DE GENÓMICA A PROTEÓMICA

Transcripción

1 CHIPS DE PROTEINAS

2 DE GENÓMICA A PROTEÓMICA PROTEOMA es el conjunto de proteínas codificado por el genoma. El estudio del proteoma es la PROTEÓMICA Proteínas de cualquier célula Isoformas Proteínas modificadas Interacciones entre proteínas Descripción estructural de las proteínas Descripción estructural de los complejos proteicos Por extensión: cualquier cosa post-genómica

3 High-throughput Biochemistry Proteómica (en la actualidad): Bioquímica de proteínas a gran escala con gran precisión y rendimiento. Objetivo: Descripción completa de la función celular Plataformas para la proteómica y genómica funcional

4 Escalabilidad de la proteómica Genómica: GRAN escalabilidad PCR, secuenciadores automáticos,etc. Proteómica: POCA escalabilidad. Motivos: Material limitado y variable Degradación de la muestra Rango dinámico de abundancia muy grande (10 6 ) Modificaciones post-traduccionales abundantes Especificidad temporal y de desarrollo Perturbaciones patológicas Perturbaciones farmacológicas

5 Análisis de proteínas a escala proteómica Si queremos definir la: - Identidad - Cantidad - Estructura - Función De todas o un grupo de proteínas (dentro de un contexto celular) Debemos de poder: Generar un conjunto de CLONES que expresen las proteínas individuales de todo o parte un PROTEOMA Seguido de: ANÁLISIS Proteínas en un formato ÚTIL

6 TÉCNICAS NECESARIAS Genéticas Bioquímicas Biología celular Construcción de chips Identificación de interacciones Localización de proteínas en compartimentos celulares 1. Expresión y purificación de proteínas 2. Pruebas de actividad a escala proteómica a) Aproximación genómica bioquímica b) Microarrays - Analíticos - Funcionales

7 1. Expresión y purificación de proteínas Localización de los ORFs (pautas abiertas de lectura) Problemas: - A veces difícil localización - Señales de splicing - Poliadenilación Problemas: Clonación de los ORFs - Se trata de una simplificación - Se elige un mrna y se descartan las isoformas - Las modificaciones posttraduccionales (fosforilación, glicosilación, metilación, acetilación) pueden no ser consideradas - No vale para proteínas de membrana

8 Clonación de los ORFs Requiere: - Cebadores ( primers ) para la PCR - Inserción en vectores Métodos de síntesis de HT: - Síntesis automática - Precio razonable - Rapidez y precisión Inserción en vectores A) Recombinación mediada por la reparación del hueco B) Clonaje independiente de ligación (T4 polimerasa + dctp o dgtp) C) Sistema Gateway de Invitrogen (integración/excisión del fago )

9 Inserción en vectores

10 Expresión Sistemas homólogos Es el mejor (modificaciones post traduccionales, interacciones con sus parejas proteicas, etc) Sistemas heterólogos Son necesarios para muchos organismos. Una alternativa son las células de insecto (modificaciones similares a mamíferos) Incorporación de marcadores Fusión de péptidos o proteínas a las proteínas de interés Alta AFINIDAD y SELECTIVIDAD Conservación de la ACTIVIDAD - Glutatión-S-transferasa / agarosa de glutatión - Marcador de Hisx6 / agarosa de Ni - Péptido de unión a calmodulina / agarosa de calmodulina - Proteína A / -inmunoglobulina - Combinación de anteriores con sitios de corte (trombina, TEV, etc) - Proteína de unión a maltosa - Epítopos: hemaglutinina, Myc y FLAG - Derivados de GFP. Detección mediante FRET

11 Detección GFP mediante FRET PROBLEMAS GENERALES: - Cada proteína de fusión requiere un esquema y un protocolo diferente - Hay proteínas que no se dejan purificar - Hay proteínas que se inactivan al fusionarse

12 2. Actividad proteica a escala proteómica a) Aproximación Bioquímica genómica b) Microarrays (Chips) a) Aproximación bioquímica genómica Uso de análisis bioquímico en paralelo de grupos de proteínas provenientes de un proteoma. El objetivo es identificar a una proteína como responsable de una función. Clonación GST-ORF Expresión y purificación en grupos de 96 Ensayo bioquímico Grupos Positivos Subgrupos Ensayo en los subgrupos Positivos (deconvolución) Ventajas: - Rapidez de asignación de función a ORFs. - Válido para cualquier tipo de ensayo de actividad - Alta sensibilidad - Permite la detección de complejos proteicos

13 b) Microarrays Objetivo: análisis de alto rendimiento, a gran escala de la función génica, de forma rápida y barata. Metodología: las proteínas purificadas individuales se depositan en una superficie, generalmente una lámina de vidrio para analizar su actividad

14 Comparación con los chips de DNA Chips de DNA: - No dan información directa de la función génica - Sencillos de hacer Chips de proteína: - información directa de función - Complejos de hacer, ya que la función proteica es dependiente de estado, como las modificaciones posttraduccionales, interacción con otras proteínas, localización subcelular, modificaciones covalentes reversibles, etc. Manufactura de chips Deben retener la función de la proteína Ser compatibles con las tecnologías de fabricación Deben permanecer en un ambiente húmedo

15 Sustratos blandos - Se hace una capa fina de poliacrilamida o agarosa sobre el vidrio - Se depositan las proteínas con fotolitografía - Se entrecruzan para inmovilizarlas Se usan superficies de poliestireno, nitrocelulosa o PVDF. No permiten alta densidad de empaquetamiento Los puntos de aplicación difunden en la superficie Relación señal ruido muy bajos Orientación al azar Estructuras de superficie 3D Ventajas Alta capacidad de inmovilización Ambiente acuoso Proteínas activas Desventajas Difícil cambiar tampones Difícil recuperar las moléculas Orientación al azar

16 Nanopocillos Vidrio recubierto de PDMS Se hacen nanopocillos en los cuales se depositan las proteínas Las proteínas se inmovilizan por entrecruzamiento Ventajas - Alta capacidad de inmovilización - Reducen la evaporación - Minimizan las contaminación cruzada - Minimizan ruido de fondo -Son abiertos, con lo que se pueden tratar secuencialmente con tampones, lavados, etc. - Recuperación de las muestras fácil Desventajas Requiere equipo especializado, sofisticado y caro Orientación al azar

17 Vidrio Unión de la proteína directamente en la superficie del vidrio o bien después de aplicar recubrimientos de diferentes tipos: - Poli-L-Lisina (adsorción) - Activación con aldehido (covalente) - Activación con epoxy (covalente) - Recubrimiento de oro (covalente) O bien - Biotina (afinidad) - Hisx6 (afinidad) Ventajas -Enlace covalente disminuye probabilidad de alteración de la conformación nativa - Afinidad: orientación correcta Desventajas Grupos NH2 de cadenas laterales pueden modificar actividad. Afinidad: hay que biotinilar o marcar con Hisx6 todas las proteínas

18 Tipos de chips Superficie Ventajas Desventajas Sustratos blandos 2D Poliestireno Membranas de nitrocelulosa PVDF (fluoruro de polivinilideno) No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína Unión no especifica de la proteína. Orientación al azar. Ruido de fondo. Chips de baja densidad (Adsorción y absorción) Estructuras superficiales 3D Poliacrilamida y agarosa (difusión) No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína No disponibles comercialmente Nanopocillos Vidrio recubierto de PDMS (polidimetilsilosano) (entrecruzamiento) Unión fuerte y alta densidad de empaquetamiento Oreintación al azar de las proteínas Vidrio Vidrio solo Idem a 2D Idem a 2D Cubierta de poli-l-lys Idem a 2D Idem a 2D Activación con aldehido Chips de alta densidad Orientación al azar Activación con epoxy Alta densidad y resolución Orientación al azar Cubierta de oro Acoplado a SPR y MS Orientación al azar Unión por afinidad: Avidina o resina de Ni2+ Unión fuerte, especifca y de alta densidad Proteinas deben ser biotiniladas o Hisx6 (adsorción, absorción, entrecruzamiento o unión por afinidad)

19 Sistemas de depósito de proteínas Baja densidad: Sistemas de DOT-BLOT de 96 pocillos Alta densidad: Robots capaces de depositar >30000 proteínas - Contacto directo con la superficie - Tecnología de chorro de tinta (ink-jet). No toca superficie - Electrospray. Disminuye mancha de 150 a 30 µm. Sistemas de detección de proteínas Fluorescencia (preferido porque) - Sencillo - Seguro - Muy sensible - Puede tener muy alta resolución La detección por fluorescencia: - 1 paso: molécula fluorescente - 2 pasos: usando un marcador de afinidad (p.e. biotina + estreptavidina fluorescente) - RCA (rolling circle amplification) ELISA Marcaje radioisotópico Estudio de interacción proteína con proteína, DNA o fármaco

20 Sistemas de detección de proteínas (2) SELDI-MS: espectroscopia de masas con desorción ionización láser incrementado en superficie - No necesita marcaje de ningún tipo: detección directa - Se utiliza en chips recubiertos de capa metálicas, donde el láser vaporiza las proteínas y la MS revela la identidad de la proteína AFM: microscopia de fuerza atómica - Aprovecha cambios en al topológicos en la superficie para identificar las proteínas capturadas SPR: resonancia de plasma en superficie - Permite detección en tiempo real - Seguimiento cinética de interacción (p.e.) antígeno-anticuerpo - Amplio rango de pesos moleculares, afinidad y velocidad de unión

21 Chips analíticos Se unen diferentes tipos de ligandos, como anticuerpos, antígenos, aptámeros de DNA o RNA, carbohidratos pequeñas moléculas Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión Determinar niveles de expresión de proteínas. Perfiles de expresión Diagnóstico clínico

22 Chips analíticos: anticuerpos - Es el más usual - Se depositan los anticuerpos a alta densidad en el chip - Se pasa un extracto celular, suero o incluso células vivas sobre el chip - El antígeno se une - Detección con antígeno (extracto) marcado o con un segundo anticuerpo Desventajas: - Tener agentes que reconozcan la proteína de interés: anticuerpos - Anticuerpos policlonales poco específicos y caros - Anticuerpos monoclonales mucho mas caros, más difíciles de producir y tardan más tiempo Alternativa a producción de anticuerpos o sucedáneos - Presentación de Ab en fagos - Presentación de ribosomas - SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) - Presentación de mrna - Affibody display Construcción de un amplio repertorio de regiones con actividad de unión potencial

23 Chips analíticos: alergenos o antígenos - Inverso al anterior - Se depositan los antígenos a alta densidad en el chip - Se detectan los anticuerpos (normalmente suero) sobre el chip - Detección de los anticuerpos Ejemplo 1: Hiller et al. 94 alergenos purificados unidos a vidrio Perfiles de reactividad frente a las IgE de pacientes alérgicos Pequeñas cantidades de suero Test de alergia alternativo al de piel Ejemplo2: Robinson et al. >300 autoantígenos de 8 enfermedades autoinmunes, sobre vidrio Pequeñas cantidades de suero

24 Chips analíticos: péptidos Objetivo: Detección de epitopos en las proteínas que definan su actividad básica Ejemplo 1: Houseman et al - Inmovilización en vidrio recubierto de oro de >3000 péptidos de 9 aminoácidos de longitud - Localización de sustratos de la c-src tirosina quinasa - Detección con SPR, fluorescencia e imagen de fósforo Ventajas: - Péptidos más cortos - Péptidos más estables que las proteínas - Permiten fabricación de chips de alta densidad - Síntesis del péptido in situ mediante fotolitografía o síntesis dirigida por luz (ahorro económico ya que se necesita muy poco material) Chips analíticos: carbohidratos

25 Chips funcionales Las proteínas o los péptidos provenientes del proteoma de un organismo se purifican o se sintetizan individualmente usando métodos de alto rendimiento o capacidad de ejecución (HT) Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión Permite analizar: - Actividad de proteínas - Propiedades de unión a ligando - Modificaciones post-traduccionales - Identificación dianas farmacológicas - Construcción de redes biológicas

26 Chips funcionales: ejemplos Ejemplo 1: Zhu et al Análisis de interacción de familias de proteínas -119 proteinas quinasas y 17 sustratos -Los sustratos son inmovilizados en nanopocillos -Las quinasas se incuban con los sustratos en presencia de ATP* -Se detectan los sustratos marcados con imagen de fósforo Ejemplo 2: Zhu et al Análisis de un proteoma completo de 6200 ORFs de levaduras. - Las proteínas se marcaron con GST y con Hisx6 (ambos). Se obtuvo - un rendimiento del 80% de proteínas funcionales - Se unen al chip recubierto de Ni-NTA con la His x6 - Chequeo de calmodulina y fosfoinosítidos (PIs) - Se obtuvieron 6 interacciones conocidas junto con 33 nuevas de calmodulina y mas de 150 proteínas que interaccionaban con los PIs

27 Aplicaciones generales de los chips

28 Genómica Bioquímica vs Chips Genómica bioquímica: - Requiere 64 ensayos para cubrir el genoma de levadura (grupos de 96 proteínas) - Es muy flexible para muchos tipos de ensayos bioquímicos - Particularmente útil para ensayos de actividad enzimática Desventajas: El uso de los grupos de proteínas (o pools) no asegura la calidad de las proteínas Las otras 95 proteínas pueden interferir con la medida No permite medidas fiables de unión con fluorescencia No puede maneja múltiples positivos al mismo tiempo Chips de proteína: Permite chequear la calidad individual de cada proteína Identificación inmediata de ORFs responsables de una actividad específica Identificación de positivos múltiples en una sola vuelta Análisis de alto rendimiento de actividades proteicas Automatización de la construcción, ensayo y lectura de resultados Desventajas: Se necesitan cultivar 6000 cepas (levadura) y 6000 purificaciones de proteínas Se necesita inmovilizar los sustratos para los ensayos de unión fluorescentes

29 Conclusiones Los chips pueden ser una herramienta poderosísima en la biología a gran escala La metodología de fabricación sobre vidrio está validada para análisis de proteína a partir de un proteoma completo La metodología de fabricación esta robotizada, así como la de ensayo y lectura de resultados La mejora de la producción de anticuerpos como reactivos influirá en la mejora de los chips como herramientas en el análisis del proteoma