaron diarrea persistente, teniendo en cuenta los criterios de Inclusión (Ver Anexo) Adicionalmente se captaron pacientes con diarrea aguda, tomando en cuenta también algunos criterios de inclusión (Ver Anexo). De esta manera se formaron dos grupos: el grupo de estudio (con diarrea persistente) y el grupo de comparación o contraste (con diarrea aguda ). Se evaluaron 103 muestras de pacientes que cumplieron la definición de diarrea persistente. El grupo de comparación conformado por 97 muestras de pacientes que cumplieron la definición de diarrea aguda. Obtención de muestra La toma de muestra se realizó mediante hisopado rectal, el hisopo fue colocado en medio de transporte Cary blair. La muestra fue tomada por el encargado del servicio y remitida al Laboratorio de Enteropatógenos INS, para ser procesada de inmediato. Envío de muestras al INS Las muestras en Cary Blair, fueron enviadas al INS acompañadas de la ficha clínico epidemiológica del paciente a excepción del Hospital Sergio Bernales que remitió el agente aislado de la muestra, el mismo que fue remitido en medio de mantenimiento de Tripticase soy agar, con la ficha respectiva. Procesamiento de Muestras: Se procedió al aislamiento e identificación del agente, orientándose a buscar principalmente E. coli enteropatogena clásica (EPEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC); utilizando medios selectivos y diferenciales. 7

8 EDAD Para E. coli enteropatógena clásica se realizó serología con antisueros polivalentes y monovalentes para serotipos asociados a EPEC; mientras que para EAEC se realizó la prueba de formación de biofilm, utilizando caldo Muller Hinton. Detección de factores de virulencia de EPEC o EAEC Los aislamiento de E. coli encontrados en cada grupo fueron procesados mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ), para lo cual se procedió a realizar los siguientes pasos: Aislamiento de ADN.- La extracción de ADN, se realizó mediante CHELEX 100 al 5 %, tomando una colonia de un cultivo de 24 horas, se suspendió en 200 ul.,de solución CHELEX, se agitó en vortex (10 segundos) y luego se incubó en baño maría a 60 ºC por 30 minutos, se agitó en vortex (10 segundos ) y se hirvió en baño maría por 10 minutos, agitamos nuevamente en vortex (10 seg) y centrifugamos a 12,000 rpm por 3 minutos, el sobrenadante fue sacado a otro tubo para realizar el PCR. El sobrenadante fue cuantificado espectrofotometría a 0.6 ug de ADN en un promedio aproximado de 0.3 ng/ml por cada muestra. Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ).- - Preparación del Master Mix.- Para ello utilizamos los siguientes reactivos, cuya concentración final de la reacción fue de 1x para el Buffer de Reacción, 1mM de Cloruro de Magnesio, 0.8 um para cada uno de los Primer EAgg EC F, Primer EAgg EC R, Primer Euer P1, Primer Euer P2, Primer bfp F, Primer bfp R, 100 um para la mezcla de nucleótidos, 2 ul de ADN y 1 U de Taq Gold ADN polimerasa, para 25 ul de volumen final de reacción. - El PCR fue realizado en un termociclador AMPLITRON II, donde los ciclos de amplificación fueron: 1 ciclo de denaturación inicial a 95 ºC x 10 minutos; 30 ciclos de 95 ºC x 40 segundos; 53 ºC x 1 minuto y 72 ºC x 1 minuto y una extensión final de 72 ºC x 10 minutos. Ocho microlitros fueron colocados en un gel de agarosa al 2 % en buffer TAE 1X, junto con 5 microlitros de un marcador de peso molecular. El gel fue sometido a electroforesis horizontal a 170 V por una hora, posteriormente fue teñido con una 8

9 EDAD solución de 0,5 ug/ml de bromuro de etidio por 15 minutos, los productos fueron visualizados en un transiluminador de luz UV (UVP) y luego fueron fotografiados usando un documentador de geles de la marca UVP. (Ver Foto) PCR-MULTIPLEX PARA E. coli ENTEROPATOGENA (EPEC) M RESULTADOS 920pb gen eae 320pb gen bfp M : marcador de Peso Molecular 100pb 1 : E.coli no EPEC 2 : EPEC eae +, bfp + 3 : E.coli no EPEC 4 : E.coli no EPEC 5 : E.coli no EPEC 6 : E.coli no EPEC 7 : E.coli no EPEC 8 : E.coli no EPEC 9 : E.coli no EPEC 10 : EPEC eae + 11 : E.coli no EPEC 12 : E.coli no EPEC 13 : E.coli no EPEC 14 : E.coli no EPEC 15 : E.coli no EPEC 16 : Control Positivo EPEC eae +, bfp + 17 : Control Positivo EPEC bfp + 18 : Control Negativo Klebsiella sp 19 : Control de sistema 9

10 EDAD A B PCR PARA E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC) M M pb gen eagg RESULTADOS A M : marcador de Peso Molecular 100pb 1 : E.coli no EAEC 2 : E.coli no EAEC 3 : EAEC eagg + 4 : E.coli no EAEC 5 : E.coli no EAEC 6 : EAEC eagg + 7 : EAEC eagg + 8 : E.coli no EAEC 9 : E.coli no EAEC 10 : E. coli no EAEC 11 : EAEC eagg + 12 : EAEC eagg + 13 : E. coli no EAEC 14 : E. coli no EAEC B M : marcador de Peso Molecular 100pb 1 : E.coli no EAEC 2 : EAEC eagg + 3 : EAEC eagg + 4 : E. coli no EAEC 5 : E. coli no EAEC 6 : E. coli no EAEC 7 : EAEC eagg + 8 : E. coli no EAEC 9 : E. coli no EAEC 10 : E. coli no EAEC 11 : E. coli no EAEC 12 : E. coli no EAEC 13 : E. coli no EAEC 14 : E. coli no EAEC 15 : E. coli no EAEC 16 : E. coli no EAEC 17 : E. coli no EAEC 18 : Control Positivo EAEC eagg + 19 : Control de sistema 10

11 EDAD RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de factores de virulencia ( Eagg ) en un % para la categoría de E. coli Enteroagregativa, de una población de 103 muestras procedentes de diarrea persistente. De 97 muestras con diarrea aguda se obtuvo el % para los factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa. También se encontraron los factores de virulencia (eae, bfp) correspondiente a la categoría de E. coli Enteropatógena en el 6.79 % y 4.12 %, para ambas poblaciones respectivamente. Dentro de la población con diarrea persistente encontramos otros agentes patógenos como Campylobacter (2.91 %), Aeromonas (1.94 %), Salmonella (0.97 %) y en un 7.76 % no se encontraron E. coli. En la población con diarrea aguda también se encontraron agentes patógenos como Campylobacter (5.15 %), Shigella (2.061 %) de igual modo hubieron muestras en las que no se aisló E. coli (10.30 %). Con respecto a los serotipos encontrados en la población con diarrea persistente obtuvimos el 9.70 % y % para la población con diarrea aguda. Lo obtenido en el estudio muestran valores relativamente bajos para las categorías de E. coli, motivo del estudio. Si comparamos ambos grupos encontramos que los resultados obtenidos son similares. Estudios realizados a nivel internacional revelan una frecuencia mayor de aislamientos de E. coli Enteropatogena y E. coli Enteroagregativa en diarrea persistente en comparación con otros cuadros clínicos de diarrea (9, 11, 12, 13) Los datos obtenidos servirán de base para establecer estudios que puedan identificar otras Categorías de E. coli, dentro de una población infantil a mediano y largo plazo y que puedan realizarse en el ámbito nacional y conocer la situación epidemiología de E. coli enteropatógena en el Perú. 11

12 EDAD REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Jacy C. Andrade, Cecilia Moreira, Ulysses Facundo-Neto. Diarrea persistente Journal de Pediatria. Supl S1/19. Año Bhandari MK, Bhan MK, Sazawal S. Mortality associated with acute watery diarrhea, dysentery and persistent diarrhea in rural North India. Acta Paediatr Suppl 1992; 381: Fauveau V, Henry FJ, Briend A, Yunus M, Chakraborty J. Persistent diarrhea as a cause of childhood mortality in rural Bangladesh. Acta Paediatr Suppl 1992; 381: Fagundes-Neto U, Scaletsky IC. The gut at war: the consequences of enteropathogenic Escherichia coli infection as a factor of diarrhea and malnutrition. Sao Paulo Med J 2000 Jan 6;118(1): Bhan MK, Bhandari N, Bhatnagar S, Bahl R. Epidemiology & management of persistent diarrhoea in children of developing countries. : Indian J Med Res 1996 Jul;104: Penny ME, Peerson JM, Marin RM, Duran A, Lanata CF, Lonnerdal B, Black RE, Brown KH. Randomized, community-based trial of the effect of zinc supplementation, with and without other micronutrients, on the duration of persistent childhood diarrhea in Lima, Peru. J Pediatr Aug;135(2 Pt 1): Evaluation of an algorithm for the treatment of persistent diarrhoea: a multicentre study. International Working Group on Persistent Diarrhoea. Bull World Health Organ. 1996;74(5): Lanata CF, Black RE, Maurtua D, Gil A, Gabilondo A, Yi A, Miranda E, Gilman RH, Leon-Barua R, Sack RB. Etiologic agents in acute vs persistent diarrhea in children under three years of age in peri-urban Lima, Peru. Acta Paediatr Suppl Sep;381:

13 EDAD 9. Nataro JP, Steiner T, Guerrant RL. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis 1998 Apr-Jun;4(2): Victora CG, Hutttly SR, Fuchs SC, Barros FC, Garenne M, Leroy. O et al. International differences in clinical patterns of diarrhoeal deaths: a comparizon of children from Brazil, Senegal, Bangladesh, and India. J Diarrhoeal Dis Res 1993; 11: Bhatnagar S, Bhan MK, Sommerfelt H, Sazawal S, Kumar R, Saini S. Enteroaggregative Escherichia Coli may be a new pathogen causing acute and persistent diarrhea. Scand J Infect Dis 1993; 25; Carvalho, Rozane de Lima Bigelli. Escherichia coli enteroaderente e diarréia aguda e persistente em crianças: um estudo prospectivo de casos e controles em Säo Paulo / Adherente Escherichia coli and persistent diarrhea in infants: a prospective study of cases and controls. Tesis de la universidad de Sau Paulo Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 1998 Jan;11(1): Cravioto, A., R. J. Gross, S. M. Scotland, and B. Rowe An adhesive factor found in strains of Escherichia coli belonging to the traditional infantile enteropathogenic serotypes. Curr. Microbiol. 3: Tzipori, S., J. Montanaro, R. M. Robins-Browne, P. Vial, R. Gibson, and M. M. Levine Studies with enteroaggregative Escherichia coli in the gnotobiotic piglet gastroenteritis model. Infect. Immun. 60: Nataro, J. P., J. B. Kaper, R. Robins Browne, V. Prado, P. Vial, and M. M. Levine Patterns of adherence of diarrheagenic Escherichia coli to HEp-2 cells. Pediatr. Infect. Dis. J. 6: Vial, P. A., R. Robins Browne, H. Lior, V. Prado, J. B. Kaper, J. P. Nataro, D. Maneval, A. Elsayed, and M. M. Levine Characterization of enteroadherent-aggregative Escherichia coli, a putative agent of diarrheal disease. J. Infect. Dis. 158:

14 EDAD 18.Albert, M. J., F. Qadri, A. Haque, and N. A. Bhuiyan Bacterial clump formation at the surface of liquid culture as a rapid test for identification of enteroaggregative Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 31: McDaniel, T. K., K. G. Jarvis, M. S. Donnenberg, and J. B. Kaper A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: Suzart S, Guth BE, Pedroso MZ, Okafor UM, Gomes TA. Diversity of surface structures and virulence genetic markers among enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) strains with and without the EAEC DNA probe sequence.fems Microbiol Lett Jul 24;201(2): Czeczulin JR, Whittam TS, Henderson IR, Navarro-Garcia F, Nataro JP. Phylogenetic analysis of enteroaggregative and diffusely adherent Escherichia coli. Infect Immun Jun;67(6): Pupo GM, Karaolis DK, Lan R, Reeves PR. Evolutionary relationships among pathogenic and nonpathogenic Escherichia coli strains inferred from multilocus enzyme electrophoresis and mdh sequence studies. Infect Immun Jul;65(7):

15 EDAD ANEXOS Criterios de Inclusión Pacientes con diarrea persistente Diarrea persistente de 14 días o más al tiempo de la primera evaluación, sin sangre visible en las deposiciones, durante las 24 horas posteriores a la admisión del Hospital). Pacientes con diarrea aguda Diarrea aguda que dura entre 3 y 7 días del tiempo de la primera evaluación No presentar sangre visible en cualquiera de las deposiciones pasadas dentro durante las 24 horas posteriores a la admisión al Hospital u observada por la persona que cuida al paciente, dentro de la 72 horas previas a la admisión No presentar sepsis clínica o cualquier otra condición clínica severa presente a la admisión o desarrollada dentro de las primeras 24 horas posteriores a la admisión, Ausente episodio de diarrea la semana previa al episodio actual Criterios de exclusión Pacientes con diarrea persistente Episodio actual que dura más de seis semanas al momento de la primera evaluación. Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas Pacientes con diarrea aguda Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas Paciente con diarrea disentérica o sanguinolenta. 15