PCR a tiempo real. Análisis de patógenos en alimentos. APPLUS+ Laboratorio de Genética

Transcripción

1 PCR a tiempo real. Análisis de patógenos en alimentos APPLUS+ Laboratorio de Genética

2 Índice 0_ Applus + 1_ Roche 2_ Real Time PCR 3_ LightCycler 480 4_ Detección de patógenos

3 Applus+ 00 Applus+ de un vistazo Applus+ es una compañía líder en certificación y servicios tecnológicos, y la primera multinacional española en el sector de la certificación Nuestro objetivo es ser el referente global en certificación, y para ello desarrollamos y creamos nuevos estándares con la ayuda de nuestros expertos profesionales y la aplicación de la última tecnología Applus+ está presente en los 5 continentes y ofrece su servicio en más de 25 sectores

4 Applus+. Laboratorio de Genética 01 Laboratorio de Genética Genética Vegetal Genética Animal Lo esencial es invisible a los ojos Genética Alimentaria Genética Humana

5 Applus+. Laboratorio de Genética 02 Servicios Genética Vegetal Marcadores de ADN aplicados a la agricultura Control de pureza híbrida Identificación de variedades (frutas, verduras y flores) Marker Assisted Selection (MAS) Plant Breeders Rights Protection (PBRP) Caracterización de bancos de germoplasma

6 Applus+. Laboratorio de Genética 03 Servicios Genética Animal La PCR aplicada al diagnostico veterinario Determinación del sexo en aves exóticas Detección de enfermedades Estudios de variabilidad genética Control de pedigríes

7 Applus+. Laboratorio de Genética 04 Servicios Genética Alimentaria Técnicas moleculares para el sector alimentario Transgénicos (detección, identificación y cuantificación) Identificación especies (carnes, pescados, leches y quesos) Detección alérgenos Control adulteraciones alimentarias Detección de patógenos (detección rápida, asesoramiento y formación, subministro de reactivos)

8 Applus+. Laboratorio de Genética 05 Servicios Genética Humana Preservar la historia genética familiar OBJETO del contrato: servicio de DEPOSITO, CONSERVACIÓN y CUSTODIA de muestras de tejido, y la posible realización de análisis y pruebas genéticas. Convenio de colaboración entre MEMORA y Applus+

9 Roche 1 Dos grandes áreas de negocio: Farma (80%) y Diagnostico (20%) Indianapolis Pleasanton/ Alameda Branchburg Branchburg Rotkreuz Basel Branford Burgdorf Barcelona Mannheim Penzberg Singapore Graz Tokyo Penzberg - Central - Marketing - Investigación - Produción Branford Life Sciences Rotkreuz -Desarrollo de instrumentos y producción Mannheim - Marketing - Industrial Business

10 1 Penzberg Roche Applied Science Centro de Excelencia Roche Penzberg: Establecido: Empleados: approx. 4,000 Uno de los más grandes centros biotecnológicos en Europa, que incluye las Divisiones de Diagnóstica y Farma 1972 (Boehringer Mannheim) Area: 85 hectareas Capital invertido: approx. 870 million

11 Roche Diagnostics Roche Diagnostics ESPAÑA DATOS: Con base en Sant Cugat del Vallès (Barcelona), es uno de los principales centros logísticos de Roche para Iberia y Latinoamérica. La empresa, que actualmente cuenta con más de 700 empleados, se instaló en España a principios del sxx y las instalaciones actuales se inauguraron en 2003.

12 2. Real Time PCR Revolución en el diagnóstico molecular. Amplificación de una secuencia específica del ADN. Uso de un tercer primer capaz de captar y emitir fluorescencia: Sonda. Detección de la amplificación ciclo a ciclo. Técnica altamente sensible

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14 2. Real Time PCR Ventajas de la RT PCR Mayor precisión, exactitud y sensibilidad. Amplificación del ADN y detección simultaneas. No requiere procesos post-pcr: - Evita contaminaciones post-pcr. Mayor rapidez en obtener resultados. Permite la cuantificación con estándares de concentraciones conocidas. Reacciones en uniplex y en multiplex

15 PCR a tiempo real: análisis de patógenos 3. Real Time PCR LightCycler 480 ROCHE

16 3. Real Time PCR LightCycler 480 ROCHE Bloques fácilmente intercambiables para placas de 384 y/o 96 pocillos. Termociclador de alta velocidad gracias al nuevo sistema thermabase: Rapidez y exactitud. Sistema óptico diseñado para garantizar la máxima sensibilidad y detección uniforme en toda la placa 5 filtros de excitación y 6 filtros de detección de fluorescencia: Detección en MULTIPLEX

17 3. Real Time PCR LightCycler 480 ROCHE TERMOBLOQUE Distribución uniforme de la temperatura en toda la placa: precisión en el análisis Rapidez: Placa 96 pocillos < 1h Placa 384 pocillos <40 minutos Cámara sellada al vacio saturada de líquido. Rápida tranferencia de calor por evaporación y condensación. Permite ciclar de forma rápida y precisa

18 3. Real Time PCR LightCycler 480 ROCHE LightCycler 480 Instrument Instrumento Estándar

19 DETECCIÓN DE PATÓGENOS POR PCR A TIEMPO REAL

20 4. Detección de patógenos Salmonella Listeria monocytogenes Campylobacter E.coli 0157:H7

21 4. Detección de patógenos Desarrollo del método Búsqueda de cebadores y sondas específicos. Cultivo de los microorganismos. Extracciones de ADN. Ensayos de especificidad, sensibilidad y compatibilidad de los cebadores y sondas.

22 4. Detección en UNIPLEX - Salmonella Lectura con el filtro Cyan500 Nº Especie Serovar Cepa CP 1 Salmonella enterica London CTC ,84 2 Salmonella enterica Schwarzengrund CTC ,84 3 Salmonella enterica Derby CTC ,99 4 Salmonella enterica Abony CECT ,57 5 Salmonella enterica Senftenberg CECT ,28 6 Salmonella enterica Infantis CECT ,18 7 Salmonella enterica Panama CECT ,69 8 Salmonella enterica Agona CECT ,05 9 Salmonella enterica Postdam CECT ,02 10 Salmonella enterica Virchow CECT ,90 11 Salmonella enterica Cholerasuis CECT ,51 12 Salmonella enterica Abortusbovis CECT ,39 13 Salmonella enterica Saint-Paul CECT ,25 14 Salmonella enterica Gallinarum CECT ,47 15 Salmonella enterica Gold-coast CECT ,07 16 Salmonella enterica Muenchen CECT ,56 17 Salmonella enterica Ohio CECT ,40 18 Salmonella enterica Arizonae CECT ,01 19 Salmonella enterica Enteritidis GN ,02 20 Salmonella enterica Typhimurium GN ,60

23 4. Detección en UNIPLEX - CONCLUSIONES Método muy específico. Sensible Reproducible Método rápido: Resultados en 24-48h, en comparación con los 7-10 días de la microbiología clásica. Automatizable

24 4. Detección en MULTIPLEX Una reacción Detección de 2 a 4 genes Aplicable a una gran variedad de campos: Detección de patógenos Determinación de especie en carnes Organismos Modificados Genéticamente Sondas marcadas con distintos fluorocromos Ahorro de tiempo Ahorro de costes y reactivos

25 4. Detección en MULTIPLEX Elección de Fluorocromos y cebadores Evitar: Solapamiento de fluorescencia Formaciones de estructuras secundarias entre cebadores.

26 4. Detección en MULTIPLEX Salmonella 1 única reacción Listeria E.coli 0157 Múltiples detecciones

27 4. Detección en MULTIPLEX - CONCLUSIONES Buen método de screening. Ahorro de tiempo Ahorro de costes Técnica sensible, específica y reproducible. Automatizable

28 4. Detección en MULTIPLEX - CONCLUSIONES LIMITACIONES ACTUALES Muestra positiva también en el caso de que el patógeno no esté vivo. Solución: PCR Cultivo microbiológico para confirmar las muestras positivas. REQUERIMIENTOS DE LA TÉCNICA Formación específica del personal. Equipo: LightCycler 480

29 MUCHAS GRACIAS Mireia Robles Ezquerro Applus+ Agroalimentario Análisis Genéticos Tel: ext.2531