PO-01 Análisis del estrés oxidativo y de la activación de caspasa-9 por citometría de flujo, en células HeLa tratadas con antitumorales

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2 Biotechnology PO-01 Análisis del estrés oxidativo y de la activación de caspasa-9 por citometría de flujo, en células HeLa tratadas con antitumorales Roberto Pariente (1,2), Javier Espino (1,2), Pilar Torralbo Jiménez (1), Rosa Carrillo del Cacho (1), Idoia Haut Antolín (1), Alberto Álvarez Barrientos (1) (1) Servicio de Técnicas Aplicadas a las Biociencias. (2) Departamento de Fisiología Animal. Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Badajoz. El proceso de apoptosis de muerte celular se puede activar canónicamente, por dos vías, la extrínseca a través de receptor y la intrínseca, que implica la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la salida del citocromo c y la formación del apoptosoma con Apaf-1 y datp. El apoptosoma activa la caspasa 9 y se desencadena el proceso de activación de enzimas que lleva a la rotura del ADN por la endonucleasa inespecífica. La pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la consiguiente activación de la apoptosis, suele venir precedida por un aumento del estrés oxidativo celular. En el caso de tumores, la inducción del estrés oxidativo mediante el uso de moléculas específicas, es el mecanismo preponderante en el desencadenamiento de la muerte celular. Por ello, es una necesidad el desarrollo de técnicas que estudien el modo de acción de los antitumorales de forma rápida y precisa. Pare ello hemos desarrollado un protocolo por citometría de flujo utilizando el MACSQuant VYB como plataforma. El MACSQuant VYB está equipado con un láser amarillo (561nm) que permite excitar perfectamente fluorocromos como la ficoeritrina o el rojo Texas. De esta forma, utilizamos el diacetato de dihidro-diclorofluoresceína (DCFH) para analizar el estrés oxidativo inducido por el antitumoral, que se excita a 488nm y emite a 525 nm. Un ligando de la caspasa 9 activada conjugado a sulforodamina. La sulforodamina se excita a 550 nm y emite a 580 nm, por lo que es excitada óptimamente por el láser de 561 nm del VYB. Por otro lado, utilizamos el Hoechst que puede ser excitado a 405nm y emite a 450 nm, para detectarlas células necróticas y apoptóticas tardías. De esta forma, utilizando los 3 láseres del VYB disminuimos los problemas de interferencia de emisiones de fluorescencia y permite relaizar el análisis muy rápido y con confianza. De esta forma, analizamos el efecto antitumoral del cisplatino, el 5-fluouracilo y la melatonina como antioxidante. Los resultados muestran cómo se puede relacionar el estrés oxidativo, con la aparición de la caspasa 9 activa y la muerte celular inducida por los antitumorales. 2

3 Biotechnology PO-02 Estudio de la muerte celular de linfocitos inducida por el estrés en trucha, usando el potencial de membrana mitocondrial como marcador Héctor J. Pula (1,2), Pilar Torralbo Jiménez (1), Rosa Carrillo del Cacho (1), Yolanda González Martín (1), A.B. Perales Casildo (1), Alberto Álvarez Barrientos (1) (1) (2) Servicio de Técnicas Aplicadas a las Biociencias, Universidad de Extremadura. Centro de Acuicultura Vegas del Guadiana, Badajoz. El análisis de la viabilidad y del contaje absoluto de las diferentes poblaciones sanguíneas es importante a la hora de entender el efecto del estrés y la enfermedad en peces. Las técnicas rutinarias de contaje leucocitario en sangre de mamíferos, implican la lisis de los eritrocitos. La presencia de eritrocitos nucleados en la sangre de peces impide la aplicación de las técnicas usadas en sangre de mamíferos con citometría de flujo. Generalmente, se utilizan técnicas microscópicas más complicadas de preparación, tediosas y que implican un mayor tiempo para la obtención del resultado. A pesar de que desde el año 2003 (Inoue et al, 2003) existen referencias utilizando la citometría de flujo para realizar contajes celulares en la sangre de peces, esta técnica sigue siendo poco utilizada, a pesar de sus evidentes ventajas. La detección del grado de estrés de los peces es un parámetro muy importante para detectar disminuciones de producción piscifactorías. Aquí presentamos la utilización de la citometría de flujo para detectar el efecto que el estrés puede tener en la viabilidad de las poblaciones sanguíneas y establecer un parámetro rápido y fiable para obtener el grado de estrés que han sufrido los animales. Para ello, utilizamos un fluorocromo que mide el potencial de membrana mitocondrial que es capaz de diferenciar las poblaciones leucocitarias de los eritrocitos (Inoue et al, 2003). Nosotros utilizamos TMRM que es un catión lipofílico que tiñe casi selectivamente la membrana mitocondrial. El TMRM emite fluorescencia a una longitud de onda de 573 nm al ser excitado a 549 nm. Utilizamos un citómetro de flujo MACSQuant VYB equipado con un láser que emite a 561nm que permite aumentar la sensibilidad de la detección. De esta forma, podemos discriminar las diferentes poblaciones leucocitarias de trucha (linfocitos y trombocitos, neutrófilos, basófilos y monocitos) y detectar cómo afecta el estrés de forma diferencial. Además, la capacidad de contaje directo del MACSquant, permite obtener el resultado de forma instantánea. Se ha estudiado el efecto del calor y la manipulación, comprobándose que el efecto sobre la viabilidad es específico de población. 3

4 Biotechnology PO-03 8-color FCM protocol for immune-monitoring of polyfunctional cytomegalovirus-specific cellular immune responses and CMV recurrence in liver transplantation for chronic hepatitis C virus infection Ângela Carvalho-Gomes (1,2), Victoria Aguilera (1,2), Carmina Pallarés (1), Martín Prieto (1,2), Marina Berenguer (1,2,3), F. Xavier López-Labrador (4,5) (1) Servicio de Hepatología y Trasplante Hepático, Hospital Universitari La Fe, Valencia. (2) CIBERehd, Instituto de Salud Carlos III, Madrid. (3) Department of Medicine, Universitat de Valencia. (4) Virology Laboratory, Genomics and Health Area, Fisabio-Salud Pública, Conselleria de Sanitat, Valencia. (5) CiberEsp, Instituto de Salud Carlos III, Madrid. Introduction: There are few studies available quantifying cytomegalovirus (CMV) CMV-specific T cell-mediated immunity in the context of liver transplantation (LT), particularly for LT due to end-stage chronic hepatitis C virus (HCV) infection. It is not clear if CMV-specific T-cell responses could result in an inadequate control of HCV replication post-transplantation. Among T-cell functional assays, Intracellular cytokine staining (ICS) allows detection of polyfunctional T-cells simultaneously secreting several cytokines. We aimed at developing a reliable ICS FCM protocol for immune-monitoring of CMV-specific T-cell responses and their polyfunctional activity after LT. Methods: PBMCs isolated from LT recipients with recurrent HCV infection were tested for different stimulation conditions, including different CMV peptide pools (pp65, IE-1, IE-2), presence of co-stimulation antibodies CD28/49d, use of live-dead stain, CD107a, and CD69 as activation marker. PBMCs were stained for CD3, CD4, CD8 and CD69, and thereafter for intracellular IFNg and TNFa. Finally, cells were washed, fixed and stored at 4ºC until acquisition on a FacsCantoII flow cytometer (BD-biosciences). T lymphocytes with mono-, bi- and tri-functional profiles were identified using FlowJo software (TreeStar). Results: CMV-specific CD4+ and CD8+ T-cell responses were easily detected, suggesting enough sensitivity for monitoring immune-reconstitution after LT. CMV-specific CD4+ and CD8+ T-cell responses were detectable to all peptide pools (pp65, IE-1, and IE-2). The assay discriminated well CMV-specific T-cells producing single cytokines (from 1% up to >40% of CD4+ or CD8+ T-cell populations) as well as polyfunctional subpopulations, in particular CD8+IFNg+CD107a+ and CD8+ TNFa+CD107a+. Although the benefit of co-stimulation antibodies CD28/49d was not very clear, use of live-dead stain plus CD69-gating significantly enhanced the results. Conclusion: We developed and 8-color FCM protocol for immune-monitoring of CMV-specific T-cell responses and their polyfunctional activity after liver transplantation. This assay can be used to evaluate the role of the CMV-specific T-cell response with (i) the control of CMV reactivation, and (ii) with the outcome of recurrent hepatitis C infection after LT. 4

5 Microbiology PO-04 Efectos a corto plazo del herbicida atrazina sobre la microalga Chlamydomonas reinhardtii Marta Esperanza, Marta Seoane, Carmen Rioboo, Concepción Herrero, Ángeles Cid Laboratorio de Microbiología, Departamento de Biología Celular y Molecular. Universidad A Coruña. Introducción: La atrazina, debido a su uso generalizado como herbicida, es uno de los contaminantes orgánicos más frecuentes en los suelos agrícolas y en las aguas subterráneas y de superficie. Debido a su alta persistencia y toxicidad este biocida ha sido recientemente incluido en la lista de sustancias prioritarias de la Directiva Marco del Agua (DMA) de la Comisión Europea (Directiva 2013/39/CE) como una nueva sustancia peligrosa en los medios acuáticos de la Unión Europea. Por lo tanto, parece necesario evaluar los riesgos ambientales de la atrazina, incluyendo sus efectos sobre los organismos no diana, como son las microalgas, principales productores primarios de los sistemas acuáticos. La finalidad de este estudio es profundizar en el conocimiento de la citotoxicidad de este herbicida en células de C. reinhardtii después de 3 h de exposición a concentraciones crecientes de atrazina. Material y métodos: Se establecieron cultivos control, libres de pesticida, y cultivos expuestos a diferentes concentraciones de atrazina en condiciones de luz y temperatura controladas. Las concentraciones de atrazina utilizadas se corresponden con valores que oscilan entre una EC50 y una EC90 a 96 horas para el crecimiento (0,25; 0,5 y 1 µm). Utilizando diferentes protocolos de citometría de flujo (CMF) se cuantificó el efecto de dicho herbicida sobre diferentes parámetros: viabilidad celular, autofluorescencia de la clorofila a (como medida de la actividad fotosintética), actividad esterasa inespecífica (como medida de la actividad metabólica de la célula), niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y potencial de membrana mitocondrial. Resultados: Los resultados obtenidos reflejan que la atrazina provoca daños en las células de C. reinhardtii a todos los niveles analizados, siendo el daño más severo en los cultivos expuestos a las concentraciones más altas del herbicida. La atrazina provocó un descenso de la autofluorescencia de la clorofila a y de la actividad metabólica, un incremento de la producción de ROS y una hiperpolarización de la membrana mitocondrial. Sin embargo, la viabilidad celular no se vio afectada significativamente (p > 0,05) con respecto al control en ninguna de las concentraciones ensayadas, siendo el porcentaje de células viables siempre superior al 98%. Conclusiones: A pesar de los cambios observados a nivel celular, los resultados sugieren que las células, después de 3 horas de exposición a estos niveles de atrazina, son capaces de superar el estrés producido y mantener su viabilidad celular, por lo que muestran una gran adaptabilidad a las condiciones adversas. Agradecimientos: Este trabajo fue llevado a cabo gracias al proyecto financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad de España (CGL /BOS). M. Esperanza tiene un contracto predoctoral de la Xunta de Galicia (12C). 5

6 Microbiology PO-05 Functional characterization of liposomal amphotericin B action by flow cytometry Rita Teixeira-santos (1), Elisabete Ricardo (1), Susana G. Guerreiro (2,3), Sofia Costa de Oliveira (1,4), Acácio G. Rodrigues (1,4,5), Cidália Pina Vaz (1,4,6) (1) Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto. (2) Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Porto. (3) Center for Neurosciences and Cell Biology, University of Coimbra. (4) Center for Research in Health Technologies and Information Systems, Faculty of Medicine, University of Porto. (5) Burn Unit, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Hospital S. João, Porto. (6) Department of Microbiology, Hospital S. João, Porto. Introduction: Amphotericin B (AmB) belongs to polyene drug class and exhibits a broad-spectrum fungicidal activity. Thus, it represents an important therapeutic option for the treatment of systemic fungal infections. For decades, the prevailing mechanism of action credited to AmB involved binding to ergosterol and formation of pore-like structures. However, recently other mechanisms of action have been proposed. Flow cytometry (FC) has been shown to be an excellent tool to evaluate drug cellular lesions. FC was used to study impairment of a wide range of cellular physiological parameters following AmB exposure, in order to clarify its effect. Material and methods: Cellular parameters related to fungal cell viability such as (i) membrane polarization, (ii) cell metabolic activity, (iii) generation of oxygen-reactive species (ROS), (iv) DNA damage and (v) membrane damage, were quantitatively evaluated by flow cytometry, using Candida albicans. Briefly, cells suspension were treated with liposomal- AmB (L-AmB) 3 mg/l for 24 hours. After 1, 3, 6 and 24 h of incubation, yeast cells were stained with distinct fluorescent probes with specific cellular affinities. For the study of membrane polarization evaluation and metabolic activity, DiBAC3 and cfda markers were used, respectively. The generation of (ROS) was assessed using DCFH-DA; DNA damage was assessed using TUNEL staining. The cellular membrane integrity was assessed using propidium iodide (PI) staining. Stained cells were analyzed in a FAC- SCalibur cytometer (BD Biosciences, Sydney, Australia). Results: Treatment of yeast cells with L-AmB 3 mg/l resulted in a time-dependent increase of depolarized cells. Regarding metabolic activity, it increased soon after 1h of incubation; however, after 3h of incubation it decreased along the time. After 6 h, L-AmB exposure led to intracellular accumulation of ROS, associated with oxidative damage, thus possibly involved in induced programmed cell death. Following exposure to L-AmB 3 mg/l, TUNEL-positive cells increased over time, indicating apoptotic-like DNA-fragmentation. Interestingly, only after 24h PI uptake was observed, but just in about 50% of the cells treated with L-AmB, suggesting membrane damage. Conclusion: Our results demonstrate that yeast cells exposed to L-AmB firstly develop alterations in membrane potential and metabolic activity, and ultimately die following induction of programmed cell death and necrosis. 6

7 Solid tumors PO-06 Estudio combinado, citológico y del inmunofenotipo, en el diagnóstico de tumores no hematológicos cd56+. Análisis de 3 casos Mª Helena Bañas, Sara Suárez-Varela, Raúl Siguenza, Nuria Bermejo, Fátima Ibáñez, Ignacio Casas, Francisco de Asís Pérez Leal, Juan Miguel Bergua Servicio de Hematología, Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres. Introducción: El marcador CD56 (molécula de adhesión neural), se emplea de forma habitual en el diagnóstico hematológico de diferentes hemopatías por citometría de flujo (CMF), principalmente de origen en células natural killer (NK). Sin embargo, también puede ser útil en la detección de tumores neuroendocrinos junto a la ausencia de expresión de CD45. Nuestro objetivo es describir los casos de 3 pacientes (ptes) con características clínico-biológicas similares y cuyos datos, analizados de forma integrada, nos permitieron establecer con rapidez el origen no hematológico del tumor. Material y métodos: Las muestras fueron remitidas a nuestro laboratorio en el año 2014 con la sospecha de infiltración tumoral. Todos eran fumadores y presentaban masa pulmonar y adenopatías mediastínicas (2 ptes) en el estudio radiológico. Se obtuvieron por punción aspirado con aguja fina (PAAF) de las adenopatías mediastínicas o de la masa. En 1 pte se estudió también la médula ósea por trombopenia. El primer paso fue la observación al microscopio de las muestras, que nos orientó para la selección del panel de anticuerpos (Ac) por CMF. En general, aplicamos una combinación de Ac marcados con fluorocromos en 6 colores para el estudio de subpoblaciones linfocitarias, que incluía CD45, Ac de línea B (CD19, CD20, kappa, lambda, CD38), T (CD3, CD4, CD8) y NK (CD56). Todas las muestras fueron adquiridas en un citómetro FACSCanto II y analizadas con el software FACSDiva. Resultados: En los 3 casos la morfología fue similar: células blásticas de mediano-pequeño tamaño y aspecto linfoide, a veces con tendencia a la cohesión y con imágenes de hemofagocitosis. Podía sugerir infiltración por linfoma pero el IF mostraba una población CD45-/CD56+ sin marcadores de línea B ni T. Los datos clínicos, citológicos y el IF se interpretaron de forma conjunta para dar el diagnóstico más probable de CA microcítico de pulmón, que fue confirmado en todos los casos por estudio histopatológico. En 1 pte, la invasión medular simuló un cuadro leucémico y fue diagnosticado de carcinocitemia. Conclusión: La detección por CMF de un IF CD56+/CD45-, en ausencia de marcadores de línea hematológicos, junto con una clínica y una morfología compatibles, hace muy probable el diagnóstico de tumor neuroendocrino. 7

8 Solid tumors PO-07 Análisis de subtipos de macrófagos mediante citometría de flujo en meningiomas María Gonzalez-Tablas (1,2), Patrícia Domingues (1,3), Álvaro Otero (4), David Miranda (4), Laura Ruiz (4), Daniel Pascual (4), Pablo Sousa (4), Jesús María Gonçalves (4), María Celeste Lopes (4), Alberto Orfao (1), María Dolores Tabernero (1,2) (1) Centro de Investigación del Cáncer (CIC-IBMCC, CSIC/USAL, IBSAL) y Departamento de Medicina, Universidad de Salamanca. (2) Instituto de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León (IECSCYL-IBSAL) y Laboratorio de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca. (3) Centro de Neurociencias y Biología Celular y Facultad de Farmacia, Universidad de Coimbra. (4) Servicio de Neurocirugía, Hospital Universitario de Salamanca. Introducción: Los meningiomas presentan infiltración de distintos tipos de células inmunes principalmente células presentadoras de antígenos (CPA). El propósito del estudio fue analizar distintas combinaciones de anticuerpos monoclonales (AcMo) que permitieran identificar las células de origen mieloide monocito-macrófago y caracterizar los distintos subtipos de macrófagos existentes en meningiomas mediante citometría de flujo (CMF), analizando la polarización hacia macrófagos M1 y/o M2. Métodos: Mediante CMF multiparamétrica se analizaron tres combinaciones diferentes AcMo: primero en 23 muestras de tejido tumoral de meningiomas se analizaron los siguientes AcMo: CD45 PO / HLA-DR PerCPcy5.5 / CD14 APC-H7 / CD16 Pecy7 / CD33 PE. En un subgrupo de tumores (n=11), se incluyeron además de los marcadores anteriormente descritos, CD44 y CD206, y finalmente en otro subgrupo de tumores se marcaron las muestras tumorales con varios AcMo para identificar macrófagos M1: NOS, TLR2, TLR4, CD300e, SLAN, CCR2, CCR7 y para macrófagos M2: CD163, ARG1 y CD206. Resultados: En los tumores analizados, sistemáticamente se detectó una media 82% de CPA del células presentadoras de antígenos HLA-DR+CD14+CD45+CD16-/+CD33-/+ siendo el 79% células DR+CD14+CD33-/+. La segunda combinación de anticuerpos mostro la utilidad del uso de CD44 en la distinción de subpoblaciones de monocitos y macrófagos, y positividad heterogénea para CD206 in 10/11 meningiomas. Finalmente, se amplió el panel de AcMo para diferenciar macrófagos M1 y M2. Este panel mostró una media de CPA de 90%, siendo el 58% células DR+CD14+ siendo heterogénea la positividad para macrófagos M1 y M2. Conclusión: La combinación de AcMo HLA-DR, CD14, CD16, CD33 es insuficiente para identificar los subtipos de CPA, siendo de utilidad la inclusión de otros marcadores que ayuden a diferenciar el fenotipo antitumoral (M1) o anti-inflamatorio (M2) de los macrófagos en meningiomas, como son CD44 y CD206. Además es necesario el análisis de un mayor número de tumores para establecer la utilidad de los marcadores NOS, CCR7, CCR2 y ARG1. 8

9 Hematology PO-08 Rentabilidad del test de hemoglobinuria paroxística nocturna por citometría de flujo en un hospital de tercer nivel J. Viedma, A. Lemes, S. de la Iglesia, D. Fiallo, T. Molero Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria Introducción: El diagnóstico de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) parte de una sospecha clínica que se confirma por técnicas citofloroméricas (CF). Mediante este método se determina la clona, su tamaño y se utiliza asimismo para el seguimiento de la enfermedad. Las distintas guías y recomendaciones de expertos valoran en que patología relacionada con la HPN (trombosis no explicadas, fallo medular, anemia hemolítica Coombs negativa, hemoglobinuria) se debe realizar el test de despistaje por CF. El objetivo del presente estudio fue analizar en número de test para screening de HPN, en que patologías concomitantes se realizó y valorar su eficacia clínica en nuestro servicio. Material y métodos: Revisamos los test de HPN realizados desde enero de 2012 hasta diciembre de 2014, en las poblaciones de sangre periférica en monocitos y polimorfonucleares (PMN). Para ello se utilizo un citómetro Navios de Beckman Coulter y seis colores con el panel FLAER FITC/CD64PE/CD45ECD/CD14PECy7/ CD15APC/ CD16APC-750. Se adquirieron eventos y se analizaron los CD15 y CD64 en ventana para separar las poblaciones de PMN y monocitos respectivamente. La sensibilidad alcanzó el 0.1%. En clonas inferiores al 5% se recomendó repetir el test para confirmación. Resultados: En el periodo de tiempo mencionado se solicitaron 63 pruebas, de las que 30 (48.3%) fueron por trombosis venosa profunda; 12 (19%) por citopenias; 3 (4.7%) por HPN diagnosticadas por otros métodos; 9 (14.2%) en anemia aplásica; 12 (19%) en citopenias; 3 (4.7%) en anemia hemolítica Coombs negativo; 2 (3.1%) en Síndrome Mielodisplásico (SMD) hipoplásico; 2 (3.1%) por ferropenia con trombocitopenia y 1 (1.6%) hemoglobinuria. Se realizaron así mismo 6 pruebas adicionales en el seguimiento de HPN previamente diagnosticadas por CF. El 100% de los estudios fueron solicitados desde el Servicio de Hematología. Se encontró una nueva clona HPN en 3 de los casos estudiados (4.7%): 1 Anemia Aplásica; 1 HPN y 1 SMD. No hallamos clona en ninguno de los estudios solicitados por trombosis venosa profunda (con estudio de hemolisis normal y sin citopenias). Las clonas encontradas oscilaron entre el 1% y el 90% Conclusión: La rentabilidad de la realización del test HPN fue escasa en nuestra serie si bien similar a las encontradas en otros centros de nuestra Comunidad Autónoma. Pensamos que se debería solicitar la prueba desde servicios ajenos al de Hematología como Digestivo y Medicina Interna, con el fin de no dilatar el diagnóstico y tratamiento ante una sospecha principalmente de trombosis en lugares no habituales, que son la causa más frecuente de muerte en esta enfermedad. 9

10 Hematology PO-09 Hairy cell leukemia s identity. A challenge for the forward scattered analyser A. Lemes, S. de la Iglesia, D. Fiallo, J. Viedma, A. Díaz*, T. Molero Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria. *Estudiante de 4º año de Medicina, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Screening rutinario de Tricoleucemia por los datos de dispersión de luz de un autoanalizador hematológico 10

11 Hematology PO-10 Selección de anticuerpos determinantes para el estudio de la enfermedad mínima residual en mieloma múltiple M.S. Noya, L. García, M.F. López Fernández Servicio de Hematología y Hemoterapia, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña Introducción: El fenotipo de la plasmática clonal es heterogéneo y carece de un perfil único. Esto hace que la citometría de flujo multiparamétrica sea fundamental en el estudio de las gammapatías monoclonales y de EMR en MM. Está por definir el tubo ideal para EMR. Material y métodos: Se estudiaron en 96 pacientes, las aberrancias fenotípicas de las plasmáticas con un panel de 2 tubos y 8 colores, utilizando un FACS Canto II BD con el objetivo de encontrar aquellos más determinantes para EMR: CD38, CD138, CD19, CD45, CD56, K/L cit, CD81, CD27, CD28, CD117, CD20. En 27 se estudió CD eran MM, 16 MGUS, 2 amiloidosis y 3 leucemias. Resultados: Aberrancia N pacientes (%) K/L clonal 95 (99) CD45-95 (99) CD19-91 (95) CD81-78 (81) CD200+ (n=27) 22(81.5) CD56+ 67(69.8) CD117+ (n=76) 42(55.2) CD (53) CD27-45(46.8) CD (14.5) Según los datos de la tabla, además de las cadenas ligeras, CD19, CD45, CD81, el CD56 fue el más frecuente, así como CD200. Pero, los 5 casos CD19+ también eran CD81+ y solo 1 CD56+. CD27 en 2. CD200 fue + en 22/27 casos, pero ya eran aberrantes: 18 eran CD56+, 13 CD28+ y CD27 en 11. Por tanto CD200 discriminó poco, ya que si CD56- el CD27 también fue- en 3/ 4. CD56 fue + en 67 y en 29: en estos casos fue CD28 +el más útil (15), seguido de CD27- (12). CD117 y CD200 fueron + en la mitad de los casos CD56 analizados. Si CD56 y CD27+ el más útil fue CD28+ (10/17) y CD117+ (7/14). A su vez, el CD117 fue + en 42/76 y se asoció a CD56+ (30) CD28 (22) y CD27 (10). Cuando CD56 fue- (12 casos) nuevamente CD28 fue + en la mitad. Conclusión: Es indiscutible la utilidad de CD19, CD56 y cadenas ligeras. Encontramos hasta un 19% de CD81 het. CD27- fue menos frecuente que en otras series, pero fue útil en CD19+ (50%) y si CD56-. El CD200 fue + en 81.5% (n=27), pero se asoció a CD56+ y si éste es negativo, CD27 también, por lo que no lo encontramos discriminatorio. En cambio, CD117 y CD28 fueron muy útiles cuando CD56- y CD27+. Por ello, sugerimos la presencia de CD27, CD117 y CD28 en el estudio de EMR. 11

12 Hematology PO-11 Correlación de los resultados de poblaciones linfocitarias obtenidos mediantem el nuevo citómetro Aquios y Navios Javier Gómez Arbonés, Montserrat Teixidó Amorós, Miguel Angel Gallart Blanco, Florencia di Bernardo Universidad de Lleida, Departamento de Medicina. Laboratorio Clínico ICS Lleida, Hospital Universitario Arnau de Vilanova, Lleida. Institut de Recerca Biomèdica de Lleida (Irblleida) Introducción: Aquios (Beckman Coulter) es un citómetro de flujo automático para la determinación de de células CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ y NK con procesamiento y lectura desatendido. En el pasado congreso de la SIC presentamos la evaluación del prototipo inicial de Aquios que resultó excelente, si bien, la versión definitivamente comercializada de Aquios incorpora mejoras sobre el prototipo inicialmente evaluado y presenta unos algoritmos optimizados para la identificación y recuento de las subpoblaciones linfocitarias. Material y métodos: Hemos estudiado la correlación de los resultados de la determinación de poblaciones linfocitarias (células/µl) de muestras remitidas al laboratorio clínico y analizadas mediante la versión actual de Aquios y Navios (contaje de valores absolutos mediante bolitas fluorescentes). También hemos analizado la correlación de células CD4+ obtenidas mediante Aquios y por doble plataforma (Navios y hemocitómetro). Se han considerado los resultados de las muestras auto-validadas por Aquios sin intervención de operador y los correspondientes resultados obtenidos por los procedimientos rutinarios de nuestro laboratorio. Resultados: El estudio de correlación de las 127 muestras entre Aquios y Navios se mostró excelente para la concentración de linfocitos CD3+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD3-/CD19+ y CD3-/CD56+/CD16+, con un coeficiente R de 0.982, 0.988, 0.982, y 0.971; las pendientes de las rectas de regresión (variable dependiente: valores de Navios) fueron de 0.96 (IC 95%: ), 1.05 ( ), 0.88 ( ), 1.04 ( ) y 0.95 ( ). La correlación de los resultados de CD4/CD8 fue de R=0.989 con una pendiente de 1.01 ( ). Por lo que respecta a la correlación con los resultados con doble plataforma para la concentración de linfocitos CD3+/CD4+, obtuvimos un coeficiente R de 0.989, con una pendiente de las rectas de regresión de 1.10 ( ). Conclusión: Las correlaciones entre los valores de las subpoblaciones linfocitarias obtenidos por Aquios y Navios es excelente y no hay diferencias clínicamente significativas entre ellos. 12

13 Hematology PO-12 Correlación diagnóstica entre el estudio de muestras biológicas por citometría de flujo multiparamétrica versus anatomía patológica en nuestro centro S. Almela Rambla, E. Mas Esteve, E. Viciano Delíbano, M. Mas Esteve, A.F. Arbeláez Olivar, M. Gimeno Brosel, L. Serrano Picazo, A. Gascón Buj, J. Clavel Pía, R. García Boyero, A. Blanquer Cots, M. Guinot Martínez, T. Gozalbo Gascó,G. Cañigral Ferrando Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario General de Castellón Introducción: La CMF es una herramienta para el diagnóstico y clasificación de las neoplasias hematológicas en muestras de sangre periférica y médula ósea. Puede emplearse para el diagnóstico de otras muestras con células en suspensión, permitiendo el análisis de antígenos y sus aberrancias. Objetivo: Correlacionar diagnóstico AP/CMF en pacientes con sospecha de neoplasia hematológica. Material y métodos: Estudio retrospectivo de muestras de tejidos por CMF vs AP. Periodo de estudio: Desde el 01/01/12 al 31/12/14. Número de muestras: 64.Tipo de muestra: Adenopatía, líquido biológico, biopsia ósea, bazo, biopsia cerebral, BAG, PAAF Procesado de la muestra: En fresco. Se improntan para tinción con May- Grümwald Giemsa y se obtiene una suspensión celular para estudio por CMF. Paneles de análisis por CMF: Paneles validados por Euroflow (tubo LST, tubo SLPC-T, tubo SLPC-B). FACSCANTO II. Estadísticos: SPSS Definición de acierto: Correlación positiva entre la conclusión del análisis CMF y las conclusiones de AP. Resultados: De las 64 muestras, 2 fueron excluídas por ausencia de celularidad valorable. De las 62 muestras restantes, existe una correlación positiva respecto a la anatomía patológica en 43 de ellas (12 no patológicas, 31 patológicas (24 para LNH, 7 para neoplasias no hematológicas) y una discordancia en 19 de ellas (6 LH, 9 LNH y 3 otros diagnósticos). En las disonancias CMF/AP se aprecian 6 casos de LH donde no se objetiva población linfocitaria B o T clonal con el panel de screening pero, por los hallazgos morfológicos correlacionarían con LH. Todo ello arroja los siguientes estadísticos globales: S 65% E 90% VPP 97% VPN 40%. Si se excluyesen los LH del análisis la técnica resultaría con: S 76% E 90% VPP 97% VPN 50%. Conclusiones: La CMF es una técnica con una elevada E y un alto VPP. Se debería trabajar para aumentar la S de la técnica. Favorecería la detección de los LH, y así el aumento de la S, la presencia de marcadores monoclonales específicos.la CMF de muestras biológicas es una herramienta válida para el análisis de muestras patológicas y no patológicas. El diagnóstico hematológico siempre debe de ser integrado: citomorfología, CMF y citogenética (biología molecular/fish). La CMF es una técnica que apoya el diagnóstico AP, pero no debe sustituirlo. 13

14 Hematology PO-13 Leucemia prolinfocítica T: paciente con inmunofenotipo aberrante M.S. Noya, M.T. Fernández, T. Torrado, F. Salido, M.G. Vázquez, M.F. López Fernández Servicio de Hematología y Hemoterapia, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña Introducción: La leucemia prolinfocítica T (LPT)es un síndrome linfoproliferativo crónico generalmente agresivo, que puede cursar con linfocitosis marcada, hepatoesplenomegalia, adenopatías e infiltrados cutáneos y que suele presentar una morfología (prolinfocitos) e inmunofenotipo bastante característicos aunque se han descrito casos atípicos: CD45+ (como se esperaría en una neoplasia de células T maduras), marcadores de células pan-t (CD2, CD5, CD7 y CD3) y, generalmente CD4+. Presentación: Varón de 63 años sin antecedentes de interés remitido por hallazgo de una linfocitosis (40.03 x 109/L) con morfología compatible con prolinfocitos. No refería sintomatología B, a la exploración : hepatomegalia 6cm. Se realiza inmunofenotipo en sangre, utilizando un FACS CANTO II BD y con un panel de 8 fluorescencias adaptado del panel propuesto por el grupo Euroflow. Se detectó una población aberrante, homogénea, que representaba aproximadamente el 84% de la celularidad, correspondiente a células linfoides T, de pequeño tamaño y complejidad que expresaban CD3+ citoplasmático (CD3 sup negativo), CD4++, CD5+, CD7+, CD2+ más débil, CD26+, CD27+, CD28+, CTL1 cyt+, TCR alfabeta+ intracit (negativo superficie) y CD52+. Esta población era negativa para CD45, CD8, CD45Ro, CD10, marcadores de inmadurez (CD34, TdT, CD99, CD1a, CD117, CD38, CD123), antígenos de activación (CD25, HLA-DR) y marcadores de citotoxicidad (CD56, CD57, CD11c, CD94, perforina). En la médula la infiltración era del 68%. Se informó como LP T a la espera del resto de pruebas. En el estudio citogenético se detectó Inversión del cromosoma 14 y trisomía del cromosoma 8. Conclusión: El caso clínico presentado corresponde al de un paciente con clínica y analítica, incluida morfología y genética, compatibles con LP T, pero el inmunofenotipo presentaba pérdida aberrante de CD45 y CD3 superficie, que hizo plantear incluso el diagnóstico diferencial con una leucemia aguda linfoblástica T. El resto del fenotipo es bastante típico. Solo hemos encontrado un caso similar publicado en la literatura, por lo que nos parece interesante reportarlo. 14

15 Hematology PO-14 Casos clínicos de manifestación extramedular de mieloma múltiple en ganglio linfático y lavado broncoalveolar Mercedes Rey Rey, Larraitz Aragón Irusquieta, M.ª del Carmen Cipitria Arnáiz, Pilar Echániz Aizpuru Servicio de Inmunología, Laboratorio de Inmunología, Hospital de Donostia El mieloma múltiple (MM) extramedularo extraóseo es una presentación poco frecuente de dicha enfermedad (3-5% de las neoplasias de células plasmáticas), que surge en localizaciones diferentes de la médula ósea (habitualmente en el tracto respiratorio superior, pero puede aparecer en otras localizaciones como nódulos linfáticos). Esta presentación es más agresiva que el MM, siendo resistente a la terapia convencional anti-mieloma. En esta comunicación presentamos dos casos de manifestación extramedular de MM: una paciente de 72 años con antecedentes de neoplasia de mama y mieloma múltiple, con recaída en forma de plasmocitoma extramedular en ganglio linfático, y una paciente de 52 años con manifestación del mieloma en tráquea y BAL. PO-15 Caso clínico de coexistencia de linfoma del manto y leucemia linfática crónica en un paciente hematológico Larraitz Aragón Irusquieta, Mercedes Rey Rey, Pilar García Martínez, Pilar Echániz Aizpuru Servicio de Inmunología, Laboratorio de Inmunología,Hospital de Donostia La coexistencia de linfoma del manto y leucemia linfática crónica en pacientes de Hematología es un fenómeno muy poco frecuente, siendo muy escasos los casos documentados en la literatura. Para estos casos se ha acuñado el término de linfoma compuesto, que describe la coexistencia en un mismo sitio anatómico de ambos procesos. Sin embargo, este término no es aplicable a nuestro paciente, ya que el linfoma del manto y la leucemia linfática crónica se observaron en diferentes tipos de muestras. PO-16 Leucemia de linfocitos grandes granulares o expansión clonal de linfocitos T no citotóxica? A propósito de un caso y revisión de la literatura D.V. Fiallo (1), A. Lemes (1), M.T. Gómez-Casares (1), A. López (2), J. Ciudad (2), M. Limeres (3), J. Viedma (1), C. Rodríguez (1), M. Perera (1), T. Molero (1) (1) Servicio de Hematología y Hemoterapia. (2) Servicio de Citometría,Centro Investigación del Cancer, Salamanca. (3) Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín. Las Palmas de Gran Canaria Leucemia de linfocitos grandes granulares y la dificultad de establecer una clonalidad certera 15

16 Hematology PO-17 Es útil la citometría de flujo en el estudio de los síndromes mielodisplásicos? Beatriz Álvarez, F. Ataulfo González, Jesús Villarrubia, Luz Conejo, Javier García, María Medrano, Juan M. Alonso, Raquel Guillén, Fernando Cava Laboratorio Central de la Comunidad de Madrid. Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid Introducción: Inicialmente la aplicación de la citometría de flujo (CMF) en los síndromes mielodisplásicos (SMD) quedaba relegada a la cuantificación de los precursores mieloides y la identificación de la línea pero el avance tecnológico de la CMF y el mayor conocimiento de las alteraciones fenotípicas descritas en los SMD han provocado un incremento en su aplicación como apoyo diagnóstico en los SMD. La OMS del 2008 ya incluye a la CMF dentro de las recomendaciones para el estudio de los SMD. A este respecto, el grupo internacional ELNet IMDS-Flow publicó unas guías para la incorporación de la citometría de flujo en el diagnóstico y clasificación de los SMD describiendo unos requerimientos mínimos para análisis mediante citometría de flujo de los SMD. En este estudio se pretende valorar la utilidad de la CMF en el estudio de los SMD en la rutina del laboratorio clínico. Material y métodos: Se presenta el caso de 3 médulas óseas y 1 sangre periférica de pacientes remitidos a estudio de SMD. En todos los casos se realizó un marcaje directo de 8 colores con los antígenos CD16, CD13, CD34, CD33, CD117, CD45 y HLA-DR (BD Biosciences) mientras que en uno de los casos se estudió además la expresión de CD235a, CD36 y CD71 (BD Biosciences). La adquisición de las células se realizó en un citómetro de flujo de BD FACSCanto II (BD Biosciences) y el análisis de los datos de realizó con el programa Infinicyt (Cytognos). Resultados: El estudio inmunofenotípico en los casos remitidos para el estudio de SMD resultó de utilidad en todos ellos aportando información complementaria a la citogenética/fish y al estudio citomofológico formando parte del diagnóstico integrado de la enfermedad. Conclusiones: La citometría de flujo aporta información de utilidad para el clínico en el diagnóstico de los síndromes mielodisplásicos debiéndose destacar que alteraciones fenotípicas aisladas no han de considerarse significativas y que ha de formar parte del diagnóstico integrado del SMD. Además la CMF puede resultar de utilidad no sólo en el diagnóstico, si no también, en la subclasificación, grupos de riesgo y monitorización de la enfermedad. 16

17 Hematology PO-18 Tetraspanin expression profile in multiple myeloma cells and its association with β1 integrins (CD29) Cristina Martín Martín, Eulalia Rodríguez Martín, Luisa María Villar Guimerans, Javier Coll Martí, Ernesto Roldán Santiago Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid Introduction: Multiple myeloma (MM) is a malignant plasma cell disease. An understanding of the interactions between malignant PCs and Bone marrow (BM) microenvironment is essential to design a rational disease treatment. Tetraspanins modulate a variety of fundamental biological processes such adhesion and migration by functioning as organizers of multimolecular membrane complexes, especially with CD29. We aim to define the expression of tetraspanins in these neoplastic cells and their association to integrins, as they have been previously described as prognostic markers in other neoplastic conditions. Patients and methods: BM aspirates from 48 patients with monoclonal gammopathy (8 MGUS, 21 new MM and 19 treated MM) and 8 patients without haematological disorders were obtained. Cells were always stained with monoclonal antibodies (mab) against CD38 and CD56 and/or CD19 in order to differentiate malignant form normal PCs. In addition, mab against beta 1 integrin CD29 (MAR4 clone) or its alpha 4 chain (CD49d) were combined with mab against tetraspanins (CD9, CD37, CD63, CD81 or CD151). Results: All normal and neoplastic PCs expressed similar levels of CD63 and none expressed CD37. CD9 and CD151 were expressed at very variable levels in normal or malignant PCs. In contrast, in a wide majority of MM cases, malignant PCs showed a loss of CD81 antigen compared with normal BM PCs. More importantly, we show that underexpression of CD81 was accompanied by a significant decrease in the surface levels of CD29 and CD49d. This relationship is not observed with the other tetraspanins. Finally, no significant differences in the expression of tetraspanins among the different types of monoclonal gammopathy were found. Conclusions: In relation to the tetraspanins studied, only the loss of CD81 can be used as aberrant marker to define a plasma cell tumor. Moreover, the clear association between CD81 and CD29 levels suggests that this tetraspanin could modulate integrin function. 17

18 Hematology PO-19 Rentabilidad diagnóstica de HPN en pacientes con trombosis Juan Viedma, Melania Moreno, Angelina Lemes, Ignacia Balda, Dolly Fiallo, Silvia de la Iglesia, Teresa Molero Servicios de Hematología, Bioquímica y Medicina Preventiva, Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria Introducción: La Hemoglobinuria ParoxísticaNocturna (HPN) es una rara enfermedad clonal asociada a hemólisis crónica intravascular y activación plaquetaria que provoca trombosis, insuficiencia renal y, en general, un empeoramiento de la calidad de vida. Por estos hechos y el interés actual de la enfermedad por una nueva alternativa terapéutica que mejora el pronóstico de estos pacientes, se genera una tendencia a considerar HPN en todo paciente joven con trombosis sin causa justificante. Objetivo: Nuestro objetivo es estudiar la rentabilidad diagnóstica del despistaje de HPN en pacientes menores de 55 años que presentaron un episodio de trombosis venosa o arterial sin factor desencadenante previo. Pacientes, material y método: Estudio prospectivo y secuencial de pacientes menores de 55 años que sufrieron un episodio trombótico y cuyos datos han sido recogidos en una base de datos de nuestra Unidad desde marzo/2014 hasta la actualidad. Se incluyeron pacientes sin factores desencadenantes de trombosis, independientemente de los factores predisponentes (tabaco, HTA, DM, obesidad, trombofilia, dislipemia, toma de ACHO). Aparte se recogió el territorio donde se produjo la trombosis. Se completó con despistaje de trombofilia congénita y adquirida. Se realizó estudio de hemólisis con determinación de niveles de haptoglobina y otros parámetros bioquímicos relacionados con hemólisis intravascular, así como identificación de clona HPN por Acs monoclonales por citometría de flujo (FlaerFITC/ CD64PE/ CD45ECD) CD14PCy7/ CD15APC/ CD16APC-AF750). Resultados: El grupo de estudio se compone actualmente de 28 pacientes (14 varones y 14 mujeres) con edad media de 42 años del evento trombótico. En ningún paciente se objetivó datos de hemólisis, con una media de haptoglobina de ( ) ni se identificó clona HPN. De todos los pacientes 9 (32%) no presentaba factores de riesgo trombótico. Sólo 2 (7%) de ellos padeció la trombosis en territorio arterial. De todas las trombosis, 24 (85.71%) correspondían a territorio venoso profundo en MMII y/o embolismo pulmonar Conclusión: De nuestro estudio, si bien se compone de un reducido tamaño muestral, se concluye que el despistaje de HPN en pacientes con trombosis en territorio venoso profundo en MMII y/o embolismo pulmonar sin factor desencadenante no resulta rentable. Esta rentabilidad no se modifica si se tiene en cuenta la ausencia de factores predisponentes (32% de ellos no los tenían). Sin embargo, son pocos los pacientes incluidos en nuestra base que padecieron evento trombótico fuera de la localización mencionada o evento arterial (solo 14%). Considerando que el perfil de trombosis que se ha descrito en HPN incluye territorio arterial y territorios venosos atípicos, deberá plantearse la posibilidad de descartar esta patología en pacientes con este perfil de trombosis. Para ello será necesario una colaboración estrecha así como una actualización de la HPN en aquellos servicios que tratan con este tipo de eventos. 18

19 Hematology PO-20 Prevalence of immunophenotypic markers in patients with multiple myeloma into staging III Fabiane Spagnol Pedrazzani (1), Ana Luiza Carvalho da Silva (2), Mariela Granero Farias (1), Priscila Aparecida Correa Freitas (1), Marcelo Ferreira Paiva (3), Ana Paula Alegretti (1), Diogo Andre Pilger (2) (1) Unidade de Diagnóstico Personalizado. (2) Unidade de Hematologia. Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. (3) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil Introduction: Multiple Myeloma (MM) is a clonal plasma cell proliferative disorder. Currently, multiparameter flow cytometry (MFC) is essential in MM diagnosis, because it provides plasma cells characterization and prognostic indication. Some markers such CD28, CD117, CD56, CD81 and CD27 have demonstrated prognostic implications. Objectives: To analyze the frequency of prognostic markers by MFC in the staging III to MM according to Durie-Salmon (D&S). Methods: Were included 26 patients (17 men) classified into stage IIIA (15) and IIIB who had diagnosis of MM in an Academical Hospital at 2014 to The analysis was performed by MFC on bone marrow samples using a MFC FACSCanto II (BD, San Jose, CA, USA). The antibody panels included were CD19, CD38, CD117, CD28, CD27, CD56, CD45, CD81, Kappa and Lambda, conjugated with FITC, PE, PERCP, APC and APC-H7 fluorochromes. The patients included were those classified into staging III according to Durie- Salmon s classification for MM. The statistical analysis was performed by a descriptive analysis and Qui-square test to correlate categorical variables. It was used SPSS 22.0 and considered a p-value <0.05 as significant. Results: The most prevalent markers were positive to CD56 (68%), CD27 (84%), CD28 (64%) and CD117 (64%), followed by cytoplasmatic Kappa (60%), CD81 (28%), CD45 (24%) and negative to CD19 (96%). There wasn t association between the immunophenotypic markers and the staging groups found. Conclusions: MM is often difficult to diagnose and the patients are usually identified in advanced stage disease. Our patients, in the staging III for MM, showed frequencies of CD56 positive and CD19 negative similar to those found in the study of Rawstron et al (2008), although we have found higher prevalence of CD28, CD117, CD27 markers. This study will continue in order to evaluate a larger number of patients and analyze also the staging I and II. 19

20 Hematology PO-21 Análisis de las poblaciones leucocitarias circulantes en pacientes con trombocitopenia inmune primaria y su asociación con la respuesta al tratamiento con eltrombopag Elena Blanco (1), Mónica Ospina (1), Martín Pérez-Andrés (1), José María Bastida (2), Tomás José González López (3), Ignacio Criado (1), Luzalba Sanoja (1), Daniela Damasceno (1), Alba Torres (1), Julia Almeida (1), José Ramón González-Porras (2), Alberto Orfao (1) (1) Departamento de Medicina, Servicio de Citometría, Centro de Investigación del Cáncer (Ibmcc-Csic/Usal) y Universidad de Salamanca. (2) Servicio de Hematología, Hospital Universitario de Salamanca-Ibsal. (3) Servicio de Hematología, Hospital Universitario de Burgos Introducción: Recientes estudios sugieren que el tratamiento con agonistas del receptor de la trombopoyetina podría no solo estimular la producción de plaquetas en pacientes con trombocitopenia inmune primaria (TIP) sino además tener un efecto inmunoregulador. Material y métodos: Se estudiaron muestras de SP de 8 pacientes con TIP, al inicio del tratamiento con Eltrombopag, a los 14 y a los 28 días postratamiento, así como 8 donantes sanos, por citometría de flujo, con las combinaciones de anticuerpos monoclonales: i) CD27/CD45/smIgD-CD8/CD56-CD16/smIgM-CD4/CD19-TCRγδ/CD3/CD45RA ii) CD27/IgM/CD24/CD19/smIgG3-smIgG2/smIgA1-smsIgA2/smIgG1-smIgG2/smIgD/CD21/smIgA1-smIgG4/ CD38 iii)cd27/cd4/cd8/cd25/cd28/cd39/tcrgd/ CD127/CD45RA. Resultados: Al iniciar el tratamiento, los pacientes de TIP presentaban números absolutos significativamente disminuidos de monocitos (434±130 vs 722±174 cél/µl; p=0,02), monocitos CD16++ (34±26vs 115±62 cél/µl; p=0,003) y células dendríticas linfoplasmocitoides (3,9±4,9 vs 12,1±4,9 cél/µl; p=0,006), así como de linfocitos T naïve CD4+ y CD8+ (173±188 vs 499±270 y 51,6±53 vs161±114 cél/µl; p=0,02, respectivamente), TCRγδ (34,1±31, vs 92,7±61,3 cél/µl; p=0,02), y en el ratio CD4+/CD8+ (1,5±1,2 vs 2,7±0,5 cél/µl; p=0,01) respecto a los controles. No se observaron diferencias en el número de linfocitos B circulantes totales por estadio madurativo (inmaduras, naïve, memoria, células plasmáticas y linfocitos B CD24++/CD38- reguladores -Breg-), o por isotipo. Todos los pacientes respondieron a eltrombopag (plaquetas > 100x109/L). Tras 14 días de tratamiento se observó un aumento en el número absoluto de monocitos (434±130 vs 629±205 cél/µl; p=0,01), y monocitos CD16++ (33,9±25,8 vs 75,9±48,8 cél/µl; p=0,05), aunque aún disminuidos respecto al grupo control (p<0,05). Además, se observó un incremento de las NK (219±119 vs 335±194 cél/µl; p=0,02) y células Breg (2,9±3,3 vs 3,5±3,2 cél/µl; p=0,03), y un descenso en el número de células B naïve (94±87 vs 72±74 cél/µl; p=0,02), respecto al comienzo del estudio, pero no respecto a los controles (p>0.05). Por el contrario, no se observaron cambios en el compartimento T o en las células dendríticas plasmocitoides. Los cambios observados en monocitos, monocitos CD16+ y células NK respecto al control, se mantuvo a los 28 días. El compartimento de células Breg continuó expandiéndose, siendo significativamente mayor respecto a lo observado a los 14 días (3,9±2,7 vs 3,5±3,2 cél/µl; p=0,04). Además, se observó un descenso significativo en el número absoluto de células B de memoria (42,2±27,6 cél/µl vs 73,87±59,2; p=0,04) a expensas de una disminución en el número de células de memoria IgMD+ (14,8±8,2 cél/µl vs 29,2±27,8; p=0,02) tras 28 días de tratamiento respecto al control. Por el contrario no se observaron cambios en el compartimento T. Conclusión: El tratamiento con Eltrombopag produce un rápido aumento de monocitos, macrófagos y células NK, detectable a los 14 días de empezar el tratamiento. Aunque se observan algunos cambios en el compartimento B que afectan a las células B CD24++/CD38-, y a la distribución de los isotipos, es necesario un seguimiento a más largo plazo para confirmar el efecto inmunoregulador de Eltrombopag. 20