Caracterización varietal preliminar de plantas de olivo (Olea europaea L) en cultivo en Uruguay utilizando marcadores morfológicos y moleculares 1

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1 Caracterización varietal preliminar de plantas de olivo (Olea europaea L) en cultivo en Uruguay utilizando marcadores morfológicos y moleculares 1 Pereira Jorge 1 Silveira, Alejandra 1 López Sylvia 1 y Gándara, José 2. 1) UDELAR, Facultad de Agronomía, Lab. Biotecnología, Depto. de Biología Vegetal. Av. Gral. Eugenio Garzón Nº 780. Montevideo. Uruguay. Correo electrónico: jeepb@fagro.edu.uy. 2) UDELAR, Facultad de Agronomía, Lab. Fisiología Vegetal, Departamento de Biología Vegetal. RESUMEN La olivicultura se ha desarrollado de manera pujante en Uruguay desde los últimos años del siglo pasado hasta la actualidad en que se han plantado 7 mil hectáreas distribuidas en 11 de los 19 departamentos del país, y entre los cultivos frutícolas ocupa 18% del área cultivada. La implantación de montes nuevos desde 1990 se ha realizado con plantas importadas certificadas en origen. El Consejo Oleícola Internacional (C.O.I) ha definido la metodología de identificación varietal mediante marcadores morfológicos y moleculares pero aun no ha sido aplicada en Uruguay. En la medida que se valide esta metodología no solamente se podría corroborar la identidad varietal del material importado recientemente sino también postular la identidad varietal de olivares antiguos en el país. Con el fin de aportar elementos que permitan comenzar a desarrollar esta metodología, se estudiaron 169 plantas de Olivos procedentes de 14 sitios del país, con el objetivo de conocer la composición varietal de restos de antiguos montes y plantaciones existentes en Uruguay a partir de caracteres morfológicos y moleculares. De acuerdo a lo recomendado por el C.O.I, cada planta fue evaluada por dos descriptores de hoja y seis de endocarpo y además genotipadas con diez pares de cebadores SSR. El análisis incluyó también plantas de 10 variedades comerciales que se plantan el país como referencia. Los descriptores morfológicos tuvieron diferente nivel de discriminación; las medidas del largo/ancho de hoja, permitieron identificar variedades en un 75% de las comparaciones entre variedades cuya identificación se conocía previamente. Los caracteres del endocarpo por ser altamente conservados, permitieron diferenciar variedades entre sí, e identificar la variabilidad intravarietal. Los diez marcadores microsatélites discriminaron inequívocamente las variedades analizadas. Este trabajo, nos permite disponer de elementos de diagnóstico varietal, de gran utilidad a nivel productivo, por su confiabilidad, que mejoran la calidad de los productos de la cadena oleícola al conocer con seguridad su composición varietal. Asimismo se han caracterizado los olivos de diversas zonas agrícolas, para conocer la variabilidad existente, para confirmación varietal y caracterizar el recurso genético olivícola disponible, con fines de conservación tanto in-situ como ex-situ. Palabras clave: olivo, identificación varietal, descriptores, microsatélites. Preliminary varietal characterization of olive trees (Olea europaea L) grown in Uruguay through morphological and molecular markers SUMMARY Olive crop has strongly developed in Uruguay since the end of last century until present times, with 7000 ha; 11 out of 19 provinces, covering 18% of fruit growing area. Since 1 Caracterización variedades olivos, morfología, microsatélites 1

2 1990, establishment of new olive groves has been carried out using imported plants certified in origin. The International Oil Council (COI) has defined the varietal identification protocol through morphological and molecular markers, but this methodology has not been applied in Uruguay yet. Providing this methodology is validated, not only will it be possible to confirm the varietal identity of recently imported plants but it also will allow for varietal identification of olive groves long established in our country. In order to provide elements that will help this methodology be developed, 169 olive plants coming from 14 different provenances throughout the country were studied, with the aim of gaining knowledge regarding the varietal composition of rests of old olive groves and current plantations in Uruguay based on morphological and molecular characters. According to COI recommendations, each plant was evaluated through two leaf descriptors and six endocarp descriptors, as well as being genotyped using ten pairs of SSR primers. This analysis also included as reference plants from 10 commercial varieties planted in Uruguay. The morphological descriptors displayed different levels of discrimination ability: leaf length/width measurements allowed variety identification in 75% of the comparisons among previously identified varieties. Endocarp descriptors, being the endocarp highly conserved, made it possible to differentiate varieties and to identifiy variability within varieties. The ten microsatellite markers used were able to unequivocally discriminate the varieties under analysis. The present work provides varietal diagnostic elements which are highly useful in production contexts, since its reliability improves product quality in the oil production chain because they allow trustworthy knowledge of varietal composition. Olive trees from diverse agricultural zones were characterized, in order to assess levels of present variability, to confirm their variety and to characterize the olive genetic resources available, aiming both at in-situ and ex-situ conservation Key words: olive, varietal identification, molecular markers, descriptors, SSR INTRODUCCIÓN El olivo Olea europaea L, es un cultivo originario de la Cuenca Mediterránea, usado en la producción de aceite y alimento humano (Angiolillo, et al., 1999). Su origen data en más de 6000 años y si bien se remonta a la ribera del Mar Mediterráneo, se encuentra actualmente en Estados Unidos, Argentina, Nueva Zelanda o Australia (Trujillo y Barranco, 2004). Su hábitat está determinado por áreas de clima mediterráneo, localizadas entre los paralelos 30º y 45º de ambos hemisferios. Se estima en más de 1275 los cultivares existentes en todo el mundo (Bartolini et al. 1998) con 3000 sinonimias. La superficie mundial aproximada de cultivo alcanza 10 millones de hectáreas, y millones de olivos plantados, 98% de los cuales se sitúan en los países de la cuenca Mediterránea (Barranco et al. 2008) siendo los principales productores, España (39%), Italia (25%), Grecia (14%) (Barranco et al. Op. Cit). Los inicios de la olivicultura en Uruguay datan del proceso fundacional de Montevideo. En 1726 el Gobernador Bruno Mauricio de Zabala encomendó a Pedro Millán el primer reparto de tierras en las costas del arroyo Miguelete (citado por Comisión de Vecinos del Barrio Atahualpa, 2007). El Presbítero Juan Manuel Pérez Castellanos documentó en Observaciones sobre la Agricultura (Pérez Castellanos, 1914), que las primeras plantas llegaron a nuestro país desde Buenos Aires alrededor del año 1780, provenientes de España y las últimas vinieron bajo forma de estacas en

3 A principios del siglo XX, al final de la Segunda Guerra Mundial, se realizaron nuevas plantaciones (Muñoz 1992) en las zonas de Sayago y Colón (Depto. de Montevideo) en los establecimientos de Domingo Basso procedentes de Italia y España, para la producción de aceitunas y elaboración de aceite (Basso, D. 1907). En el resto del país se plantaron variedades como Arbequina, Picual, Frantoio, Leccino y Barnea en los Departamentos de Canelones, Soriano, Paysandú, Salto, Durazno y Río Negro (Uboldi 1945). Entre 1934 y 1950 se plantaron 1000 hectáreas (Villamil 2009), y a finales de 1990 se retoma el cultivo (Tous et al., 2005) llegándose a las 7000 hectáreas plantadas en 11 departamentos de diversas zonas del país (Conde et al. 2010). Los olivares son importados de origen con identificación varietal y propagados en viveros. Los antiguos olivares de procedencia e identificación varietal desconocida, constituyen un excelente material de estudio por haberse adaptado a nuestras condiciones edafo-climáticas y encontrarse en producción a pesar de no haber sido mantenidos durante gran parte de su existencia (Villamil, 2009). En muchos casos las variedades mantuvieron su nombre original, pero existen dudas sobre las denominaciones de algunos genotipos. La identificación de plantas a través de caracteres morfológicos como hoja e inflorescencia, ha sido difícil para productores y viveristas por estar fuertemente influenciadas por el ambiente lo que dificulta el uso de algunos descriptores empleados en España para distinguir variedades (Barranco y Rallo, 1984). No obstante, estos autores citan seis caracteres del endocarpo altamente heredables, de un total de 14 que desarrollaron para C.O.I (2000) que se aplicarán en este trabajo, poco influenciados por el ambiente y ser muy útiles en la distinción de variedades. Por otro lado aplicando métodos bioquímicos y moleculares se han podido identificar distintos genotipos de olivo; Trujillo et al. (1995) utilizando isoenzimas discriminaron 132 variedades diferentes. Los marcadores moleculares basados en el ADN han posibilitado la identificación de genotipos que crecen en diferentes condiciones ecológicas, ya que no son influenciados por el ambiente. La técnica basada en la enzima Taq polimerasa, posibilita la detección de numerosas pequeñas repeticiones de secuencias de 1-32 pares de bases, técnica conocida como SSR-Microsatélites por la que se han discriminado distintos cultivares de olivo (Baldoni et al. 2009). Actualmente para mantener estándares de calidad internacional en la producción de aceite y fruto, es necesario identificar las variedades a partir de las cuales han sido elaboradas. En Uruguay existen olivos de más de 150 años originarios de países del mediterráneo que deben ser caracterizados primariamente y cuantificar la diversidad genética existente; las variedades plantadas recientemente pueden servir como referencia para desarrollar descriptores de los antiguos olivares (Pereira et al. 2007). La identificación varietal se realizará aplicando diez pares de cebadores microsatélites luego de haberlas caracterizado a partir de descriptores morfológicos; posteriormente se ajustará para Uruguay el rango de variación de los descriptores característicos de cada variedad en las condiciones locales del cultivo. 3

4 La utilización por primera vez de esta metodología en nuestro país supone dos desafíos: 1) el estudio y análisis del rango de expresión de los descriptores morfológicos dentro de cada variedad, los cuales deben estar validados por marcadores moleculares con su respectivo rango de variación según los estándares fijados a nivel mundial. Estos resultados nos proporcionarán el rango de expresión de los descriptores morfológicos y moleculares para Uruguay. 2) discriminar variedades con los resultados obtenidos con las diversas variables de ambas metodologías. Este trabajo apunta a realizar una caracterización genética a partir de marcadores microsatélites (Cipriani et al., 2002) y morfológicos (hoja y endocarpo) (Cavagnaro et al., 2001) de los antiguos montes, comparándolos con los resultados obtenidos aplicando la misma metodología a las variedades plantadas actualmente, lo que permitirá detectar variantes dentro de ellas. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal Se colectaron hojas y frutos de 169 plantas de olivo provenientes de 14 sitios situados en diversas zonas del país que se conocían por relevamientos previos (Silveira y López, 2011) (Cuadro 1). En tres de los 14 sitios se contaba, con la información de identificación varietal: Estación Experimental San Antonio (EEFAS), (Arbequina, Sevillana, Grosso Andrea, Moraiolo, Correggiolo, Santa Catalina y Razzo), Establecimiento Los Ranchos, (Taggiasca, Leccino, Arbequina, Pendolino y Manzanilla, y Varela Zarranz, que estaban anotadas en planos, como Frantoio. Los olivares centenarios de zonas urbanas y sub urbanas de Montevideo, y restos de antiguas plantaciones, carecían de dicha información. Para obtener perfiles moleculares SSR de referencia se utilizaron muestras de las variedades Arbequina, Frantoio, Picual, Barnea, Coratina y Arbosana, importadas de los países de origen por el Vivero Santa Rosa y cinco provenientes del Establecimiento Los Ranchos (Taggiasca, Leccino, Pendolino y Manzanilla). Caracterización morfológica de hoja. De cada árbol se tomaron 40 hojas adultas caracterizándolas en función de la relación Largo/Ancho, (COI, 2000). Las variantes de esta característica son forma: (a) Elíptica (L/A < 4), (b) Elíptico-lanceolada (L/A 4-6), (c) Lanceolada (L/A > 6 ). En este trabajo los resultados de la variable Largo/Ancho fueron analizados como variable continua y como variable discreta multiestado. Posteriormente se efectuaron comparaciones múltiples de medias utilizando el T-test para muestras dependientes, entre medidas, dentro y entre cada sitio de colecta aplicando el paquete estadístico G- Stat for Student 1.0 (G.S.K developer), con el objetivo agrupar los materiales que en muchos casos se desconoce su identificación varietal. Cuadro1. Nombre, localización de los sitios y número de plantas colectadas en cada uno. 4

5 Nombre de Sitio Nº de plantas Localización 1. EEFAS (Fac. Agronomía) 9 Ruta 31 km 21 (San Antonio, Salto) 2. Quebrada del Castillo 8 Ruta 37 km 4 (Pirlápolis, Maldonado) 3. Granja de Cohen 9 Ruta 39 y Ruta 9 (San Carlos, Maldonado) 4. Quinta de Canessa 8 Emancipación entre Av. Garzón y G. Pérez (Sayago-Mdeo) 5. Chacra de Tarallo 8 Ruta 33 km 19 (Sauce, Canelones) 6. Quinta Villa Margarita 8 Ruta 6 a 300 m de Ruta 11 (Sta. Rosa, Canelones) 7. Antigua Escuela Jackson 14 Ruta 8 km 17 (Manga, Montevideo) 8. Quinta de Posse 16 Gral. Hornos entre Guzmán y Obera (Sayago-Mdeo.) 9. Quinta Cnel Raíz 10 Cnel. Raíz entre Edison y Gral. Batlle y Ordóñez (Sayago-Mdeo) 10. Calle Oliveras 4 Calle Oliveras esq. A. Recalde (Sayago-Mdeo) 11. Granja Celia 15 Cno. de la Granja y Cno. Pérez (Pº de la Arena-Mdeo) 12. Establecimiento Varela Zarranz 12 Ruta 74 km 29 (Joaquín Suárez, Canelones) 13. Establecimiento Los Ranchos km al sur de Fray Bentos (R. de las Gallinas, Río Negro) 14. Establecimiento Tomasito Total Cno. de la Granja y Rey del Monte (Pº de la Arena-Mdeo) Descriptores de endocarpo. Se recolectaron 5 frutos por árbol, eliminándose manualmente la pulpa, previo tratamiento con una solución de hidróxido de sodio (10%) (42 horas). Luego se los mantuvo en hidróxido de sodio (5%) para eliminar el resto de pulpa (12 horas). Finalmente fueron blanquedos con ácido cítrico (5%) (24 horas), lavados con agua destilada y secados (Cavagnaro et al. op. Cit). Se evaluaron datos de 6 descriptores del endocarpo (Barranco y Rallo, 1984) discriminantes para la identificación de variedades (COI, 2000).: a) Forma en posición A: relación entre longitud (L) y ancho (A). Los estados de este carácter son: 1) esférica (L/A <1,4); 2) ovoidal (L/A entre 1,4 y 1,8); 3) elíptica (L/A entre 1,8 y 2,2); 4) alargada (L/A >2,2). b) Simetría en posición A: correspondencia entre sus dos mitades longitudinales: 1) simétrico; 2) ligeramente simétrico; 3) asimétrico. c) Posición del diámetro transversal máximo en posición B: 1) hacia la base; 2) centrada; 3) hacia el ápice. d) Forma del ápice en posición A: 1) apuntada ; 2) redondeada. e) Forma de la base: 1) truncada; 2) apuntada; 3) redondeada. f) ) Terminación del ápice: 1) con mucrón; 2) sin mucrón.. Extracción del ADN La extracción de ADN genómico se realizó utilizando hojas jóvenes siguiendo el protocolo de Cipiriani et al. (2002). La evaluación de calidad del ADN se realizó mediante electroferesis en geles de agarosa (1% de buffer TAE 1X) (Maniatis et al. 1982), teñidos con bromuro de etidio (concentración final de 50 m/ml) migrados durante 1h a 70V. Secuencias cebadores SSR y condiciones de amplificación y migración. La caracterización molecular del material genético se desarrolló siguiendo las especificaciones de Cipriani et al., Op. Cit, usando 10 pares de iniciadores microsatélites desarrollados en el Centro Nacional de Investigación (Scandici), Italia (Cuadro 6). 5

6 La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 20μl, conteniendo 11,92 μl de agua destilada autoclavada, 2 μl de buffer PCR (10 X), 0,8 μl de MgCl 2 (1,5 mm), 1,6 μl de dntps (2,5 μm de cada dntp), 1,2 μl de c/cebador (5 ng/ μl), 0,25 μl de Taq ADN polimerasa [INVITROGEN] (1,25 unidades), y 1 μl de ADN genómico (10 ng/μl). Las reacciones de amplificación se efectuaron en termociclador Biometra Personal Cycler siguiendo el siguiente perfil de temperaturas y tiempos: 95 C durante 5 minutos, 3 etapas diferentes durante 35 veces (94 C por 45 segundos, 57 C por 45 segundos y 72 C por 45 segundos) finalizando con 72 C por 8 minutos. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa (Fermentas, USA) al 3% en tampón TBE 1X (0,045M Tris-Borato, 0,001M EDTA ph 8.0). En las migraciones electroforéticas se incluyeron amplificaciones de materiales de referencia del Vivero Santa Rosa: variedades Arbequina, Arbosana, Barnea, Coratina, Picual y Frantoio y las del Establecimiento Los Ranchos Taggiasca, Leccino, Arbequina, Pendolino y Manzanilla de perfiles de amplificación conocidos (Rallo et al. 2000, Cipiriani et al. Op. Cit, Baldoni et al., 2009). El grado de resolución de las electroforesis se cuantificó con marcadores de peso molecular conocidos de pb (DNA Ladder, Low Range, Fermentas, USA) con intervalos de 50 y 100 pb). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Discriminación de las variedades a través de características de la hoja. La Forma de hoja se estimó a partir del Coeficiente Largo/ Ancho (L/A), partiéndose de las medidas individuales respectivas, determinándose: media, valores mínimo, máximo y varianza. Se emplearon como materiales de control los provenientes del Establecimiento Los Ranchos y Varela Zarranz (6 variedades de las que se colectaron hojas en 6 a 15 árboles, Figura 1). Las hojas colectadas en las siete variedades situadas en la EEFAS procedían de un solo ejemplar existente (Figura 2). El análisis de las 169 plantas, mostró que todas las clases de formas de hoja pudieron ser identificadas. El valor mínimo L/A por árbol fue 1.0, forma elíptica (Granja Cohen) y el máximo/árbol fue 12.5, forma lanceolada (Calle Oliveras). Las varianzas de por árbol estuvieron comprendidas entre 0.06 (Calle Emancipación) y 2.26 (Calle Oliveras). Los valores promedio por sitio variaron entre 2.54 (Ex Escuela Jackson) y 6.21 (Granja Celia) (Figura 4). Las 46 muestras provenientes del Establecimiento Los Ranchos correspondían a las variedades Taggiasca (15 árboles), Leccino (13), Arbequina (6), Pendolino (6) y Manzanilla (6). Los valores medios del parámetro Largo/Ancho hallados para cada variedad estuvieron comprendidos entre 3.77 (Pendolino) y 6.06 (Manzanilla) (Figura 1). Las variedades, Taggiasca, Leccino, y Arbequina se clasificaron como elípticalanceolada; Pendolino elíptica y Manzanilla lanceolada. Mediante el T-test de comparación de medias, Pendolino, Arbequina y Manzanilla, se puede distinguir de las otras variedades del establecimiento, mientras que Taggiasca y Leccino se diferencian de las tres restantes pero no entre sí. Estas variedades fueron comparadas con las medidas obtenidas en el Establecimiento Varela Zarranz (12 muestras) (Figura 1) que morfológica y molecularmente se caracterizaron como pertenecientes a la variedad Frantoio (valor medio del cociente L/A de hojas 4.28 y forma Elíptica-Lanceolada) (Silveira y López, 2011). El test de comparación de medias de Frantoio, resultó en diferencias significativas con los valores de Arbequina y Manzanilla, pero no con las de Taggiasca, Leccino y Pendolino (Cuadro 2). 6

7 Figura 1. Forma de hoja L/A de muestras colectadas en Establecimiento Varela Zarranz (Frantoio) y Los Ranchos (Taggiasca, Leccino, Arbequina, Pendolino y Manzanilla). Cuadro 2. Comparación de medias entre muestras de hojas de Establecimiento Varela Zarranz y Los Ranchos. FRANTOIO TAGGIASCA LECCINO ARBEQUINA PENDOLINO MANZANILLA FRANTOIO TAGGIASCA LECCINO ARBEQUINA * * * PENDOLINO * * * MANZANILLA * * * * * T-test para Muestras dependientes Diferencias Significativas con valores p>0.05 (*) Al analizar olivos que estaban anotados por variedad, como los de la EEFAS, las medidas Largo/Ancho estuvieron comprendidos entre hojas cuyo valor promedio varió entre un mínimo de 3.34 (Variedad Grosso Andrea) y un máximo de 6.13 (Variedad Razzo) (Figura 2). De acuerdo a los intervalos del valor fijados por el COI (2000), la variedad Grosso Andrea se clasificó como elíptica, Razzo de forma lanceolada, y las restantes variedades como elíptica-lanceolada. Al realizar comparaciones apareadas por variedad para las medias del parámetro Forma de hoja mediante un T-test, con un intervalo de confianza de 95% se observó que Grosso Andrea y Corregiollo, hoja elíptica, son estadísticamente diferentes de Razzo, forma de hoja lanceolada. Las restantes muestras se agruparon juntas por tener valores de largo/ancho de hoja elípticalanceolada (Arbequina, Sevillana, Moraiolo, Santa Catalina). Las muestras S1M2 y S1M3 cuya identidad varietal se desconocía, se diferenciaron estadísticamente por sus medias de Moraiolo y Santa Catalina y entre sí. (Cuadro 3). Un ejemplar de Arbequina encontrado en el Jardín de Introducción de EEFAS mostró un promedio Largo/Ancho de hoja de 5.03 (elíptico-lanceolada) que se comparó con la media de seis árboles del Establecimiento Los Ranchos, cuyo valor de 5.68 resultando estadísticamente diferente con un valor de p>0.05, lo que puede deberse a que son diferentes genotipos de la misma variedad. 7

8 Figura 2. Dispersión de valores del descriptor L/A de hoja por árbol en nueve olivos localizadas en la EEFAS Cuadro 3. Comparación de medias entre muestras de hojas de EEFAS. \ ARBEQUINA S1M2 S1M3 SEVILLANA G.ANDREA MORAIOLLO CORREGIOLLO S.CATALINA RAZZO ARBEQUINA S1M * S1M * SEVILLANA * 0.002* G.ANDREA 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* MORAIOLLO * * 0.000* CORREGIOLLO 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* * 0.000* S.CATALINA * * 0.000* * RAZZO 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* T-test para Muestras dependientes Diferencias Significativas con valores p>0.05 (*) Las muestras provenientes de predios cuya identificación varietal se desconocía mostraron variaciones de distinto tipo. Las hojas provenientes de árboles ubicados en la Calle Gral. Hornos mostraron un valor Largo/Ancho comprendido entre 1.69 y 5 y una media para el sitio de 3.3 (Forma Elíptica) (Figura 3). Dentro de cada olivo los valores se presentaron homogéneos, excepto algunas diferencias en las comparaciones de medias que resultaron estadísticamente significativas. Las diferencias entre medias por árbol varían entre 14/15 para la muestra 4 y 6/15 para la muestra 12. En cuanto a la forma variaron desde elíptica a elíptica-lanceolada. La varianza en este sitio se componía de 25.64% entre árboles y 74.36% dentro de los mismos. A partir de este modo de partición de la varianza se podría afirmar que los árboles de este sitio son de la misma variedad y las variaciones observadas corresponden a diferencias entre árboles. Figura 3. Forma de hoja Largo/Ancho de muestras colectadas en la calle Gral. Hornos. Éste parámetro de caracterización de hoja, que establece categorías discretas a partir de los rangos cociente Largo/Ancho, ha resultado interesante; tiene un limite en el valor cuatro, que separa dos categorías: elíptica(<4),, elíptica lanceolada (4-6) (C.O.I, 2000). En función de esta escala, las hojas colectadas en los 12 árboles del Establecimiento Varela Zarranz, caracterizados previamente como de la variedad Frantoio, resultaron con una media de 4.19 clasificándose como Elíptica-Lanceolada. 8

9 Las muestras provenientes de las antiguas chacras de Montevideo, Ex-Quinta de Canessa, Cnel. Raíz, Calle Oliveras mostraron medias de 3.98, 3.31 y 4.71 respectivamente, por lo que fueron clasificadas como de forma elíptica las dos primeras y elíptica-lanceolada la tercera. Las hojas de árboles procedentes de la Ex Quinta de Canessa, mostraron una media de 3.98, valor que corresponde al intervalo de clasificación de hojas elípticas, pero todos los árboles de este sitio estuvieron comprendidos entre 3.65 y 4.56 (Fig. 4), (equivalentes a elíptica y elíptica lanceolada), lo que muestra lo variable de este tipo de clasificación de forma de hoja al estar determinado por un valor arbitrario. En los sitios suburbanos de Montevideo (Ex Escuela Jackson, Calle Oliveras y Granja Celia) y viejos montes de Maldonado y Canelones, las medias de Largo/Ancho de hoja por lugar de obtención de muestras, varió entre 3.0 (Ex Escuela Jackson, forma Elíptica) y 5.03 (Granja Celia, forma Elíptica Lanceolada) (Figura 4). En este grupo de muestras los análisis de varianza mostraron que la varianza está distribuida 70.14% entre sitios de colecta y el 29.86% dentro de sitios de colecta siendo significativamente diferentes las medias entre ellas (Cuadro 4) Figura 4. Forma de hoja Largo/ Ancho por sitio de colecta La tabla de comparación de medias entre sitios de colecta mediante el T-test fue variable con un promedio de medias para todos los puntos de muestreo de 3.98 (Forma Elíptica) variando entre los sitios con mas en 2 semejanzas en medias sobre diez para las hojas provenientes de la calle Ex Quinta de Canessa y 9 para las colectadas en la Ex Escuela Jackson (Cuadro 4). Cuadro 4. Comparación de medias de forma de hoja por sitio de colecta. Q.Castillo G.Cohen Ex-Q.Canessa Q.Tarallo Q.V Margarita Ex-E.Jackson Ex.Q.Posse Cnel.Raíz C.Oliveras G.Celia Q. Castillo Granja Cohen 0.023* Ex-Qta.Canessa * Qta. Tarallo * Qta.V.Margarita Ex-Esc.Jackson 0.000* 0.000* 0.000* 0.001* 0.030* Ex.Qta.Posse 0.015* 0.000* * * Calle Cnel. Raíz 0.015* 0.000* * 0.029* Calle Oliveras * 0.007* 0.019* 0.000* Granja Celia * * 0.000* 0.000* T-test para Muestras dependientes Diferencias Significativas con valores p>0.05 (*) Las varianzas estuvieron comprendidas entre 0.06 para las muestras de Quebrada del Castillo (Maldonado) y 0.30 en Granja Celia, valores que señalan la variabilidad 9

10 detectada entre los sitios de colecta y la heterogeneidad en la composición varietal de los mismos. El análisis de partición de la varianza de todos los sitios estudiados, indicó que el 77% de la varianza se distribuye entre muestras y el 23% dentro de las muestras de las distintas localidades. El modo en que se descompuso la varianza en los sitios relevados, es útil en el momento de orientarnos en la composición varietal de los mismos. Cuando las muestras provenían de sitios en los que supuestamente eran todos de una misma variedad, la mayor parte de la variabilidad estaba dentro de cada muestra (cada árbol). En la Estación Experimental San Antonio de la Facultad de Agronomía en Salto, se analizaron hojas provenientes de diferentes variedades, representada por un solo árbol, por lo que obtuvimos una sola media de Largo/Ancho, y la varianza se distribuyó casi igualmente dentro y entre las muestras (42,3% y 57,7 respectivamente). Cuando las muestras provenían variedades representadas por más de un ejemplar (Establecimiento Los Ranchos ) las varianzas se distribuían mayormente entre muestras (84.3, árboles), ya que estábamos analizando hojas provenientes de variedades diferentes con una base genética diferente. Cuando estudiamos las varianzas de las muestras de todos los sitios relevados, que probablemente por antecedentes históricos eran de una sola variedad, las varianzas se distribuyeron un 30% dentro de los grupos (cada árbol) y 70% entre los mismos (sitio de colecta). La lógica de estos resultados basada en la colecta realizada y la metodología aplicada para el estudio de forma de hoja, permitió observar una gran proporción de variabilidad en este marcador morfológico, que dada la naturaleza del material, mayormente de propagación vegetativa, tiene una estrecha base genética Discriminación de las variedades a través de caracteres del endocarpo En la parte superior del Cuadro 5 se muestran las frecuencias de cada estado de los seis caracteres estudiados en las muestras sin tipificación varietal, la mediana (en porcentaje) de ese estado entre todos los sitios muestreados. En la parte inferior se encuentra la misma información para muestras identificadas varietalmente, y los valores correspondientes a Frantoio (C.O.I, 2000) En los ocho sitios donde no se conocía la variedad de los olivos existentes se obtuvieron muestras de fruto al igual que en los establecimientos con olivos de identificación conocida. Los caracteres de endocarpo analizados presentaron diferente grado de dispersión con respecto al valor modal y todos fueron variables. En el Cuadro 5 se incluyó como base de comparación la información referida a la variedad Frantoio (C.O.I., 2000) apreciándose que de los estados de seis caracteres de endocarpo, resultan distintas combinaciones según las variedades, y localidades muestreadas. 10

11 Forma Simetría Ø. transv. Forma ápice Cuadro 5. Caracterización de las muestras de olivos aplicando seis caracteres de endocarpo. endocarpo (A) (A) máx.(b) (A) Estados caracteres endocarpo Eliptica Ovoidal Esférica Alargada Simétrico Lig asimétrico Asimétrico Centrado Hacia ápice Forma base (B) Hacia base Redondeado Apuntado Truncada Redondeada Apuntada Q. del Castillo 2,036+/-0,141 1,536+/ G. de Cohen 0, Ex- Q. de Canessa 2,051+/-0, Q. de Tarallo 2,061+/-0, Ex -Q. de Posse 1,998+/-0, C. Cnel. Raíz 1,850+/-0, C. Oliveras 2,050+/-0, Granja Celia 2,45+/-0, Prom. valores en la moda 46,88 45,63 7,5 63,25 34, ,31 29,69 47,69 49,81 2,50 27,94 72,06 Taggiasca Los Ranchos ,00+/-0,314 Leccino Los Ranchos 3,236+/-0, Pendolino Los Ranchos 3,311+/-0, Arbequina Los Ranchos 2,245+/-0, Manzanilla Los Ranchos 2,146+/-0, Sevillana EEFAS Razzo EEFAS En las filas se observan los porcentajes de estados de cada carácter de endocarpo, por sitio de muestreo y por variedades. La fila de promedio de valores en la moda muestra el promedio (%) de cada estado entre todos los sitios muestreados y por variedades. A nivel de sitios de colecta el 75% de los endocarpos mostraron forma elíptica, mientras que solo dos variedades, Arbequina y Manzanilla mostraron este estado al igual que Frantoio. Las variedades Taggiasca, Leccino y Pendolino presentaron el estado alargado del endocarpo, mientras que Sevillana fue ovoidal y Razzo esférico. Dentro de las localidades la Forma del Apice en posición A (Redondeada), Terminación del Apice (con Mucrón) y Diámetro Máximo Transversal (Centrado) mostraron caracteres con estados en frecuencias elevadas (70.3 y 72,06 y 63,25% respectivamente), lo que los ubica a nivel de sitios de muestreo como los mas homogéneos y de mayor poder discriminante, coincidiendo con los estados de Frantoio. Otros caracteres como Simetría y Forma a la Base presentaron dos estados en iguales proporciones cada uno (entre el 45 y 49% cada uno), lo que los hace menos discriminantes ya que el estado que apareció mayoritariamente se encontró en tres y cuatro localidades de ocho con porcentajes que variaron entre 62,5 y 100%. Además el estado más frecuente en las muestras analizadas de estos dos caracteres no coincidió con el que diferenciaba la variedad Frantoio, como ocurrió con los otros cuatro. Entre variedades, los caracteres Forma del Apice en posición A (Redondeada), y Diámetro Máximo Transversal (Centrado) resultaron mayoritarios (71,4 y 62,3% respectivamente), siendo la forma predominante en cinco y cuatro de las siete variedades estudiadas, y los mas discriminantes al igual que a nivel de localidades. Terminación del Apice (con mucrón) y Simetría (ligeramente asimétrico) aparecieron promedialmente en un 57 % cada uno de ellos, estando presente en cuatro de siete variedades, pero ambos caracteres discriminaron distintas variedades. Finalmente el carácter Forma a la base (B) presentó los tres estados posibles, en proporciones comprendidas entre 25 y 38% siendo predominantes en dos variedades cada uno de ellos (Cuadro 5). Al considerar conjuntamente todos los caracteres, aparecieron combinaciones de estados que diferenciaban las siete variedades, existiendo en todas las variedades por lo menos un carácter con estados diferentes, y Razzo se diferenció en tres de los seis caracteres (Cuadro 5). Terminación del ápice Prom. de valores en la moda 28,57 57,14 14,29 62,34 23,38 14,29 71,23 28,57 35,71 38,31 25,97 42,86 57,14 Frantoio 2,02+/-0, Sin mucrón Con mucrón 11

12 Las muestras de las ocho localidades no presentaron semejanza total con ninguna de las variedades muestreadas, pero tuvieron en cuatro de seis caracteres, estados que eran propios de la variedad Frantoio. Las variedades tuvieron entre cinco y seis caracteres con frecuencias mayoritarias de estados comprendidas entre 80 y 100% lo que indica una concordancia con la tipificación varietal que tenían dichos olivos. Del análisis de seis de los caracteres más discriminantes del endocarpo (Belaj et al. 2011), fue posible establecer once categorías para las muestras que carecían de información sobre su origen varietal (Figura 5). El carácter Forma de Base separó primariamente los endocarpos en tres categorías diferentes. Los caracteres menos discriminantes como "posición del diámetro máximo" permitieron la creación de ocho de las once categorías resultantes.. Este método para identificar variedades presenta el inconveniente que el análisis de algunos caracteres cualitativos se basa en apreciaciones subjetivas. Por ejemplo, los estados "ligeramente asimétrico" o "simétrico", pueden variar según el observador que realice el estudio. La falta de estandarización en el método para evaluar estos caracteres dificulta el aprovechamiento de información sobre clasificaciones varietales provenientes de otras regiones. Este aspecto es de particular importancia para los productores locales ya que muchas de las variedades fueron introducidas desde países del Mediterráneo y su verificación podría ayudar al ordenamiento local de ellas. 12

13 Figura 5. Características del endocarpo según los parámetros del COI (2000) Discriminación de las variedades utilizando marcadores microsatélites (SSR) Los 10 pares de cebadores ensayados amplificaron fragmentos de ADN con tamaños comprendidos entre 95 y 219 pares de bases (Cuadro 7), con un promedio de 4,7 bandas por iniciador (Cuadro 6). Cuadro 6..Secuencias de pares de cebadores 13

14 Locus Secuencias de pares de cebadores 5 -->3 Fragmentos amplificados Total (T) Polimórficos (P) *P.D UD099-6 F-TCAGTTTGTTGCCTTTAGTGGA R-TTGTAATATGCCATGTAACTCGAT UD099-7 F-TGTGTTCTTTATTTGAAGGAATCTT R-TCGCTTTTGTGTTACATATTCG UD099-8 F-AAAAACACAACCCGTGCAAT R-AAATTCCTCCAAGCCGATCT UD099-9 F-TTGATTTCACATTGCTGACCA R-CATAGGGAAGAGCTGCAAGG UD F-TGACTCCCTTTAAACTCATCAGG R-TGCGCATGTAGATGTGAATATG UD F-TTCCCCTTATTCAATGTGAACC R-ACTGCAGTTTGGGAATCAAA UD F-CTGCAGCTTCTGCCCATAC R-GCAGATCATCATTTGGCACT UD F-TATCCTCTATGTGGCGATG R-TTGGTTAAAAGGATTGATACA UD F-AATTTAATGGTCACACACAC R-ATTGCGAAATAGATCTACGA UD F-TCGGCTTTACAACCCATTTC R-TGCCAATTATGGGGCTAACT Promedio (T) número de productos de amplificación, (P) número de productos polimóricos, (P.D) poder discriminantes para 10 loci SSR empleados en la caracterización de 169 plantas de olivo. El perfil de los productos de amplificación SSR obtenido con los iniciadores UD y UD para seis de las variedades analizadas y los tamaños de fragmentos obtenidos se observa en la Figura 6. Los niveles de polimorfismo, y tamaño de los fragmentos obtenidos para cada variedad, fueron coincidentes con las referencias bibliográficas (resultados no mostrados) (Rallo, et al. 2000; Cipriani et al. 2002). También lo fue el contenido de información de los loci microsatélites estimado usando el perfil de un individuo por variedad, tanto para Diversidad genética (h) (Nei, 1973), al igual que poder de discriminación (PD) (Kloosterman et al. 1993). Este valor de P.D varió entre 0.62 y 0.85 con una media de (Cuadro 6) Figura 6. Patrones de bandas generados por el par de cebadores UD (1-8) y UD con seis variedades de referencia. (9-16). (M) Marcador de Peso Molecular 1Kb; (1 y 9) Coratina; (2 y 10) Arbequina; (3 y 11) Arbequina * (4 y 12); Barnea (5 y 13); Picual, (6 y 14); Arbosana, (7 y 15) Frantoio; (8 y 16) controles negativos. (*) Material proporcionado por el Centro de Nacional de Scandicci, Firenze, Italia. El polimorfismo hallado entre variedades coincide con resultados de estudios previos obtenidos sobre otras variedades utilizando marcadores SSR (Cipriani et al. 2002), 14

15 RAPDs (Fabbri et al., 1995) e isoenzimas (1980; Trujillo et al., 19905) confirmando que el olivo es una especie con elevada variabilidad genética (Zohary y Spiegel-Roy, 1975). Esta variabilidad permite obtener un elevado numero de fragmentos polimórficos con pocos iniciadores y una discriminación rigurosa en la caracterización de cultivares con pocos iniciadores Figura 7. Patrones de bandas generados por el par de cebadores UD obtenidos con los olivares de Montevideo y variedades de referencia (M) Marcador de Peso Molecular 1Kb; (1) Arbequina, (2-12) Granja Celia; (13) Ex Quinta de Canessa; (14) Frantoio (15); Control Negativo. Figura 8. Patrones de bandas generados por el par de cebadores UD obtenidos con los olivares de Montevideo. (M) Marcador de Peso Molecular 1Kb; (1) Frantoio, (2-12) Granja Celia; (13-14), Ex Granja de Canessa; (15) Control Negativo. Cuadro 7. Patrón de productos de amplificación esperados (en pb) de 10 variedades de olivo utilizando 10 loci SSR. Extraído de Rallo et al. 2000, Ciriani et al y Baldoni et al Variedades Marcadores Coratina Arbequina Barnea Picual Arbosana Frantoio Taggiasca Leccino Pendolino Manzanilla UD / / / / / / / / /164 UD / / / / / / /141 UD / / / UD / / / / / / UD / / / / / / /122 UD / /105 95/105 95/105 95/105 UD / / / / UD / / / / UD / / / /168/ UD / / / / / / /219 A modo de ensayo se utilizaron las seis variedades mas empleadas en Uruguay (86% del área plantada) (Conde et al. 2010) para comparar los patrones de bandas obtenidos y su capacidad de discriminación. En la Figura 9 se observa el agrupamiento obtenido mediante el método UPGMA a partir de la matriz de distancias de Jaccard, calculadas con las combinaciones multiloci de los diez pares de cebadores SSR. De dicho dendrograma se desprende la sensibilidad de los marcadores SSR como herramienta 15

16 para el ordenamiento de las variedades locales, tanto en jardines de colecciones varietales, viveros comerciales y certificación varietal del material que se comercialice. Figura 9. Agrupamiento UPGMA obtenido a partir de matriz de Distancias de Jaccard, calculadas en base a los patrones de bandas de diez pares de cebadores SSR. Los olivos procedentes de las antiguas plantaciones, también fueron analizados y comparados con muestras de ADN de las variedades, descritas anteriormente como material de referencia. Aplicando el criterio de poseer por lo menos una banda común por par de cebadores, la mayoría de dichas muestras (81%) fueron caracterizadas molecularmente como pertenecientes a la variedad Frantoio (entre 13 y 15 de las 17 bandas propias de la variedad). El resto se tipificaron como Arbequina (14%, con 12 a 14 de 17 bandas características) y otras variedades en menor proporción como Manzanilla y Picual. El nivel de polimorfismo detectado en dichas muestras fue variable, encontrándose diferentes patrones moleculares en los sitios estudiados. Comparando con las variedades tomadas como referencia, los olivares existentes en las calles de Montevideo, con el criterio mencionado anteriormente el 97% correspondió a la variedad Frantoio, distinguiéndose diferentes combinaciones de bandas entre cada sitio, y altamente monomórficos dentro de cada uno de ellos. Estas dos características genéticas, y el modo de propagación vegetativa por estacas de esta especie, sugiere la ocurrencia de múltiples eventos de introducción. En los olivares de la calle Cnel. Raíz se detectaron distintas combinaciones de bandas, principalmente con los pares de cebadores UD y UDO99-31, aunque los niveles promedio de polimorfismo no superaron el 14,4% de las muestras analizadas (14). En contraposición en la Granja Celia del Paso de la Arena, cuyos orígenes se remontan a fines del siglo XIX (Silveira y López, 2011), las 15 muestras analizadas correspondieron a la variedad Frantoio, con un elevado nivel promedio de polimorfismo (61%), variando por par de cebadores entre 65% y 73% (UDO-011, UD0-028, UDO-031, UDO-O43) (Figuras 7 y 8). La naturaleza del predio, tipo de suelo y ausencia total de manejo de los olivos, contrastó con el buen estado sanitario y frondosidad de los mismos, a lo que se agregó el alto nivel de variabilidad detectado a nivel de caracteres morfológicos (Cuadro 5). Los resultados obtenidos a partir de marcadores microsatélites, tanto en los olivares de las viejas chacras coloniales de orillas del Arroyo Miguelete, como las de la zona Rural (Ej. Granja Celia) nos permitieron identificar la existencia de un reservorio genético de Olea europaea L, adaptado a las condiciones edáficas y climáticas del sur del país, que han superado el paso de los siglos. Las técnicas moleculares desarrolladas recientemente permiten obtener marcadores más consistentes y que detectan un mayor grado de polimorfismo que los marcadores RAPD. Los AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) (Vos et al., 1995) aumentan entre cinco y diez veces el número de fragmentos amplificados, además es más confiable que los RAPD pero sus resultados son menos transferibles que los SSR, cuando se desea comparar resultados entre diferentes laboratorios. Los microsatélites 16

17 han sido utilizados con éxito para diferenciar variedades en cultivos (Thomas y Scott, 1993), sin embrago el desarrollo de estos marcadores es muy costoso y en olivo comenzaron a aplicarse a partir de Cipiriani et al. (2002). Los marcadores moleculares tienen la particularidad de no ser influenciados por el ambiente lo que permite ser utilizados en la identificación de plantas jóvenes de vivero, donde es sumamente difícil identificar la variedad a través del análisis de caracteres morfológicos. BIBLIOGRAFÍA Angiolillo A., Mencuccini M., and Baldoni L Olive genetic diversity assessed using amplified fragment length polymorphisms. Theoretical and Applied Genetics 98: Baldoni L., Cultrera N.G.,Mariotti M., Ricciolini C., Arcioni S.,Vendramin G.G., Buonamici A., Porceddu A., Sarri V., Ojeda M.A. Trujillo I., Rallo L,. Belaj A., Perri E., Salimonti A., Muzzalupo I., Casagrande A., Lain O., Messina R.,Testolin R A consensus list of microsatellite markers for olive genotyping. Mol. Breeding. 24: Barranco D., y Rallo L Las variedades de olivo cultivadas en Andalucía. Departamento de Pomología ETSIA, Universidad de Córdoba. Junta de Andalucía, España, pp Barrranco D., Fernández Escobar R., y Rallo L El cultivo del olivo. Madrid: Ediciones Mundi- Prensa, 6ª ed. pp Bartolini G., Prevost G., Messeri C., and Cariganni G Olive germplasm: cultivars and world-wide collections. FAO Library, Rome, Italy. Basso D Del olivo y su producto. Instrucciones generales, respecto a su cultivo y producción. Establecimientos Domingo Basso. Nº 55. p16. Belaj A., León L., Satovic Z y De la Rosa R Variability of wild olivers (Olea europaea Subs. europaea var. sylvestris) analyzed by agro-morphological traits and SSR. Markers. Scientia Horticulturae 129: Cavagnaro P., Juárez J., Bauza M., y Masuelli R.W Discriminación de variedades de olivo a través del uso de caracteres morfológicos y de marcadores moleculares. Agriscientia, Vol. XVIII: pp Cipriani G., Marrazzo M.T., Cimato A., y Testolin R Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theoretical and Applied Genetics. 104: pp Conde P., Villamil J.J., y Villamil, J Evaluación de variedades de olivo en Uruguay. INIA. Jornada de Divulgación: Resultados Experimentales en olivos. pp

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