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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 39/12 C12N /37 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Vacuna polinucleótida contra el virus del papiloma. k Prioridad: US k 73 Titular/es: Merck & Co., Inc. 126, East Lincoln Avenue P.O. Box 00 Rahway New Jersey , US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Donnelly, John J.; Liu, Margaret A.; Martinez, Douglas y Montgomery, Donna L. k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Vacuna polinucleótida contra el virus del papiloma Campo de la invención Esta invención se refiere a la producción y uso de un producto farmacéutico novedoso: un ácido nucleico que, cuando se introduce directamente en tejido vivo de vertebrados, induce una respuesta inmunitaria que reconoce específicamente el virus del papiloma. Antecedentes de la invención Las infecciones por virus del papiloma (PV) ocurren en una variedad de animales, incluyendo humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y ganado vacuno. Los virus del papiloma infectan las células epiteliales, generalmente induciendo tumores epiteliales o fibroepiteliales benignos en el lugar de la infección. Los virus del papiloma son agentes infectivos específicos de especie; por ejemplo un virus del papiloma humano generalmente no infecta a un animal no humano. Los virus del papiloma pueden clasificarse en grupos diferentes basándose en el hospedador que infectan. Los virus del papiloma humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de tipos basándose en la homología de la secuencia de ADN (véase Papilloma viruses and Human Cancer, H. Pfister (editores), CRC Press, Inc., 1990). Las infecciones por virus del papiloma parecen inducir respuestas inmunógenas específicas de tipo ya que una inmunidad que neutraliza la infección de un tipo de virus del papiloma puede no conferir inmunidad contra otro tipo de virus del papiloma. En los humanos, tipos diferentes del HPV provocan enfermedades diferentes. Los tipos del HPV 1, 2, 3, 4, 7, y provocan verrugas benignas en individuos normales e inmunocomprometidos. Los tipos del HPV, 8, 9, 12, 14,, 17, 19-2, 36 y 46-0 provocan lesiones planas en individuos inmunocomprometidos. Los tipos del HPV 6, 11, 34, 39, y 1- provocan condilomata no maligno del conducto genital. Los tipos del HPV 16 y 18 provocan displasia epitelial del tracto genital y se asocian a la mayoría de los carcinomas in situ e invasivos de cuello uterino, vagina, vulva y conducto anal. Los estudios inmunológicos en sistemas animales han demostrado que la producción de anticuerpos que neutralizan a los antígenos del virus del papiloma previene la infección con el virus homólogo. El desarrollo de vacunas efectivas contra el virus del papiloma humano ha sido frenado por la incapacidad de cultivar los virus del papiloma in vitro. El desarrollo de una vacuna del HPV efectiva ha sido frenado particularmente por la ausencia de un hospedador animal adecuado para el estudio directo del HPV. La neutralización del virus del papiloma por anticuerpos parece ser específica de tipo y dependiente de epítopos configuracionales en la superficie del virus. (Documento WO-A-8816). Los virus del papiloma son virus de ADN pequeños (0- nm), no-encapsulados, con forma de icosahedro que codifican genes tempranos y tardíos. Los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genomas del virus se designan E1 a E7 y L1 y L2, donde E denota temprano y L denota tardío. L1 y L2 codifican las proteínas de la cápsida del virus. E1 a E3 y E a E7 están asociados a funciones como la replicación y transformación virales. La proteínal1eslaproteína principal de la cápsida y tiene un peso molecular de -K. La proteína L2 es una proteína menor de la cápsida que tiene un peso molecular previsto de aproximadamente K y un peso molecular aparente de 7-0 K según se ha determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos de microscopía electrónica e inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteínal2esinternaalaproteína L1. Las proteínas L2 están altamente conservadas entre los diferentes virus del papiloma, especialmente los aminoácidos básicos del extremo C. El ORF L1 está altamente conservado entre los diferentes virus del papiloma. Los genes L1 y L2 se han usado para generar proteínas recombinantes para su uso potencial en la prevención y tratamiento de infecciones del virus del papiloma. Zhou y cols. clonaron los genes L1 y L2 del HPV tipo 16 en un vector de virus vaccinia y e infectaron células de mamífero CV-1 con el vector recombinante para producir partículas viroides (VLP). Estos estudios se interpretaron como que establecían que la expresión de proteínas L1 y L2 del HPV tipo 16 en las células epiteliales es necesaria y suficiente para permitir el ensamblaje de VLP. La expresión de proteína L1 sola o proteína L2 sola o la doble infección de células con vectores de virus vaccinia recombinantes individuales que contienen genes L1 y L2 no produjeron partículas. 2

3 Se han generado L1 y L2 recombinantes del virus del papiloma bovino derivadas de bacterias. El suero que neutraliza las proteínas bacterianas recombinantes reaccionó entrecruzadamente con virus nativos a niveles bajos, presumiblemente debido a diferencias en las conformaciones de las proteínas nativas y derivadas de bacterias. Se han usado baculovirus recombinantes que expresan L1 del HPV16 o L2 del HPV16 para infectar células SF9 de insectos y producir proteínas L1 y L2 recombinantes. Los análisis por transferencia de Western demostraron que las proteínas L1 y L2 derivadas de baculovirus reaccionaban con el anticuerpo contra HPV16. También se ha demostrado la producción de proteínas L1 del HPV 16 y L2 del HPV 16 por cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Dado que los linfocitos T citotóxicos (CTL) tanto en ratones como en humanos son capaces de reconocer los epítopos derivados de proteínas virales internas conservadas y se cree que son importantes en la respuesta inmunitaria contra los virus, los esfuerzos se han dirigido al desarrollo de vacunas de CTL capaces de proporcionar protección heteróloga contra diferentes cepas virales. Se sabe que los CTL CD8 + destruyen células infectadas con virus cuando sus receptores celulares T reconocen péptidos virales asociados a las moléculas de clase I de MHC. Estos péptidos se derivan de proteínas virales sintetizadas de forma endógena, independientemente de la localización o función de la proteína dentro del virus. Así, al reconocer los epítopos de proteínas virales conservadas, los CTL pueden proporcionar protección cruzada contra otras cepas. Los péptidos capaces de asociarse con el MHC clase I para el reconocimiento de CTL se originan a partir de proteínas que están presentes o pasan a través del citoplasma o del retículo endoplásmico. Por lo tanto, en general, las proteínas exógenas, que entran en la ruta de procesamiento endosómico (como es el caso de los antígenos presentados por las moléculas del MHC clase II), no son efectivas para generar respuestas de CTL CD8 +. Los esfuerzos para generar respuestas de CTL han incluido el uso de vectores replicantes para producir el antígeno proteínico en la célula o se han centrado en la introducción de péptidos al citosol. Estas dos estrategias tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales tienen las restricciones de tamaño y estructura de los polipéptidos que pueden expresarse como proteínas de fusión manteniendo a la vez la capacidad del virus recombinante de replicarse, y la efectividad de los vectores como vaccinia para inmunizaciones subsiguientes puede estar comprometida por respuestas inmunitarias contra los vectores mismos. También los vectores virales y patógenos modificados tienen riesgos inherentes que pueden impedir su uso en humanos. Además, la selección de epítopos peptídicos para ser presentados depende de la estructura de los antígenos del MHC de cada individuo y, por lo tanto, las vacunas peptídicas pueden tener una efectividad limitada debido a la diversidad de haplotipos de MHC en poblaciones heterógamas. Se ha demostrado que la inoculación intramuscular de construcciones de polinucleótidos, es decir, plásmidosdeadnquecodificanproteínas, dan como resultado la generación in situ de la proteína en las células musculares. Al usar plásmidos de ADNc que codifican proteínas virales, pueden generarse respuestas de anticuerpos que pueden proporcionar protección homóloga contra exposiciones subsiguientes. El uso de vacunas polinucleotídicas (PNV) para generar anticuerpos puede dar como resultado una duración mayor de la respuesta de los anticuerpos así como la provisión de un antígeno que puede tener las modificaciones y conformaciones postraduccionales apropiadas de la proteína nativa (al contrario que una proteína recombinante). Las proteínas virales producidas in vivo después de la inmunización con PNV pueden asumir su configuración nativa, provocando así la producción de anticuerpos que neutralizan el virus. La generación de respuestas de CTL por este medio ofrece los beneficios de la protección cruzada contra otras cepas sin usar un vector vivo potencialmente patógeno o virus atenuados. Benvenisty y cols. informaron que podía expresarse el ADN precipitado mediante CaCl 2 introducido por vía intraperitoneal, intravenosa o intramuscular en ratones. Más recientemente, se informó que la inyección intramuscular (i.m.) de los vectores de expresión de ADN en ratones daba como resultado la captación del ADN por los miocitos y la expresión de la proteína codificada por el ADN (J. A. Wolf y cols., 1990; G. Ascadi y cols., 1991). Se demostró que los plásmidos inyectados se mantenían fuera de los cromosomas y no se replicaban. Subsiguientemente, se ha informado de la expresión persistente después de la inyección intramuscular en el músculo esquelético de ratas, peces y primates, y en el músculo cardiaco de ratas. En el documento WO90/192 (4 de octubre de 1990), se informaba de la técnica del uso de ácidos nucleicos como agentes inmunógenos, en la que se usaban polinucleótidos desnudos para vacunar vertebrados. 3

4 2 3 El procedimiento no se limita a la inyección intramuscular. Por ejemplo, la introducción de microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifica la hormona de crecimiento bobina (BGH) en la piel de ratones dio como resultado la producción de anticuerpos contra BGH en los ratones. Se ha usado un inyector de propulsión para transfectar piel, músculo, grasa y tejidos mamarios de animales vivos. Los diversos procedimientos para introducir los ácidos nucleicos fueron revisados por Donnelly, Ulmer y Liu (The Immunologist, 2:, 1994). La necesidad de agentes terapéuticos específicos capaces de producir las respuestas inmunitarias profilácticas deseadas contra los patógenos virales es cubierta para el virus del papiloma por esta invención. Por lo tanto, esta invención proporciona vacunas con vectores que codifican proteínas virales del virus del papiloma humano que inducen CTL y anticuerpos específicos. La eficacia protectora de la vacunación con ADN contra una exposición subsiguiente al virus se demuestra mediante la inmunización con plásmidos de ADN no replicantes que codifican una o más de las proteínas virales mencionadas anteriormente. Esto es ventajoso ya que no implica ningún agente infeccioso, no se requiere el ensamblaje de partículas virales, y permite una selección determinante. Además, debido a que la secuencia de algunos de los productos génicos se conserva entre los diversos tipos de virus del papiloma, se posibilita la protección contra la exposición subsiguiente a un tipo de virus del papiloma diferente que es homólogo o heterólogo a la cepa de la que se obtiene el gen clonado. Sumario de la invención Una vacuna que comprende un vector que comprende: (a) un polinucleótido que codifica un gen del virus del papiloma humano (HPV) seleccionado del HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16 y HPV18, expresando este polinucleótido al menos una de las proteínas L1oL1+L2; (b) un promotor de CMV para la transcripción mediante ARN polimerasa; (c) un factor de terminación transcripcional de un gen de la hormona de crecimiento bovino; y (d) un gen marcador de resistencia a la neomicina; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna que se menciona anteriormente en la que el vector es V1Jneo o V1Jns. Breve descripción de los dibujos 4 0 La Figura 1 muestra la respuesta de los anticuerpos que neutralizan el virus inducida en conejos a los que se inyecta ADN de L1 de CRPV, o una mezcla de ADN de L1 y L2 (eje y), y las valoraciones mediante ELISA que la inducen. Figura 2. Respuestas de los anticuerpos de conejos a los que se inyecta ADN de L1. Se muestran Las valoraciones de ELISA contra VLP de L1 de conejos a los que se administra una única inmunización con una dosis seleccionada arbitrariamente de 1 mg de ADN de L1. Los conejos a los que se inyecta el ADN control no produjeron anticuerpos detectables contra VLP de L1. Figura 3. Efecto de la absorción con VLP de L1 del antisuero obtenido por inmunización con ADN de L1. A, Suero normal, y suero inmunitario absorbido con VLP nativas o desnaturalizadas como en (), se analizaron para determinar la actividad de neutralización del virus. Se muestran las áreas medias de condilomas en 3 sitios de exposición, medidas 7 semanas después de la exposición. B, Absorción en serie de suero inmunitario de un conejo al que se había inyectado ADN de L1 tres veces con VLP de L1 nativas (círculos) o desnaturalizadas (cuadrados) expresadas en una cepa de levadura recombinante (Saccharomyces cerevisiae). Después de cada absorción en serie, se ensayaron alícuotas de suero para determinar la actividad de los anticuerpos contra VLP de L1 derivadas de baculovirus mediante ELISA. La valoración por ELISA del material absorbido se representa como porcentaje de la valoración de ELISA original del suero no absorbido. Figura 4. Respuestas de ELISA en ensayos para determinar anticuerpos contra CRPV E2 (A) y CRPV E7 (b). Se muestra la velocidad de reacción neta (velocidad posterior a la dosis 4 menos la velocidad preinmunitaria con la misma dilución) en mdo/min se muestra para cada conejo individual. 4

5 Descripción detallada de la invención 2 3 Las construcciones de ADN que codifican productos génicos de virus del papiloma, capaces de expresarse por la introducción directa en tejidos animales son fármacos novedosos profilácticos y terapéuticos que pueden proporcionar protección inmunitaria contra la infección por virus del papiloma. Polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un animal vertebrado como conejos comunes y seres humanos, induce la expresión de los péptidos codificados en los tejidos del animal. Cuando el péptido es uno que no aparece en ese animal excepto durante las infecciones, como las proteínas asociadas al virus del papiloma (PV), el sistema inmunitario del animal se activa para lanzar una respuesta protectora. Debido a que estas proteínas exógenas son producidas por células del animal hospedador, son procesadas y presentadas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Este reconocimiento es análogo al que ocurre con la infección real con el organismo relacionado. El resultado, como se muestra en la presente memoria, es la inducción de respuestas inmunitarias que pueden proteger contra la infección virulenta. Según se usa en la presente memoria, un polinucleótido es un ácido nucleico que contiene elementos reguladores esenciales que al ser introducidos en una célula de vertebrado vivo, es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por los genes que comprenden el polinucleótido. Existen muchas realizaciones de la presente invención que los expertos en la materia pueden apreciar a partir de la especificación. Por ejemplo, pueden usarse diferentes promotores, y terminadores trascripcionales, vectores vehículo o secuencias génicas específicas. Ácidos nucleicos que cuando se introducen en tejidos animales in vivo inducen la expresión del producto génico del virus del papiloma. Así, por ejemplo, la inyección de construcciones de ADN en el músculo de conejos induce la expresión de los productos genéticos codificados y provoca anticuerpos que neutralizan el virus. Al ser expuestos subsiguientemente al virus del papiloma de conejo común (CRPV), usando dosis que causan lesiones a todos los conejos control, los animales que habían recibido la vacuna polinucleotídica exhiben lesiones muy reducidas. Así, esta invención describe una vacuna de utilidad en humanos para prevenir las infecciones por virus del papiloma. Las construcciones de ADN que codifican proteínas virales de papiloma provocan respuestas inmunitarias protectoras en los animales. Como se describirá en más detalle a continuación, las respuestas inmunitarias en animales han incluido anticuerpos que neutralizan virus y protección contra la exposición a virus en conejos con tipos homólogos de virus del papiloma. El producto de vacunación consistirá en plásmidos de ADN separados que codifican, por ejemplo, las proteínas L1, L2, E2, E4 del virus del papiloma, ya sean solas o combinadas. 4 0 Las ventajas anticipadas sobre otras vacunas incluyen pero sin limitación una mayor amplitud de protección debido a las respuestas de CTL, mayor amplitud de anticuerpos, y mayor duración de la protección. En una realización de la invención, se clona en un vector de expresión las secuencias de proteínas L1 o L2 o L1+L2 del HPV tipo 6a, 6b, 11, 16 ó 18, obtenidas de aislamientos clínicos. El vector contiene un promotor de CMV para la trascripción mediante la ARN polimerasa, un terminador transcripcional al final de la secuencia codificante del HPV. Los ejemplos de terminadores transcripcionales incluyen pero sin limitación BGH. Además, para ayudar a la preparación del fármaco, también se incluye en el vector de expresión un marcador de resistencia a la neomicina en E. coli. Además, para ayudar al elevado nivel de producción del fármaco mediante fermentación en organismos procarióticos, es ventajoso que el vector contenga un origen de replicación y que sea de un elevado número de copias. Varios vectores de clonación procarióticos disponibles en el mercado proporcionan estos beneficios. Es deseable eliminar las secuencias de ADN no esenciales. Por lo tanto, esta invención contiene vectores de expresión que codifican una proteína PV como inmunógeno. La invención ofrece un medio para inducir inmunidad protectora de tipo cruzado sin necesidad de agentes autorreplicantes. Además, la inmunización con ADN ofrece otras ventajas adicionales. Primero, esta estrategia de vacunación debe poder aplicarse a los tumores así como a los agentes infecciosos, dado que la respuesta de los CTL CD8 + es importante para la intervención inmunológica en ambos procesos patofisiológicos. Por lo tanto, al provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína crucial para el proceso de transformación puede ser un medio efectivo de inmunoterapia o protección contra el cáncer. Segundo, la generación de anticuerpos contra proteínas expresadas después de la inyección de

6 ADN que codifica una proteína viral sugiere que esta tecnología proporciona un medio fácil y efectivo para hacer vacunas que inducen anticuerpos. La facilidad para producir y purificar construcciones de ADN supera la de la purificación de proteínas tradicional, lo que facilita la generación de vacunas combinadas. De este modo, pueden prepararse, mezclarse y administrarse al mismo tiempo construcciones múltiples, por ejemplo construcciones que codifican proteínasl1yl2deunoomás tipos del HPV. Finalmente, dado que la expresión de las proteínas puede mantenerse durante un periodo de tiempo después de la inyección del ADN, puede potenciarse la memoria de los linfocitos B y T, engendrando así una inmunidad humoral y mediada por células de larga duración. Las limitaciones de las vacunas contra HPV propuestas enfatizan la necesidad del desarrollo de medios más efectivos para la prevención de la infección y la mejora de la enfermedad. La generación de una respuesta de CTL mejorada contra una proteína conservada puede proporcionar una inmunidad significativa de reactividad cruzada a largo plazo. Los inventores han demostrado la expresión de proteínas a partir de construcciones de PNV en los conejos por detección de la respuesta inmunitaria del hospedador dirigida contra antígenos de CRPV. Los resultados de estos experimentos animales indican que la inyección directa de ADN puede proporcionar un procedimiento para la protección de los humanos contra la infección y enfermedad por HPV. Se compara un intervalo de dosis para determinar la inmunogenia para optimizar las concentraciones a usar. Puede predecirse que dosificaciones de, 0, 0 y 0 µg sean eficaces en el hombre La eficacia en humanos se demuestra con voluntarios que reciben una vacuna de ADN contra HPV. La composición, dosis y regímenes de administración de la vacuna se basan en los estudios anteriores. La eficacia clínica se demuestra por la tasa de infección, enfermedad, calificaciones, y duración de la enfermedad. Estos hallazgos clínicos se comparan con la evaluación en laboratorio de la respuesta inmunitaria del hospedador y la detección viral para determinar los marcadores indirectos que se correlacionan con la protección. La biología molecular para preparar y purificar las construcciones de ADN permite la preparación de los fármacos de ADN de esta invención. Mientras que las técnicas estándar de la biología molecular son suficientes para la producción de los productos de esta invención, las construcciones específicas descritas en el presente documento proporcionan una terapia novedosa que puede inducir una protección cruzada contra otras cepas. La cantidad de ADN expresable a introducir en un receptor de la vacuna dependerá de la potencia de los promotores de trascripción y traducción usados en la construcción de ADN, y de la inmunogenia del producto génico expresado. En general, se administra una dosis inmunológicao profilácticamente efectiva de aproximadamente 1 µg a 1 mg, y preferiblemente de aproximadamente µg a 0 µg directamente en el tejido muscular. Se contemplan también la inyección subcutánea, la introducción intradérmica, la impresión a través de la piel, y otros modos de administración como la administración intraperitoneal, intravenosa o por inhalación. Se contempla también que pueden proporcionarse vacunas de recuerdo. El polinucleótido puede estar desnudo, es decir, no asociado a ninguna proteína, adyuvantes u otros agentes que afecten el sistema inmunitario del receptor. En este caso, es deseable que el polinucleótido esté en una solución fisiológicamente aceptable como, pero sin limitación, solución salina estéril o salina tamponada estéril. De forma alternativa, el polinucleótido puede estar asociado a liposomas, como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, en forma de mezcla de ADN y liposoma, o el ADN puede estar asociado a un adyuvante que se sabe en la técnica que potencia las respuestas inmunitarias, como una proteína u otro vehículo. También pueden usarse ventajosamente agentes que ayudan a la captación de ADN a las células, tales como, pero sin limitación, iones de calcio, proteínas virales y otros agentes que facilitan la transfección. Estos agentes se denominan generalmente agentes facilitadores de la transfección y como vehículos farmacéuticamente aceptables. Existen diversas ventajas de la inmunización con un gen en vez del producto de un gen. Una ventaja es la simplicidad relativa con la que puede presentarse el antígeno nativo o casi nativo al sistema inmunitario. Otra ventaja de la inmunización con polinucleótidos es el potencial de que el inmunógeno entre en la ruta del MHC clase I y provoque una respuesta de linfocitos T citotóxicos. Dado que la inmunización con polinucleótidos puede provocar tanto respuestas humorales como mediadas por linfocitos, otra ventaja puede ser que proporciona un procedimiento relativamente simple de examinar un 6

7 gran número de genes virales y tipos virales para determinar el potencial de la vacuna. La inmunización mediante la inyección de polinucleótidos permite también formar vacunas multicomponente mezclando los componentes individuales Según se usa en la presente memoria, el término gen se refiere a un segmento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido discontinuo. Los términos fármaco y vacuna se usan de forma intercambiable para indicar composiciones de utilidad para inducir respuestas inmunitarias. Los términos construcción yplásmido se usan de forma intercambiable. El término vector se usa para indicar un ADN en el que pueden clonarse genes para su uso de acuerdo con el procedimiento de esta invención. En esta invención, el polinucleótido codifica otra proteína del PV, como L1 o L2 o combinaciones de las mismas. En esta invención, la construcción de la vacuna codifica proteínas del HPV de los tipos 6a, 6b, 11, 16 ó 18, en los que la construcción de ADN es capaz de expresarse al ser introducida en los tejidos animales in vivo y de inducir una respuesta inmunitaria contra el producto expresado del gen del HPV codificado. Los ejemplos de construcciones de ADN que codifican genes del HPV incluyen: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1J-E3, V1J-E4, V1J-E, V1J-E6, V1J-E7, V1J-E1i E4, V1J-E1 E4-L1, V1J-E2-C. Los ejemplos de construcciones de ADN que codifican genes de CRPV incluyen: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1J-E3, V1J-E4, V1J-E, V1J-E6, V1J-E7, V1J-E1i E4, V1J-E1 E4-L1, V1J-E2-C. Las composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden el ADN pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos como la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos y procedimientos de formulación pueden encontrarse en Remington s Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración efectiva, tales composiciones contendrán una cantidad efectiva del ADN del HPV. Las composiciones terapéuticas o diagnósticas se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar infecciones de PV. La cantidad efectiva puede variar de acuerdo con una variedad de factores como la afección del individuo, peso, sexo y edad. Otros factores incluyen el modo de administración. Generalmente, las composiciones se administrarán en dosis que varían desde aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 1 miligramo. Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse al individuo por diversas vías como subcutánea, tópica, oral e intramuscular. Las vacunas de la invención comprenden ADN del HPV que codifica proteínas recombinantes del HPV que contienen los determinantes antígenos que inducen la formación de anticuerpos neutralizadores en el hospedador humano. Tales vacunas son también lo suficientemente seguras para administrarse sin peligro de infección clínica; no tienen efectos secundarios tóxicos; pueden administrarse por una vía efectiva; son estables; y son compatibles con los vehículos de las vacunas. Las vacunas pueden administrarse por diversas vías, como la oral, parenteral, subcutánea o intramuscular. La dosis administrada puede variar dependiendo de l afección, sexo, peso, y edad del individuo; la vía de administración; y el tipo de PV de la vacuna. La vacuna puede usarse en formas de dosificación como cápsulas, suspensiones, elixires, o soluciones líquidas. La vacuna puede formularse con un vehículo inmunológicamente aceptable. Las vacunas se administran en cantidades profiláctica o terapéuticamente efectivas, es decir, en cantidades suficientes para generar una respuesta inmunológicamente protectora. La cantidad efectiva puede variar de acuerdo con el tipo de PV. La vacuna puede administrarse en dosis únicas o múltiples. Los procedimientos hacen posible la formulación de vacunas monovalentes y multivalentes para prevenir la infección por PV. Usando los procedimientos, pueden hacerse vacunas contra PV monovalentes o multivalentes. Por ejemplo, puede hacerse una vacuna contra HPV tipo 16 monovalente formulando un ADN que codifica la proteína L1 o la proteína L2 o las proteínas L1+L2 del HPV 16. De forma alternativa, puede formularse una vacuna del HPV multivalente mezclando el ADN que codifica las proteínas L1 o L2 o L1+L2 del HPV de diferentes tipos del HPV. El ADN puede usarse para generar anticuerpos. El término anticuerpo según se usa en el presente 7

8 documento incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como los fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 que son capaces de unirse al antígeno o hapteno. El ADN de PV y los anticuerpos pueden usarse para serotipar la infección del HPV o de CRPV y para la detección del HPV. Los ADN del HPV y CRPV y los anticuerpos se prestan a la formulación de kits adecuados para la detección y serotipado del HPV o CRPV. Un kit así comprendería un transportador con compartimientos adecuado para mantener en un confinamiento cerrado al menos un envase. El transportador comprendería además reactivos como ADN del HPV o anticuerpos contra HPV adecuados para detectar varios tipos de HPV. El transportador puede contener también medios para la detección como sustratos de antígenos o enzimas marcados o similares. Los siguientes ejemplos se proporcionan para definir adicionalmente la invención sin, sin embargo, limitar la invención a los particulares de estos ejemplos. Ejemplo 1 Vectores para la producción de vacunas 2 A) V1: El vector de expresión V1 se construyó a partir de pcmvie-aki-dhfr [Y. Whang ycols., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Los genes AKI y DHFR se eliminaron cortando el vector con EcoRI y autoligamiento. Este vector no contiene el intrónaenelpromotordecmv,deformaqueseañadió enforma de fragmento de PCR y tenía un sitio Sac I interno eliminado [en 18 siguiendo la numeración de B.S. Chapman y cols., Nuc. Acids Res. 19, 3979 (1991)]. La plantilla usada para las reacciones de PCR fue pcmvinta-lux, formado ligando los fragmentos Hind III y Nhe I de pcmv6a1 [véase B.S. Chapman y cols., referencia anterior], que incluye el potenciador/promotor hcmv-ie1 y el intrón A, en los sitios Hind III y Xba I de pbl3 para generar pcmvintbl. El fragmento del gen de luciferasa de 1881 pares de bases (fragmento Klenow insertado con Hind III-Sma I) de RSV-Lux [J.R. de Wet y cols., Mol. Cell Biol. 7, 72, 1987] se clonó en el sitio Sa1 I de pcmvintbl, en el que se insertó el fragmento Klenow y se trató con fosfatasa. Los cebadores que abarcaban el intrón A son: Cebador, -CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3 ; (SEC. ID. N :1) 3 Cebador 3, -GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3 ; (SEC. ID. N :2) Los cebadores usados para eliminar el sitio Sac I son: Cebador homosentido, SEC. ID: 3 -GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3 ; y Cebador antisentido, SEC. ID: 4 4 -GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3. El fragmento de PCR se cortó con Sac I y Bgl II y se insertó en el vector que había sido cortado con las mismas enzimas. 0 B) Vector de expresión V1J, SEC. ID: La intención de los autores al crear V1J era la de eliminar los elementos promotores y de terminación de la transcripción de su vector, V1, para colocarlos en un contexto más definido, crear un vector más compacto, y mejorar los rendimientos de purificación de los plásmidos. V1J se deriva de los vectores V1 y puc19, un plásmido disponible en el mercado. V1 se digirió con las enzimas de restricción SspI y EcoRI produciendo dos fragmentos de ADN. El más pequeño de estos fragmentos, que contenía los elementos del promotor CMVintA y de terminación de la transcripción de la hormona de crecimiento bovina (BGH) que controlan la expresión de genes heterólogos se purificó por electroforesis en gel de agarosa. Los extremos de este fragmento de ADN se dejaron romos usando la enzima ADN polimerasa de T4 para facilitar su ligado a otro fragmento de ADN con extremos romos. 8

9 2 Se eligió puc19 para proporcionar el esqueleto del vector de expresión. Se sabe que produce altos rendimientos de plásmido, está bien caracterizado por secuencia y función, y es de tamaño mínimo. Los autores eliminaron el operón lac completo de este vector, que era innecesario para sus fines y puede ser perjudicial para los rendimientos de los plásmidos y la expresión génica heteróloga, mediante digestión parcial con la enzima de restricción HaeII. El plásmido restante se purificó a partir de un gel de electroforesis de agarosa, sus extremos se hicieron romos con la ADN polimerasa de T4, se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero, y se ligó al elemento CMVintA/BGH descrito anteriormente. Se obtuvieron los plásmidos que mostraban cualquiera de las dos orientaciones posibles de los elementos promotores en el esqueleto de puc. Uno de estos plásmidos dio rendimientos mucho más elevados de ADN en E. coli y se designó V1J. Se verificó la estructura de este vector mediante análisis de secuencia de las regiones de unión y se demostró subsiguientemente que daba una expresión comparable o superior de genes heterólogos en comparación con V1. C) Vector de expresión V1Jneo,SEC.ID:6 Fue necesario eliminar el gen amp r usado para la selección antibiótica de las bacterias que portaban V1J porque no puede usarse ampicilina en fermentadores a gran escala para la producción de productos clínicos humanos. Se eliminó elgenamp r del esqueleto puc de V1J mediante digestión con enzimas de restricción SspI y Eam1 I. El plásmido restante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, los extremos se dejaron romos usando la enzima ADN polimerasa de T4, y después se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero. Se escindió elgenkan r disponible comercialmente, derivado del trasposón 903 y contenido en el plásmido puc4k, usando la enzima de restricción PstI, se purificó por electroforesis en gel de agarosa, y sus extremos se dejaron romos usando la enzima ADN polimerasa de T4. Este fragmento se ligó con el esqueleto de V1J y se derivaron los plásmidos con el gen kan r en cualquiera de las dos orientaciones que se designaron V1Jneo n 1 y 3. Se confirmó cada uno de estos plásmidos por análisis mediante digestión con enzimas de restricción, secuenciación de ADN de las regiones de unión, y se demostró que producían cantidades de plásmido similares a V1J. La expresión de los productos génicos heterólogos era también comparable a la de V1J para estos vectores V1Jneo. Los autores arbitrariamente seleccionaron V1JneoN 3, denominado en lo sucesivo V1Jneo, que contiene el gen kan r en la misma dirección que el gen amp r como construcción de expresión. D) Vector de expresión V1Jns 3 Se añadió un sitio Sfi I al V1Jneo para facilitar los estudios de integración. Se añadió un ligante de Sfi I de 13 pares de bases disponible en el mercado (New England BioLabs) en el sitio Kpn I dentro de la secuencia de la BGH del vector. Se linearizó V1Jneo con Kpn I, se purificó en gel, sus extremos se hicieron romos mediante ADN polimerasa de T4, y se ligaron al ligante Sfi I romo. Se eligieron los aislados clonales mediante mapeo de restricción y se verificaron por secuenciación a través del ligante. El nuevo vector se designó V1Jns. La expresión de genes heterólogos en V1Jns (con Sfi I) fue comparable a la expresión de los mismos genes en V1Jneo (con Kpn I). Ejemplo Preparación de construcciones de ADN que codifican proteínas del virus del papiloma de conejo común La fuente del ADN de CRPV de todos los genes clonados es CRPV-pLAII. Este es el genoma de CRPV completo clonado en pbr322 en el sitio Sal I (Nasseri, M., Meyers, C. y Wettstein, F. O. (1989). Genetic analysis of CRPV pathogenesis: The L1 open reading frame is dispensable for cellular transformation but is required for papilloma formation, Virology 170, ). 1. V1Jns-L1: La secuencia codificante L1 se generó por PCR, usando el ADN de CRPV-pLAII como plantilla. Los cebadores de la PCR se diseñaron para contener sitios Bam HI para ser escindidos después de purificar en gel el fragmento de PCR. Los cebadores utilizados para generar la región codificante L1 fueron: Cebador homosentido: GGTACAGGAT CCACCATGGC AGTGTGGCTG TCTACGCAG 3 (SEC. ID. N :7) Bam HI 9

10 Cebador antisentido: 2 CCACATGGAT CCTTAAGTAC GTCTCTTGCG TTTAGATG 3 (SEC. ID. N :8) Bam HI El fragmento de PCR se purificó engel,secortó con Bam HI y se ligó a V1Jns cortado con BgI II. 2. V1Jns-L2: Se generó la región codificante L2 mediante PCR. El vector CRPV-pLAII tiene el gen L2 alterado por el sitio Sal I usado para insertar CRPV en pbr322. Por lo tanto, se generó una plantilla para la PCR cortando CRPV-pLAII con SalI y ligando el ADN de CRPV en forma circular en el sitio Sal I. Este ADN de CRPV ligado se usó como plantilla para la PCR. Los cebadores de la PCR se diseñaron para contener sitios Bam HI para ser escindidos después de purificar en gel el fragmento de la PCR. Los cebadores utilizados para generar la región codificante L2 fueron: Cebador homosentido: GGTACAGGAT CCACCATGGT TGCACGGTCA CGAAAACGC 3 (SEC. ID. N :9) Bam HI Cebador antisentido: CCACATGGAT CCTTATTCTG CGTAGACAGC CACACT 3 (SEC. ID. N : ) Bam HI 3. V1Jns-E2: La región codificante E2 se genera por PCR, usando el ADN de CRPV-pLAII como plantilla. Los cebadores de la PCR se diseñaron para contener sitios Bgl II para ser escindidos después de purificar en gel el fragmento de la PCR. Los cebadores utilizados para generar la región codificante E2 fueron: Cebador homosentido: 3 GGTACAAGAT CTACCATGGA GGCTCTCAGC CAGCGCTTA 3 (SEC. ID. N : 11) Bgl II Cebador antisentido: 4 CCACATAGAT CTCTAAAGCC CATAAAAATT CCCTAAAAACAC 3 (SEC. ID. N : 12) Bgl II 4. V1Jns-E2: La región codificante E4 se genera por PCR, usando el ADN de CRPV-pLAII como plantilla. Los cebadores de la PCR se diseñaron para contener sitios Bgl II para ser escindidos después de purificar en gel el fragmento de la PCR. Los cebadores utilizados para generar la región codificante E4 fueron: 0 Cebador homosentido: GGTACAAGAT CTACCATGAG CCATGGACAT TGCAGGATAC 3 (SEC. ID. N : 13) Bgl II Cebador antisentido: CCACATAGAT CTTTATAAGC TCGCGAAGCC GTCTATTCC 3 (SEC. ID. N : 14) Bgl II. V1Jns-E2: La región codificante E7 se genera por PCR, usando CRPV-pLAII como plantilla en un caso y ADN purificado de la cepa Kreider de CRPV en otro caso. Se usaron los mismos cebadores de

11 la PCR para ambas plantillas. Los cebadores de PCR se diseñaron para contener sitios Bgl II para ser escindidos después de purificar en gel el fragmento de la PCR. 2 Los cebadores utilizados para generar la región codificante E7 fueron: Cebador homosentido: GGTACAAGAT CTACCATGAT AGGCAGAACT CCTAAGCTTA G 3 Bgl II Cebador antisentido: CCACATAGAT CTTCAGTTAC AACACTCCGG GCACAC 3 Bgl II 6. pgex-2t-e2: La región codificante E2 se generó por PCR como se describe para V1Jns-E2. El fragmento se clonó en pgex-2t en el sitio Bam HI para generar una fusión en marco con glutationa S-transferasa (GST). Esta construcción se usa para generar proteína en E. coli. 7. pgex-2t-e4: La región codificante E4 se generó por PCR como se describe para V1Jns-E4. El fragmento se clonó en pgex-2t en el sitio Bam HI para generar una fusión en marco con glutationa S-transferasa (GST). Esta construcción se usa para generar proteína en E. coli. 8. pgex-2t-e7: La región codificante E7 se generó por PCR como se describe para V1Jns-E7. El fragmento se clonó en pgex-2t en el sitio Bam HI para generar una fusión en marco con glutationa S-transferasa (GST). Esta construcción se usa para generar proteína en E. coli. Ejemplo 3 3 Purificación de plásmido de E. coli Las construcciones de V1J se cultivaron toda la noche hasta la saturación. Se recolectaron las células y se lisaron mediante una modificación de un procedimiento de SDS alcanino (Sambrook, J., FRITSCH, E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y., 2 ā ed. (1989). La modificación consistió en aumentar tres veces los volúmenes para la lisis celular y la extracción de ADN. El ADN se purificó por bandeo doble tinción cromosómica en bandas con gradientes de CsCl-EtBr. El bromuro de etidio se eliminó mediante extracción con 1-butanol. El ADN resultante se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Se resuspendió el ADN en TE (Tris mm, EDTA 1 mm), ph 8 para las transfecciones y NaCl al 0,9 % para la inyección a los ratones. La concentración y pureza de cada preparación de ADN se determinó mediante lecturas de DO 2/280. Las proporciones de 2/280 fueron 1,8. Ejemplo Producción de anticuerpos específicos contra CRPV in vitro Se extrajo sangre de cinco conejos por grupo y después se les inyectó 1,2 ml de solución salina que contenía 1 mg de V1Jns-L1, V1Jns-L2 V1Jns-L1 mezclado con V1Jns-L2 (un total de 2 mg), o V1Jns (vector control sin proteína codificada) solo. El inóculo se dividió en partes iguales entre seis sitios intramusculares en ambas patas traseras, ambas patas delanteras y la espalda inferior. Tres semanas después de la inyección inicial con ADN, se extrajo sangre a los conejos y se les administró una segunda inyección del mismo ADN del mismo modo. Cuatro semanas después de la segunda inyección, se extrajo sangre a los animales de nuevo. Se analizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpos neutralizadores de virus mezclando diluciones en serie de orden diez de suero inmunitario con una dilución 1:3 de solución madre de virus CRPV (cepa Kreider). Las diluciones se prepararon en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. La soluciónmadredeviruscrpv (comprado al Dr. J. Kreider, Hershey, PA) se preparó a partir de fragmentos de piel obtenidos en conejos comunes salvajes, que se infectaron con CRPV y se implantaron bajo las cápsulas renales de ratones atímicos. Los condilomas resultantes se homogeneizaron y aclararon por centrifugación para dar una 11

12 2 preparación madre de virus. Las mezclas de suero inmunitario y caldo de virus se incubaron sobre hielo durante al menos minutos, y después se aplicaron 0 µl de cada mezcla a un área de 1 cm 2 de piel afeitada, escarificada de la espalda de 3 conejos blancos de Nueva Zelanda. Se observó a los animales 7 semanas después para determinar la presencia de verrugas y se midieron las dimensiones anteroposteriores y laterales (en mm) de las verrugas elipsoidales. Se determinaron las valoraciones finales a partir de la frecuencia de verrugas a las diversas diluciones por interpolación de Reed-Muench. Las valoraciones de anticuerpos neutralizadores de los conejos a los que se inyectó ADNdeL1oADNdeL1yL2se representan en el eje y de la Figura 1. También se analizó mediante ELISA el suero de conejos a los que se había inyectado el ADN de L1 para determinar la presencia de anticuerpos. Se recubrieron placas de poliestireno de ELISA toda la noche a4 Ccon1µg/pocillo de proteína L1 de CRPV semipurificada, recombinante derivada de levaduras. El L1 recombinante se preparó en S. cerevisiae y se purificó como describen Kirnbauer y cols. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: , 1992) con modificaciones menores. Se añadieron los sueros diluidos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (agitando en una agitadora orbital). Después se lavaron las placas y se añadió IgG contra conejo obtenida en cabra marcada con peroxidasa de rábano (específica de Fc). Después de incubar durante 1 hora agitando, las placas se lavaron y se añadió sustrato. Las placas se leyeron a nm usando un lector de ELISA cinético (Molecular Devices Corp.), y los valores obtenidos se corrigieron para el fondo restando la velocidad de reacción del suero preinmunitario de la del suero posinmunización con la misma dilución. Se determinaron las valoraciones por interpolación de la curva resultante de velocidad de reacción corregida en función de la dilución con un valor de velocidad de mdo/minuto. Se representaron las valoraciones de ELISA de conejos a los que se había inyectado ADNdeL1oADNdeL1más L2 en el eje x de la Figura 1. La Figura 1 muestra que 12/13 sueros daban actividad neutralizadora positiva (log de la valoración 1, es decir, positivo con suero no diluido) dieron también positivo en el ELISA de anticuerpos (valoración de ELISA 0). Cuatro de los 4 sueros que daban negativo para el anticuerpo tenían valoraciones de ELISA. Todos los sueros de los conejos que recibieron ADN de L2 solo o el vector control V1J tuvieron valoraciones de ELISA inferiores a 0. Tomados conjuntamente estos datos muestran que se obtuvieron anticuerpos específicos para CRPV y capaces de neutralizarlo después de la inyección de ADN de L1. Las valoraciones de ELISA en conejos persistieron sin disminución durante al menos 32 semanas después de la inmunización (Figura 2). Ejemplo Protección de conejos expuestos a CRPV virulento Se inyectó a cinco conejos por grupo por vía intramuscular 1 mg de V1Jns-L1, V1Jns-L2, V1Jns-L1 mezclado con V1Jns-L2 (un total de 2 mg), o con V1Jns (vector control sin proteína codificada) solo, como se describe anteriormente. Tres semanas después de la inyección de ADN inicial, los conejos recibieron una segunda inyección del mismo ADN. Cuatro semanas después de la segunda inyección, se expuso alosconejosacrpv.laexposición a CRPV se realizó aplicando 0 µl de dos diluciones de solución madre de virus (diluido 1:2 ó1:12condmemmás BSA al 1 %) a sitios triplicados de 1 cm 2 de piel afeitada, escarificada de la espalda de cada conejo. Los sueros extraídos en el momento de la exposición de animales a los que se habíainyectadoadndel1oadndel1+l2contenían anticuerpos contra L1 según ELISA y anticuerpos neutralizadores de virus como se describe anteriormente. Los animales se observaron para determinar la formación de verrugas a las 3, 6 y semanas después de la exposición. En los conejos que no recibieron ADN de L1, 1 de 4 sitios expuestos a CRPV desarrollaron verrugas, mientras que en los animales que recibieron ADN de L1, 2 de sitios desarrollaron verrugas. Una de las dos verrugas que se observó en un conejo inmunizado con ADN de L1 retrocedió 3 semanas después de su aparición. La Tabla 1 muestra la distribución de verrugas en los conejos después de la exposición a CRPV. La inmunización profiláctica con ADN de L1 protegió a los conejos del desarrollo de verrugas al ser infectados con CRPV virulento. Ejemplo 6 Especificidad conformacional de los anticuerpos inducidos por el ADN de L1 Para demostrar que los anticuerpos neutralizadores protectores reconocen los epítopos conformaciones en las VLP, se realizaron experimentos de absorción. La absorción de suero inmunitario con VLP () de L1 eliminó toda la actividad de neutralización de anticuerpos y de ELISA (Figura 3A, B). La aplicación sobre piel escarificada de CRPV mezclado con suero de conejos preinmunitario dio como resultado condilomas en todos los sitios expuestos, mientras que cuando se mezcló el CRPV con suero inmunitario y se aplicó de forma similar, no se observaron condilomas debido a la actividad neutralizadora de los 12

13 anticuerpos. Cuando el CRPV se mezcló con suero inmunitario que había sido absorbido con VLP de L1, de los que se deberían haber eliminado los anticuerpos neutralizadores, todos (3/3) sitios dieron positivo para condilomas. Por el contrario, cuando se absorbió el suero inmunitario con proteína L1 no particulada desnaturalizada (desnaturalizada por reducción y alquilación en urea 8 M), el suero fue todavía capaz de neutralizar al CRPV (Figura 3A), y retuvo su actividad en el ELISA (Figura 3B). Así, los anticuerpos neutralizadores de virus inducidos por inmunización con ADN de L1 podían eliminarse únicamente mediante VLP de L1 con una conformación nativa y no mediante L1 desnaturalizado. El ensayo de ELISA parece detectar primordialmente anticuerpos específicos conformacionalmente que reaccionan con VLP de L1 intacto, ya que la reducción drástica de la actividad por ELISA mediante la absorción correspondió a la eliminación de los anticuerpos neutralizadores (Figura 3B). Ejemplo 7 2 Respuestas de anticuerpos inducidas con ADN de E4 y E7 Se inyectó a grupos de 4 conejos NZW por vía intramuscular 1 mg de ADN de V1J-E2 o V1J-E7 por inmunización. Se inyectaron cuatro inmunizaciones a las 0, 4, 8 y semanas y se extrajo sangre a las 22 semanas. Los anticuerpos se usaron como marcadores indirectos para determinar la expresión de las proteínas codificadas. Se ensayaron los anticuerpos en suero usando placas ELISA (NUNC Maxisorp) recubiertas con 1 µg por pocillo de proteínas de fusión GST-E2 o GST-E7 purificadas de E. coli que han sido transformadas con un vector de expresión pgex que codifica E2 o E7 de CRPV y se indujeron con IPTG.ElensayoELISAserealizó como se describe en el Ejemplo 3. Las velocidades de reacción netas (después de la dosis 4 menos la preinmunitaria) medida en mdo/min se muestran en la Fig. 4. Las velocidades netas > mdo/min se consideran positivas; los especímenes con valoraciones de anticuerpos elevadas pueden tener unas velocidades de reacción netas bajas con la dilución más baja debido a la sobresaturación del sistema de detección. Así, las proteínas codificadas E2 y E7 fueron expresadas y reconocidas por el sistema inmunitario del receptor

14 REIVINDICACIONES 1. Una vacuna que comprende un vector que comprende: (a) un polinucleótido que codifica un gen del virus del papiloma humano (HPV) seleccionado del HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16 y HPV18, expresando este polinucleótido al menos una de las proteínas L1oL1+L2; (b) un promotor de CMV para la transcripción mediante ARN polimerasa; (c) un factor de terminación transcripcional de un gen de la hormona de crecimiento bovino; y (d) un gen marcador de resistencia a la neomicina; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el vector es V1Jneo o V1Jns NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 14

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