GUIA DE VALIDACION DE METODOS PARA EL ANALISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN PRODUCTOS VEGETALES

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1 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 1 de 10 GUIA DE VALIDACION DE METODOS PARA EL ANALISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN PRODUCTOS VEGETALES

2 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 2 de 10 DIRECTORIO MVZ Enrique Sánchez Cruz Director en Jefe del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria MVZ. Hugo Fragoso Sánchez Director General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera QA Mayrén Cristina Zamora Nava Directora del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes MVZ Linda Coatlicue García López Subdirectora de Diagnóstico y Detección de Organismos Patógenos LAE Daniel González Ávila Subdirector de Monitoreo y Evaluación de Calidad MC María Felipa López Durán Coordinadora del Laboratorio Central Tecámac, Edo. De México, marzo de 2015

3 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 3 de 10 CONTENIDO 1. PROPOSITO 4 2. ALCANCE 4 3. REFERENCIAS 4 4. DESARROLLO SELECCIÒN DEL METODO ESTABLECIMIENTO DEL PROTOCOLO TABLA DE CONTINGENCIAS EVALUACIÒN DEL DESEMPEÑO DE METODOS LIMITE DE DETECCION REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD EFICACIA RELATIVA ESPECIFICIDAD RELATIVA SENSIBILIDAD RELATIVA RECUPERACIÓN ROBUSTEZ INFORME DE RESULTADOS 9 5 ANEXOS

4 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 4 de PROPÓSITO. Establecer los lineamientos y criterios para la evaluación del desempeño de métodos aplicados en LDDOP aportando evidencia objetiva que permita establecer la veracidad de los resultados particulares para su uso. 2. ALCANCE. El presente documento aplica para el área técnica del Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos (LDDOP) 3. REFERENCIAS NMX-EC IMNC-2006 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración. CRITERIOS DE APLICACIÓN DE LA NORMA NMX-EC IMNC-2006 / ISO/IEC 17025:2005 UNE-EN ISO Microbiología de los alimentos para consume humano y animal Protocolo de Validación de métodos alternativos.(iso 16140:2003) 4. DESARROLLO 4.1 Selección del método Para validar un método, en necesario considerar si el tipo de Método es normalizado o No Normalizado con la finalidad de establecer los parámetros correspondientes Método Normalizado Se consideran métodos o procedimientos normalizados, aquellos publicados en Normas Oficiales Mexicanas (NOM), Normas Mexicanas (NMX) ó los emitidos por organizaciones de normalización, extranjeras, regionales e internacionales; todas reconocidas, tales como FDA, USDA, ISO, EN, ASTM, AOAC, EPA, USP, Estándar Methods, etc. Para métodos o procedimientos normalizados el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la confirmación del método para demostrar que cumple las especificaciones del mismo y cuenta con la competencia técnica para realizarlo adecuadamente, tomando en consideración sus propias instalaciones, equipo y personal. La confirmación del método debe realizarse de acuerdo a lo siguiente: Repetibilidad. Reproducibilidad. Eficacia Relativa. Especificidad Relativa Sensibilidad Relativa Método no Normalizado Los métodos no normalizados, propios o desarrollados por el laboratorio, los métodos obtenidos de publicaciones científicas, así como los métodos normalizados modificados o ampliados o usados fuera de su alcance propuesto el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la validación del método, para evaluar estos parámetros se requiere un número mayor de muestras.

5 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 5 de 10 Límite de detección. Repetibilidad. Reproducibilidad. Eficacia Relativa. Especificidad Relativa / Exclusividad Sensibilidad Relativa / Inclusividad Recuperación Robustez 4.2 Establecimiento del Protocolo Antes de iniciar con la validación de un método, es necesario contar con el Protocolo de Validación correspondiente al método a validar. Para ello, es necesario realizar lo siguiente: Nota: Durante la ejecución del protocolo de validación se deberán documentar todas las actividades realizadas junto con los resultados obtenidos Pruebas preliminares Las pruebas preliminares se realizan para asegurar que no existe algún factor que no permita la detección del organismo de interés por el método empleado, se pueden realizar pruebas preliminares para determinar: El efecto o interferencia de la matriz sobre el método Evaluar reactivos que van a ser utilizados La preparación de las muestras, etc. Estas pruebas se registraran en el formato correspondiente Selección de matriz Los criterios de selección de matriz para la evaluación del desempeño del método, se basan en: Alertas / Notificaciones Vinculación epidemiológica entre la matriz y el organismo diana. Programas de Monitoreo y Vigilancia Petición explicita del cliente Idoneidad y disponibilidad de la matriz. Categorías de matrices (Ver Anexo). Registro histórico de muestras analizadas Otras Preparación del inoculo Para realizar las diluciones que se van a emplear para inocular las muestras se siguen las indicaciones de trabajo para diluciones bacterianas del laboratorio, tomando en cuenta las organismos Diana / Blanco y No Diana / Blanco. Microorganismo diana. El nivel de inoculo debe ser de 10 a 100 veces mayor que el nivel de detección relativo mínimo del método y debe emplearse el protocolo completo del método y cuando se obtengan resultados falsos negativos o dudosos, la cepa debe ser analizada otra vez con el método de referencia. Microorganismo no diana. El nivel de inoculo de cepas debe ser mayor al nivel del microorganismo diana (10 veces más), mínimo 1 microorganismo no diana por ensayo.

6 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 6 de 10 Tabla 1. Criterios generales para la validación de métodos cualitativos. Criterios Nivel 1 Nivel 2 Número de microorganismos 1, 2 diana (inclusividad) 10 (20 para Salmonella) 30 cepas Número de microorganismos 3 no diana (exclusividad) 10 cepas 20 cepas Número de alimentos 1 o más 1 o más Niveles de inoculación / matriz el nivel usualmente encontrado en la matriz / 3 1 inoculado y 1 sin inocular - 5 niveles 5 Número de repeticiones de cada nivel 20 cepas 20 cepas Adición de cepas competitivas Microflora natural presente Comparación con método de referencia Si Si 1 Cuando no sea posible cumplir con los criterios de inclusividad/exclusividad, el laboratorio podrán utilizar las cepas disponibles, o trabajar en colaboración con otro laboratorio; siempre que el material sea de una fuente trazable y documentada. 2 La elección de cepas de inclusividad deberá considerar la relevancia genética, grupos serológicos, diversidad bioquímica, virulencia, frecuencia de ocurrencia, etc., del organismo diana o blanco. (Consultar apéndice 3, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods). 3 La elección de cepas de exclusividad debe basarse en la estrecha relación del organismo diana o blanco con organismos que potencialmente puedan presentar una reacción cruzada, por presentar características similares de virulencia, frecuencia de ocurrencia, etc. (Consultar apéndice 3, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods). 4 Para la validación de métodos moleculares, los criterios de inclusividad y exclusividad deben considerar adicionalmente la cantidad de templado, el uso de células bacterianas, purificación de ácidos nucleicos, la comparación previa de los primers, sondas o secuencias con bases de datos genómicas. Adicionalmente, se debe incluir el uso de cepas control positivo y negativo, así como el control interno de reacción para PCR en tiempo real. 5 Primer nivel: Deberá ser el control negativo; segundo nivel: el nivel teórico de detección; tercer nivel: deberá ser un nivel de detección por arriba del nivel teórico; cuarto y quinto nivel: Deberán ser mayores que el nivel de detección anterior Preparación de la muestra La preparación de la muestra debe considerar la microflora natural presente en la matriz, la cual se determinará mediante el conteo de mesófilos aerobios (APC) para verificar la microflora fondo. Cuando no sea posible asegurar la presencia del microorganismos diana en la matriz vegetal, se procederá a la inoculación artificial, conforme al punto y Registrar la muestra en el formato de inoculación de muestras del laboratorio, con la siguiente información Identificación de la muestra Cantidad de la muestra. Concentración de Inoculo de organismo Diana Concentración de Inoculo de organismos No Diana Método de preparación de la muestra Tamaño de la muestras Estado de maduración de la matriz Inoculación de muestras Considerando que las matrices vegetales frescos, no presentan una distribución uniforme de contaminación microbiológica, se pueda presentar una inhibición propia de la matriz, un estrés microbiano, o una lesión de los microorganismos, será necesario realizar una contaminación artificial con el organismo diana, y en su caso la inclusión de microflora competitiva.

7 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 7 de 10 La inoculación de las muestras se realiza en condiciones asépticas, preferentemente dentro de una cabina de seguridad biológica. Para realizar la inoculación de las muestras se deberá emplear material de referencia, si está disponible o material verificado en las instalaciones del LDDOP, presentando certificado de calidad y/o informe de verificación. La inoculación artificial debe asegurar la uniformidad de la contaminación en la matriz, que permita la recuperación del microorganismo en la porción de la matriz utilizada. 4.3 Tabla de contingencias Al tratarse de pruebas cualitativas los resultados se dan en dos categorías, Positivo/Negativo y se establece una tabla de comparación respecto con el valor esperado y el valor obtenido por lo de esta forma se pueden ingresan los datos en una tabla de resultados de validación, donde se realice la captura y análisis de resultados. Tabla de contingencias Respuesta Muestra inoculada Muestra no inoculada Resultado Positivo Verdadero positivo (VP) Falso Positivo (FP) Resultado Negativo Falso negativo (FN) Verdadero Negativo (VN) 4.4 Evaluación del desempeño de métodos. Proceso que se realizara en el laboratorio para demostrar que un método produce consistentemente resultados confiables en las condiciones particulares del laboratorio evaluando los siguientes aspectos: Limite de detección Demostrar la concentración más baja en la que el método es capaz de recuperar al microorganismo de las muestras inoculadas con un nivel bajo de inoculo (menor a 5 UFC s). LD= VP x 100 Ni Dónde: VP= Resultados Positivos de muestras con inoculación baja Ni = Muestras inoculadas (menos a 5 UFC s) Criterio de aceptación: Mayor o igual 50% Repetibilidad (R) Grado de concordancia entre resultados sucesivos e independientes obtenidos por el mismo método empleando un material idéntico bajo las mismas condiciones (aparatos, operadores, laboratorio e intervalos de tiempos cortos, es decir condiciones de repetibilidad) Criterio de aceptación: Mayor o igual a 90% Reproducibilidad R= N x 100 VP Grado de concordancia entre resultados de análisis individuales en materia de análisis idéntico empleando el mismo método y obtenido por operadores en diferentes laboratorios empleando equipos diferentes (es decir unas condiciones de reproducibilidad)

8 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 8 de 10 El análisis es realizado por al menos dos personas y se evalúan los criterios de Eficacia Relativa, Especificidad Relativa y Sensibilidad Relativa de forma independiente. Criterio de aceptación: Mayor igual al 95% de eficacia relativa por cada analista Eficacia Relativa (ER) Grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método con las muestras inoculadas y las que no están inoculadas Criterio de aceptación: Mayor igual a 95% ER= VP+VN x 100 N Especificidad Relativa (ES) / Exclusividad Capacidad del método para distinguir el analito blanco u organismo diana, de otros organismos similares, pero genéticamente distintos o no blancos, es decir la capacidad de no detectar el analito cuando no está presente en la muestra. Criterio de aceptación: Mayor igual al 95% ES = VN x 100 Ns Sensibilidad Relativa (SR) / Inclusividad Capacidad del método para detectar el analito cuando se encuentra presente, en una amplia gama de microorganismos no diana. Por ejemplo: clasificación taxonómica, composición inmunológica, genética, etc. Criterio de aceptación: Mayor igual al 95% SR = VP x100 Ni Recuperación (Re) Determina la fracción del analito adicionado a la muestra (Fortificada) antes del análisis que es recuperado con la prueba Criterio de aceptación: Mayor igual al 95% N= Número total de muestras Ni= Número de muestras inoculadas Ns= Número de muestras sin inocular Robustez %Re= VP x 100 Ni La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado por variaciones deliberadas de los parámetros del método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso

9 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 9 de 10 normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias), se pueden obtener resultados confiables. Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificación de las condiciones analíticas. Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran: Analistas Equipos Reactivos ph Temperatura. Tiempo de reacción. Matriz. Otros. Para realizar en análisis de robustez se aplica el test de Youden y Steiner aplicado de la siguiente forma: Prueba de Robustez de Younden y Steiner Letra Descripción Valor Nominal Valor Alto Valor Bajo A/a Condición 1 X A a B/b Condición 2 Y B b Se deben establecer las comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de alto valor contra la de valor bajo: (A a), (B b), (C c), (D d), (E e), (F f) y (G g) Condición A/a A A A A a a a a B/b B B B b B b b b C/c C c C c C c C c Resultados Donde los resultados obtenidos se reportan como presencia (1) o ausencia (0) Para las variables A y a: Donde el promedio de A se calcula: (A+A+A+A) = X 4 Donde el promedio de a se calcula: (a+a+a+a) = X Informe de resultados El método estadístico utilizado para la evaluación del método se deberá incluir en el informe de resultados, así como la eliminación de resultados aberrantes, tales como: Controles negativos (sin inocular) que arrojen un resultado positivo, son indicadores de un error del laboratorio/operador. Evidencia de no homogeneidad o uniformidad del material inoculado.

10 Clave: GVMM Revisión: 00 Fecha de emisión: 03/2015 Página 10 de 10 Valores atípicos Las actividades realizadas así como los resultados obtenidos se describirán en un informe de validación anexando la evidencia que lo respalde. 5. ANEXOS 5.1 CATEGORIAS DE MATRICES FRUTAS HORTALIZAS Bayas y otras frutas pequeñas Brasicáceas (Ej. brócoli) (Ej. fresas, zarzamora, uva) Frutas de hueso (Ej. durazno) De Bulbo (Ej. cebollin) Frutas pomáceas (Ej. manzana) Cucurbitáceas (Ej. calabaza) Frutas tropicales y subtropicales variadas De fruto (Ej. tomate, chile) (de piel comestible) (Ej. higo) Frutas tropicales y subtropicales variadas De hojas verdes (Ej. espinaca, lechuga) (de piel no comestible) (Ej. papaya) Frutos cítricos (Ej. naranja) De tallo (Ej. apio) HIERBAS AROMATICASY ESPECIAS Leguminosas (Ej. ejote) OTROS Especias (Ej. tomillo Setas Hierbas aromáticas (Ej. epazote Brotes de semilla (Ej. Germen de alfalafa) SUPERFICIES DE CONTACTO AGUA (Vivas e inertes) Agua de Riego en producción primaria Hisopo Agua potable proceso de empaque Esponja