3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

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1 3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS El análisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número total de microorganismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables 2.- Método del número más probable (NMP) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables 3.- Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora 4.- Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no viables El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores: - método de muestreo utilizado - distribución de los microorganismos en la muestra - naturaleza de la microflora del alimento - naturaleza del alimento - antecedentes del alimento - adecuación nutricional del medio de cultivo - temperatura y medio de incubación - ph, a w, potencial de oxidación reducción del medio - tipo de diluyente utilizado - número relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos: a) los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrótofos ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 12

2 b) los que crecen entre 20 30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30 40º C: mesófilos c) los que crecen por encima de los 45º C: termófilos Recuento de aerobios mesófilos En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminación de la materia prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos. Métodos normalizados ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Método por recuento de colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra. AF V Método de rutina para el recuento de microorganismos. Método de recuento de las colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. El recuento podrá ser realizado utilizando un sembrador espiral (NF V08-100) Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra. ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 13

3 ESQUEMA: A EROBIOS MESÓFILOS ISO4833 AF V g muestra + 90 ml agua peptona 10-1 Diluciones decimales 1ml ml 1ml 1ml Agar PCA Incubación 30ºC / 72 h Recuento de colonias ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 14

4 B. MOHOS Y LEVADURAS Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene quitina y β- glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproducción sexual o asexual, saprófitos mutualistas o parásitos. En función de la temperatura de crecimiento se dividen en: - termófilos: 20 50º C (40 50º C) - termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C - mesófilos: 10 40º C (20 35º C) - psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C) Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamentosos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las levaduras crecen en agregados de células independientes, cuando crecen en los alimentos forman colonias características. - Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos: División: Zygomyceta Clase: Zygomycetes Orden: Mucorales Familia: Mucoraceae Género: Mucor, Rhizopus, Thamnidium División: Ascomyceta Clase: Pleitomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género: Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium División: Deuteromyceta Clase: Coelomycetes Familia: Coelomycetaceae Género: Colletotrichum Clase:Hypomycetes Orden: Hypomycetales Familia: Moniliaceae Género: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium,... - Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos: División: Ascomycotina Familia: Saccharomycetaceae SubFamilia: Nadsonioideae Género: Hanseniaspora SubFamilia: Saccharomycotoideae Género: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces,... ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 15

5 SubFamilia: Schizosaccharomycotoideae Género: Schizosaccharomyces División: Deuteromycotina Familia: Crypteococcaceae Género: Brettanomyces, Candida, Crytococcus... El significado de la contaminación fúngica de los alimentos viene determinado por su capacidad para deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el aspecto modificaciones químicas, alterando el valor nutricional, variando sus características organolépticas y dificultando su conservación. Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre e incluso reacciones alérgicas. Además, muchos mohos producen gran número de toxinas a las que el hombre es susceptible. Las micotoxinas son un grupo de metabolitos tóxicos, producidos por ciertas cepas de mohos cuando crecen en unas condiciones determinadas, en una amplia variedad de alimentos. El estudio de los mohos productores de micotoxinas ha sido bastante completo debido a: - la ubicuidad de sus esporas - que pueden estar presentes en alimentos organolepticamente aceptables - que los alimentos constituyen un sustrato orgánico adecuado para su crecimiento. Estos mohos producen micotoxinas que al ser ingeridas por los animales originan metabolitos tóxicos secundarios, que pasan a la leche, carne o huevos y son absorbidos indirectamente por el hombre - al riesgo cancerígeno, sobre todo de las aflatoxinas Toxicológicamente nos interesan más las micotoxinas y los factores que puedan afectar la capacidad de su producción, que los mohos productores. En la mayoría de los casos las intoxicaciones son producto de la acción combinada de varias micotoxinas. Rara vez un alimento es contaminado por una sola especie y cada especie suele producir varias micotoxinas. Los alimentos que más fácilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas más frecuentes son: 1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados 2.- Aceites vegetales no refinados 3.- Cereales y alimentos derivados 4.- Frutos secos 5.- Zumos de frutas 6.- Legumbres 7.- Bebidas alcohólicas 8.- Leche y productos lácteos 9.- Carne y productos cárnicos Para la prevención y control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario: - conocer los factores que afectan al crecimientos de los mohos y a la producción de las micotoxinas - conocer el periodo entre la germinación y la producción de micotoxinas, para estimar el potencial tóxico del alimento - evitar la contaminación - evitar, durante la manipulación, las posibles lesiones de los granos y las frutas ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 16

6 - mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo posible el crecimiento de los mohos El recuento de mohos y levaduras es un índice de las condiciones higiénicas de una materia prima y de las condiciones de manipulación. Su significado es similar al de los aerobios mesófilos. Métodos normalizados ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enumeración de las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo determinado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un resultado significativo. NF V Método de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enumeración de las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo definido, repartido en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubación de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. En el caso de recuento de especies de mohos supuestos conocidos la temperatura de incubación puede ser diferente de 25º C, buscando después el acuerdo entre las dos partes (20º C ó 22º C) e indicándolo en el informe del ensayo. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri retenidas, calcular el número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra. ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 17

7 ESQUEMA: MOHOS Y LEVA DURA S ISO7954 AF V g muestra + 90 ml agua peptona 10-1 Diluciones decimales 1ml ml 1ml 1ml Incubación 25ºC / 5 días Agar Saboureaud Recuento de mohos y levaduras ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 18

8 C. ENTEROBACTERIAS Cada vez es más frecuente recurrir a la determinación de microorganismos indicadores para determinar la inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una serie de requisitos: - fácil y rápido de detectar - fácilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento - tener antecedentes de asociación con el patógeno del que es indicador - ser un microorganismos con cifras, que en teoría coincidan con las del patógeno a indicar - tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patógeno - tener una tasa de muerte paralela a del patógeno y que persista algún tiempo más que este - no existir en alimentos exentos del patógeno, salvo en cantidades mínimas Actualmente se reconocen 29 géneros de enterobacterias, que incluyen más de 100 especies diferentes. El 99% de los aislamientos clínicos pertenecen únicamente a 23 especies. Atendiendo a su poder patógeno se dividen en dos grupos: - Enterobacterias patógenas: EScherichia coli enteropatógeno, Shigella, Salmonella, Yersinia - Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación fecal, y como uno de los indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza como indicador de la calidad microbiológica de alimentos procesados, y recuentos elevados señalan una elaboración inadecuada o una contaminación posterior, o ambas cosas a la vez; siempre implica un riesgo higiénico-sanitario. Métodos normalizados ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificación, de las Enterobacteriaceae. Técnica del NMP y método por recuento de colonias Esta directiva expone dos métodos para el recuento de enterobacterias. El primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminación baja (1 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentración, una cantidad determinada de la muestra problema si la muestra es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35º C ó 37º C (según acuerdo) durante 24 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de ensayo mediante la tabla NMP. El segundo método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami- ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 19

9 nar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C ó 37º C durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de Petri NF V Método de rutina para la enumeración de Enterobacteriaceae mediante el recuento de colonias Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 30º C durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de Petri. ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 20

10 ESQUEMA: enteroba cterias ISO7402 AF V g muestra + 90 ml agua peptona 10-1 Diluciones decimales 1ml ml 1ml 1ml Incubación 30ºC / 24 horas Agar VRBG + 2ª capa Recuento. Colonias Rosas ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 21

11 D. COLIFORMES TOTALES En conjunto los coliformes están representados por cuatro géneros de la familia Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son fermentadores de la lactosa en 48 horas. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y también en el suelo, las plantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de contaminación fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario poco satisfactorio. En un recuento de coliformes es conveniente determinar la incidencia de E. coli dado que es la especie más indicativa de una contaminación fecal. Hay que destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador en ciertos alimentos: - Productos lácteos: reflejan el estado higiénico del establo y de la planta industrial, no es indicador de contaminación fecal - Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. coli puede ser indicativo de que en el proceso existe algún problema. Los coliformes están habitualmente asociados con la vegetación - Derivados de aves de corral: los coliformes no son indicadores higiénicos apropiados, las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio A pesar de todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres de inocuidad. Su principal aplicación como integrantes de un programa para la determinación de la inocuidad de los alimentos la tienen dentro del sistema APPCC. Pueden crecer en presencia de sales biliares, que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas, siendo esta característica suficiente para hacer determinaciones presuntivas. Su facilidad de cultivo y de diferenciación los hace casi ideales como indicadores. Métodos normalizados I SO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. A continuación, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la primera dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 30, 35 ó 37º C durante 24 horas para los de doble concentración, y horas los de concentración simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en la campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmación (BGBL). La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham, ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 22

12 como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares. Se realizan las lecturas a las horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo. NF V Método de rutina para la enumeración de coliformes mediante el recuento de colonias a 30º C. Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta lactosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 30º C 24 horas. Cálculo del número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características obtenidas en las placas de Petri. ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 23

13 ESQUEMA: Coliformes tota les ISO g muestra + 90 ml agua peptona 10 ml 10 ml 1 ml Caldo lactosado (con campana Durham) 37ºC / 48 horas Gas = + Confirmación ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 24

14 Coliformes tota les ISO4831 Confirmación Tubos positivos Asa de siembra 45ºC / 24 horas Tubos con Caldo Verde brillante con campana Durham Gas = + COLIFORMES TOTA LES NF V g muestra + 90 ml agua peptona 10-1 Diluciones decimales 1ml ml 1ml 1ml Agar VRBA Incubación 30ºC / 24 horas ANALIZA CALIDAD Departamento de Formación 25

15 Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90.0 ml de solucion diluyente Adicionar de 15 a 20 ml de agar triptona extracto de levadura fundido y enfriado a 45 C en Depositar 1.0 ml de cada dilución en cajas de Petri estériles por duplicado Homogeneizar la muestra y el agar mediante Incubar las cajas en posición invertida A 37 C por 24 a 48 h Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como UFC/g o ml de muestra Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química, UNAM 4