FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina

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1 FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL SEGUIMIENTO TESIS DOCTORAL Curso Autora: Marta Anna Sobas Directores: Prof. José Luis Bello López Prof. Manuel Mateo Pérez-Encinas

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3 FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL SEGUIMIENTO Marta Anna Sobas 10 de Junio 2010

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5 D. José Luis Bello López, Profesor Titular de Hematología, Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICO Que la tesis doctoral titulada ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y CLINICA, presentada por Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi dirección y considero que reúne las condiciones necesarias para ser defendida frente al Tribunal correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía. En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010 Fdo.: Prof. D. José Luis Bello López

6 D. Manuel Mateo Pérez Encinas, Profesor Asociado de Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICO Que la tesis titulada ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y CLINICA presentada por Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi dirección y considero que reúne las condiciones necesarias para ser defendida frente al Tribunal correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía. En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010 Fdo.: Prof. D. Manuel Mateo Pérez Encinas

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8 A mi familia en Polonia y en España Mojej rodzinie w Polsce i w Hiszpanii

9 AGRADECIMIENTOS Al Prof. José Luis Bello López, por haber aceptado la dirección de este proyecto y sobre todo por su ejemplo personal como Jefe de Servicio de Hematología y Hemoterapia del Hospital Clínico de Santiago de Compostela, con su dedicación al trabajo ha contribuido a formarme como hematóloga y como médico. Al Prof. Manuel M. Pérez-Encinas, por su ayuda en iniciar, proseguir y finalizar este trabajo. Y sobre todo por su tiempo, paciencia y cariño. Sin su ayuda, la realización de este trabajo no sería posible. Al Prof. Radek Skoda (Department of Biomedicine, University Hospital Basel), por introducirme en el apasionante mundo de anomalías genéticas de las neoplasias mieloproliferativas, por dejarme participar en alguno de sus proyectos de investigación y por su amistad. A Dra. Teresa González López y Dra. Celsa Quinteiro García por sus enseñanzas para no perderme en el mundo de la genética, por su ayuda en el laboratorio de Medicina Xenómica y sobre todo por su infinita paciencia y apoyo. Al Dr. Francisco Gude Sampedro, por su paciencia y por su ayuda en esa materia, para mí tan complicada, que es la estadística.

10 A todo el personal del Servicio de Hematología y Hemoterapia, médicos, enfermeros, auxiliares y técnicos de laboratorios, todos en algún momento me han ayudado y animado a seguir. Pero sobre todo quiero agradecer a los médicos hematólogos y MIR que han colaborado directamente en el manejo de los pacientes que han sido motivo de análisis, es decir a Aída Fernández Montero, María Ángeles Bendaña López, María José Rabuñal Martinez, Natalia Alonso Vence, José Ángel Díaz Arias, María Dolores Vilariño López y Eugenia Fernández Mellid. A mis amigos del Department of Biomedicine en el Hospital Universitario de Basilea: Renate Looser, Pontus Lundberg, Franz Schaub, Ralph Tiedt, Hui Hao-Shen, Li Sai por su desinteresada ayuda en mi aprendizaje de las técnicas del estudio molecular y por su amistad. Deseo expresar mi agradecimiento a todos los pacientes diagnosticados de neoplasias mieloproliferativas crónicas (especialmente a Victoria y a su familia), que han participado con su consentimiento en este estudio. Sin ellos, nuestro trabajo carecería de sentido. Por último, mencionar que este trabajo ha sido subvencionado por la beca de la Consellería de Sanidade, Xunta de Galicia (PS08/01), por lo tanto quiero dar las gracias al tribunal y autoridades administrativas que han confiado en este proyecto.

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12 ÍNDICE ABREVIATURAS 4 I. REVISIÓN DEL TEMA 6 1. Introducción 7 2. Epidemiología y factores pronósticos 8 3. Criterios diagnósticos Tratamiento Patogénesis Introducción Mutación JAK2V617F Mutaciones del gen MPL Mutaciones del gen JAK2-exón Relación entre genotipo y fenotipo JAK2V617F y clínica JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg JAK2V617F: la carga alélica JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F Secuenciación Pirosecuenciación PCR alelo-específica Citogenética convencional Alteraciones inmunológicas en MP 27 II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Justificación del trabajo Hipótesis de estudio Objetivos del estudio Objetivo general Objetivos específicos. 31 III. MATERIAL Y MÉTODOS Muestra del estudio Metodología Variables del estudio Variables clínicas Variables analíticas Estudio de las mutaciones Estudio morfológico de médula ósea Revisión de los criterios diagnósticos de WHO 38 1

13 ÍNDICE 3. Procedimientos y técnicas utilizadas Análisis de la mutación JAK2V617F Análisis de otras mutaciones en NMP Estudio de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK Estudio de las mutaciones en el gen MPL Estudio citogenético de la médula ósea Subpoblaciones linfocitarias Análisis estadístico 45 IV. RESULTADOS Criterios diagnósticos WHO Criterios diagnósticos WHO - validación Grupo con sospecha de PV Grupo con sospecha de TE Grupo con sospecha de MFP Grupo con progresión Estudio histopatológico de las NMP (WHO 2008) Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en MP (WHO 2008) Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos Estado JAK2V617F y estudio histopatológico Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas Carga alélica JAK2V617F y diagnóstico según WHO Carga alélica JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre la PV y la TE. Curva ROC Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas Carga alélica JAK2V617F y estudio histopatológico Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F evolución clínica Seguimiento del grupo JAK2V617F-neg Seguimiento del grupo JAK2V617F-pos Grupo completo de pacientes Grupo sin tratamiento citorreductor Grupo con tratamiento citorreductor con HDU Grupo con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos Grupo con progresión de NMP a. Progresión a otra NMP b. Progresión de una NMP a LMA uevas mutaciones su interés diagnóstico y significado clínico Estudio de las mutaciones en el gen JAK2-exón Estudio de las mutaciones en el gen MPL Cariotipo y JAK2V617F Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F Factores pronósticos y JAK2V617F 89 2

14 ÍNDICE 8.1. Supervivencia y JAK2V617F Eventos vasculares y JAK2V617F Progresión y JAK2V617F 91 V. DISCUSIÓN Criterios diagnósticos WHO Criterios diagnósticos WHO - validación Estudio histopatológico de las NMP WHO Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en MP (WHO 2008) Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F evolución clínica uevas mutaciones su interés diagnóstico y significado clínico Cariotipo y JAK2V617F Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F Factores pronósticos y JAK2V617F Supervivencia Eventos trombóticos Progresión a MFsec o LMA 121 VI. CONCLUSIONES 123 VII. BIBLIOGRAFÍA 127 3

15 ABREVIATURAS Alo-TPH: transplante alogénico de progenitores hematopoyéticos ANA: anagrelida AMO: aspirado de médula ósea BMO: biopsia de médula ósea ELN: European LeukemiaNet EPO: eritropoyetina FAL: fosfatasa alcalina leucocitaria HDU: hidroxiurea INF-α : interferón α JAK2V617F-neg: ausencia de la mutación V617F en el gen JAK2 JAK2V617F-pos: mutación V617F en el gen JAK2 JAK2-exón 12: mutación en el exón 12 del gen JAK2 LDH: lactato dehidrogenasa Linfocitos NK: linfocitos natural killer TNK: linfocitos T con actividad de linfocitos NK LMA: leucemia mieloide aguda LMC: leucemia mieloide crónica MFP: mielofibrosis primaria MFsec: mielofibrosis secundaria MO: médula ósea MPL: gen que codifica el receptor de la trombopoyetina NMP: neoplasia mieloproliferativa NRh: no respuesta hematológica NFg: no respuesta genética (se refiere a la mutación JAK2V617F) PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) Ph-neg: cromosoma Filadelfia negativo PV: policitemia vera 4

16 ABREVIATURAS PVSG: Polycythemia Vera Study Group RCh: respuesta hematológica completa RCg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F) RPh: respuesta hematológica parcial RPg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F) SNP: Single ucleotide Polymorphisms SP: sangre periférica TE: trombocitemia esencial TPO: trombopoyetina WHO: World Health Organization 5

17 I. REVISIÓN DEL TEMA 6

18 I. REVISIÓN DEL TEMA 1. Introducción Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) engloban un grupo de entidades hematológicas que se originan en la expansión clonal de una célula germinal pluripotencial. Comparten ciertas características clínicas y biológicas como son la presencia de una médula ósea hipercelular, una incidencia aumentada de complicaciones trombóticas y hemorrágicas y, a largo plazo, un riesgo aumentado de evolución a leucemia aguda [1]. Se caracterizan por la proliferación incontrolada en la médula ósea de una o más líneas celulares mieloides con maduración [2]. Dentro de las NMP diferenciamos: NMP cromosoma Philadelfia positivos (Ph-pos) y Ph negativos (Ph-neg). Bajo el término de NMP Ph-neg (llamadas a partir de ahora NMP) se incluyen, entre otras entidades, la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP). El descubrimiento en el año 2005 de la mutación V617F del gen JAK2V617F en el 95% de los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP ha venido a apoyar la agrupación de estas tres entidades en una posición nosológica común [3-7]. El aumento de la masa eritrocitaria en la PV, la trombocitosis en la TE y la fibrosis medular en la MFP son las características fundamentales de cada una de estas tres entidades. 7

19 I. REVISIÓN DEL TEMA 2. Epidemiología y factores pronósticos La incidencia anual de PV y de TE es de 2 a 3 casos por 100,000 habitantes, mientras que la de MFP es de solo 0,5 casos por 100,000 habitantes año [8-9]. A raíz de la incorporación de los nuevos criterios diagnósticos WHO 2008 [10], se ha observado un aumento de la incidencia de TE mientras que la de PV y MFP se mantiene estable [11]. Dicho aumento se debe al descenso de cifra de plaquetas y a la incorporación de las mutaciones JAK2V617F y del gen MPL en los criterios diagnósticos. La edad media de presentación de la PV y de la TE es de unos 60 años y ambas entidades son poco frecuentes en pacientes jóvenes. Solamente el 5% de los enfermos con PV tienen menos de 40 años, el 1% menos de 25 años y el 0,1% menos de 20 años. En la TE el 15-20% de los pacientes tienen menos de 40 años de edad en el momento del diagnóstico. En la MFP la edad media de presentación de MFP es de unos 65 años [9,12-14]. La supervivencia media de los pacientes diagnosticados de PV o TE es de 15 años, la cual según algunos estudios es similar a la de la población general [13-16], pero podría estar acortada según otros estudios [17-18]. La supervivencia de estos pacientes puede verse acortada sobre todo por el desarrollo de las complicaciones trombóticas y por progresión de la enfermedad a mielofibrosis secundaria (MFsec) o a leucemia mieloide aguda (LMA). El riesgo a 10 años de desarrollar mielofibrosis es <5% para la TE y <10% para la PV, y el riesgo para desarrollar una LMA es de <2% en la TE y <6% en la PV [19-20]. Los pacientes con MFP tienen una supervivencia media de 4-5,5 años y entre las causas fundamentales de la muerte se encuentran: progresión a LMA (en 20% de los casos a 10 años de seguimiento), alteraciones relacionadas con el fallo medular (anemia, sangrado), alteraciones hepáticas y trombosis [17]. 8

20 I. REVISIÓN DEL TEMA La patogénesis de la trombosis en las NMP es multifactorial y en parte se atribuye a la hiperviscosidad sanguínea y a factores de riesgo cardiovascular como el tabaquismo, la hipertensión arterial, la hipercolesterolemia, la diabetes o las trombofilias hereditarias. También se valora la posible influencia de otros factores, entre ellos la cifra de plaquetas y leucocitos, la interacción entre ambos y finalmente la presencia de la mutación JAK2V617F [15-16,19,21-35]. Respecto a la progresión a mielofibrosis secundaria (MFsec) o leucemia mieloide aguda (LMA) se dispone de escasa información. La duración de la enfermedad es el único factor de riesgo claramente asociado con la progresión a MFsec [35-36]. En cuanto a la progresión a LMA, la edad superior a 70 años y el empleo de citostáticos diferentes de la hidroxiurea (HDU) y el interferón α (INF-α) fueron los únicos factores relacionado con el riesgo de progresión [36]. Recientemente se ha sugerido que la leucocitosis x 10 9 /L, podría ser otro factor de riesgo de progresión a MFsec o a LMA [31,37]. Además en varios estudios se analizó la relación entre la mutación JAK2V617F y el desarrollo de la progresión, sin poder sacar conclusiones definitivas [5,17,32,38-46]. 9

21 I. REVISIÓN DEL TEMA 3. Criterios diagnósticos El diagnóstico tradicional de las NMP se basaba en un conjunto de datos clínicos, en el recuento celular en sangre periférica (hematimetría), el estudio morfológico de la médula ósea y la sangre periférica, y en la exclusión de otros cuadros tumorales o reactivos que pueden cursar con una expresión hematológica similar. Varios grupos, especialmente el Polycythemia Vera Study Group (clasificación PVSG) cuya primera clasificación data del año 1975 [47] y un grupo de expertos de la Organización Mundial de la Salud (clasificación WHO revisada periódicamente) [48] han elaborado unos criterios diagnósticos, basados esencialmente en la exclusión. Con el descubrimiento de la mutación V617F en el gen JAK2 en año 2005, se planteó su estudio con finalidad diagnóstica. Además se vio que la TE con mutación JAK2V617F, presentaba un curso de la enfermedad similar al de la PV por lo que se sugirió que los pacientes TE JAK2V617F-pos son realmente enfermos con PV inaparente [43]. En este sentido, se han realizado muchos trabajos de distintos grupos de investigación tanto básica como clínica [3-7,43-51], que llevaron en el año 2008 a la última actualización de los criterios diagnósticos WHO [10], incluyendo un cambio de nomenclatura, actualmente llamadas neoplasias mieloproliferativas (NMP), en los que se incluye el estudio de la mutación JAK2V617F (véase la Tabla 2, 3 y 4). La incorporación de los criterios anatomopatológicos dentro de los criterios diagnósticos de las NMP, ocurrió por la primera vez en la clasificación de la Organización Mundial de la Salud, WHO 2001 [48]. El papel diagnóstico de la biopsia de médula ósea (BMO) ha sido ratificado en la nueva clasificación de la WHO 2008 aunque la reproductibilidad de los criterios histopatológicos, sobre todo de la morfología de la línea celular megacariocítica ha sido cuestionada en publicaciones recientes [52-53]. 10

22 I. REVISIÓN DEL TEMA 4. Tratamiento El tratamiento de las NMP varía según el diagnóstico (PV vs TE vs MFP) y en función de riesgo trombótico de cada pacientes [33,54-59]. En pacientes jóvenes, sin gran componente proliferativo ni factores de riesgo trombótico, se recomienda la abstención terapéutica o la administración de antiagregantes (ácido acetilsalicílico) en dosis bajas [60]. En la PV también debe realizarse sangrías con el objetivo de mantener el hematocrito (Hematocrito) <0,45% en hombres y <0,42% en mujeres [55-56]. El tratamiento citorreductor se reserva cuando han fracasado otras medidas, así como para los pacientes mayores y/o con factores de riesgo trombótico asociados y/o gran componente proliferativo. Los fármacos citorreductores más frecuentemente utilizados son: hidroxiurea (HDU), anagrelida (ANA) y en algunos casos Interferón-α (INF-α) [61]. El tratamiento de los enfermos con MFP es fundamentalmente paliativo y dirigido a controlar síntomas [62-63]. En los pacientes jóvenes con el diagnóstico de la MFP o mielofibrosis secundaria (progresión de PV o TE) puede estar indicada la realización de un trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-tph) [62-66]. 11

23 I. REVISIÓN DEL TEMA 5. Patogénesis 5.1. Introducción La policitemia vera, fue mencionada por primera vez en el año 1892 por Vaquez [67] y su primera descripción fue publicada por Osler en 1903 [68]. En 1951 Dameshek sugirió que en las NMP había un incremento en la proliferación de células mieloides, debido probablemente a una alteración desconocida que estimulaba dicha proliferación [1]. Además este autor estableció la relación entre la PV, la TE y la MFP, englobándolas en el grupo llamado enfermedades mieloproliferativas. En 1974, se describió que los progenitores eritroides de la médula ósea de los pacientes con PV podían cultivarse in vitro en ausencia de eritropoyetina [69]. La existencia de un crecimiento autónomo de los progenitores eritroides sugería un comportamiento neoplásico y, por lo tanto, un origen clonal de la enfermedad. Dicho origen clonal se demostró estudiando los patrones de inactivación del cromosoma X en mujeres con PV [2,70]. Sin embargo, los genes implicados en la etiopatogenia de la PV permanecieron ocultos hasta muy recientemente, cuando Kralovics et al [71] refirieron que el 33% de los pacientes con PV presentaban una pérdida de la heterocigosidad en el brazo corto del cromosoma 9. Dicho hallazgo reforzaba el origen clonal de la PV y señalaba al brazo corto del cromosoma 9 como el lugar donde se encontraba el gen causal de la PV. Finalmente, en el año 2005 cinco grupos independientes demostraron de forma simultánea que la mayoría de pacientes con PV presentaban una mutación puntual localizada en el gen de la cinasa JAK2, localizado en el brazo corto del citado cromosoma 9 [3-7]. 12

24 I. REVISIÓN DEL TEMA 5.2. Mutación JAK2V617F JAK2 (cr9p24), es un gen que codifica una proteína citoplasmática con actividad tirosincinasa que interviene en la cascada de transducción de señales intracelulares [72-73], al activarse los receptores de citocinas tipo I como son los receptores de la eritropoyetina, del G-CSF, del GM-CSF o de la trombopoyetina (MPL). La mutación V617F afecta a un aminoácido situado en el dominio JH2 y se produce por un cambio de una guanina en el alelo salvaje por una tirosina del alelo mutado en el nucleótido 1849 (en el exón 14) que origina la sustitución de una valina por una fenilalanina en la posición 617 de la proteína madura (véase Figura 1) [3-7]. Figura 1. La mutación JAK2V617F. A: Secuencia de los aminoácido del gen JAK2 mutado (mutación V617F). B: Secuencia de los aminoácidos del gen JAK2 no mutado (74 modificado). El dominio JH2 tiene actividad pseudocinasa y su función consiste en inhibir al dominio cinasa JH1 interaccionando con el bucle de activación [75]. Como consecuencia de la mutación V617F no se produce la inhibición del dominio cinasa JH1, lo que resulta en una activación constitutiva de la proteína JAK2 en ausencia de la unión del ligando al receptor 13

25 I. REVISIÓN DEL TEMA hematopoyético. Se trata, por tanto, de una mutación que provoca una ganancia de función [3-7], es decir, una activación permanente de diferentes vías de transducción de señales implicadas en la señalización de los receptores de citocinas de tipo I (EPO, G-CSF, c-mpl) como JAK-STAT, PI3K, AKT, MAPK y ERK (véase Figura 2) [3-7,76-78]. JAK2 WT SI ERITROPOYETI A JAK2 WT CO ERITROPOYETI A JAK2 CO MUTACIÓ V617F ESPACIO EXTRACELULAR EPO R-EPO R-EPO R-EPO R-CSF c-mpl JH1 JH1 P JH1 P JH1 P JH1 JH1 P JH2 JH2 JH2 JH2 JH2 JH2 FERM FERM FERM FERM FERM FERM CITOPLASMA ERITROPOYESIS PANMIELOPOYESIS AUSE CIA DE SEÑAL, JH1 I HIBIDA POR JH2 ACTIVACIÓ VÍAS TRA SDUCCIÓ DE SEÑALES ACTIVACIÓ CO STITUTIVA VÍAS TRA SDUCCIÓ DE SEÑALES Figura 2. Mecanismo de acción de JAK2. Cuando el receptor de la eritropoyetina (R-EPO) no está unido a su ligando, la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que se transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la eritropoyetina, el R-EPO se activa y se produce la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular, lo que resulta en un estímulo de la eritropoyesis. Cuando la proteína JAK2 alberga la mutación V617F, permanece fosforilada en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales. Como la mutación se produce en un progenitor hematopoyético, da lugar a un estímulo de las tres series, ya que JAK2 está implicada en la transmisión de señales de la EPO, el G-CSF y la TPO [79 modificado]. 14

26 I. REVISIÓN DEL TEMA En condiciones normales, al unirse la eritropoyetina al receptor, éste se dimeriza, de forma que las dos moléculas de JAK2 unidas al dominio yuxtamembrana citoplasmático del receptor se aproximan y se activan mutuamente por fosforilación [80-83]. Una vez activada JAK2, recluta a las proteínas STAT, que se fosforilan y dimerizan, entrando en el núcleo, donde activan la transcripción de genes implicados en la proliferación y la supervivencia [72-73]. Existen evidencias sólidas que demuestran que la mutación JAK2V617F es un evento fisiopatogénico importante en el desarrollo de las NMP [3-7,84-86]. Entre ellas el hecho de que es una mutación somática y adquirida, cuyo origen es un precursor hematopoyético pluripotencial, ya que células mieloides, eritroides, megacariocitos y linfocitos presentan la mutación [3,87-88]. Pero sobre todo los estudios funcionales con JAK2V617F en líneas celulares y en modelos animales transgénicos han demostrado el carácter oncogénico de dicha mutación y su potencial para causar la enfermedad [4-5,84-86]. La frecuencia de aparición de la mutación JAK2V617F en las tres principales entidades de NMP es variable, según la técnica de detección usada: 65-97% en pacientes con PV, 23-57% con TE y 35-95% con MFP [3-6]. Además, dicha mutación puede encontrarse con frecuencias bajas en leucemia mieloide aguda (5%), síndromes mielodisplásicos (3%), leucemia mielomonocítica crónica (6%), síndromes mieloproliferativos atípicos (20%), síndrome hipereosinofílico (1%), mastocitosis sistémica (6%) y aislados casos de leucemia mieloide aguda (LMA) primaria o leucemia mieloide crónica (LMC) [87-94]. En caso de la LMC, se detecta la coexistencia del cromosoma Ph y de la mutación JAK2V617F [90-94]. Además, la mutación JAK2V617F, no aparece en enfermos con eritrocitosis o trombocitosis secundaria [3-6], enfermedades linfoproliferativas [95-96]. En caso de individuos sanos, su detección es posible en 2% de los casos, solamente utilizando técnicas muy sensibles [97-15

27 I. REVISIÓN DEL TEMA 99]. Por este motivo estudio de la mutación JAK2V617F promete ser de gran ayuda para el diagnóstico diferencial de estas entidades. Sin embargo, JAK2V617F no es la única mutación presente en las NMP [ ]. En 2006 se describieron mutaciones en el gen MPL [ ] y en 2007 en el exón 12 del gen JAK2 [104]. Recientemente, se han comunicado nuevas mutaciones en las NMP como: TET2 [ ], CBL [ ], ASXL1 [109], IDH [110] y IKZF1 [111] de las cuales la más frecuente es la mutación TET2 que aparece en 16% de PV, 5% de TE y MFP 17%. Hasta la fecha no se ha demostrado su papel patogénico primario, siendo probablemente eventos secundarios [ ]. Además, se esta analizando su probable relación con la progresión a LMA, ya que casi 20% de los casos de NMP en la fase blástica presentan alguna de estas mutaciones [101, ] Mutaciones del gen MPL La mutación MPL-W515L afecta al aminoácido 515 del gen que codifica el receptor de la trombopoyetina y provoca la dimerización del receptor en ausencia del ligando y la activación constitutiva de la vía de transducción de señales dependiente de este receptor [ ] (véase Figura 3). 16

28 I. REVISIÓN DEL TEMA RECEPTOR MPL SI TROMBOPOYETI A RECEPTOR MPL U IDO A TROMBOPOYETI A RECEPTOR MPL MUTADO ESPACIO EXTRACELULAR TPO W515K, W515L, W515R, W515A JAK2 JAK2 P JAK2 JAK2 P P JAK2 JAK2 P CITOPLASMA ACTIVACIÓ VÍA TRA SDUCCIÓ DE SEÑALES ACTIVACIÓ CO STITUTIVA VÍAS TRA SDUCCIÓ DE SEÑALES AUSE CIA DE SEÑAL, JH1 I HIBIDA POR JH2 ESTIMULACIÓ MEGACARIOPOYESIS Figura 3. Mecanismo de acción del receptor de MPL. En condicionales normales cuando el receptor de la trombopoyetina (MPL) no está unido a su ligando la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la TPO, el MPL se dimeriza y activa, produciéndose la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular lo que resulta en un estímulo de la megacariopoyesis. Cuando el receptor MPL alberga la mutación W515K o W515L, se produce la dimerización del receptor en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales [79 modificado, ]. Se han descrito otras mutaciones, funcionalmente relevantes, en el gen MPL como: MPL- W515K, MPL-W515A y MPL-S505N [101, ]. Las mutaciones MPL W515K/L/A están presentes aproximadamente entre 1 y 9% de los pacientes con MFP y TE y la mutación MPL-S505N está descrita tanto en casos de trombocitosis familiar como en la TE esporádica. Las mutaciones en el gen MPL no se encuentran en los pacientes con PV, lo que sugiere que dichas mutaciones favorecerían el desarrollo preferencial de la línea megacariocítica con respecto a la eritroide. Esta hipótesis ha sido confirmada in vitro demostrando la mutación en progenitores hemopoyéticos multipotentes con diferenciación megacariocítica espontánea [114]. El papel etiopatogénico de la mutación W515L de MPL en la MFP se puso de manifiesto en un modelo murino en el que los ratones trasplantados 17

29 I. REVISIÓN DEL TEMA con progenitores portadores de dicha mutación desarrollaron un síndrome mieloproliferativo rápidamente progresivo, caracterizado por leucocitosis, trombocitosis, esplenomegalia y fibrosis medular, pero no eritrocitosis [102] Mutaciones del gen JAK2-exón 12 Las mutaciones en el gen JAK2-exón 12 (véase Figura 4) fueron descritas en aproximadamente el 3-5% [101,113] de los pacientes con PV JAK2-neg. Hasta la fecha, se han descrito más de 10 distintas mutaciones del gen JAK2-exón 12 [104, ]. V617F Carboxiterminal Aminoterminal FERM SH2 JH2 JH Mutaciones en el exón 12 Figura 4. Esquema de la proteína JAK2. La proteína JAK2 consta de un dominio FERM de interacción con el receptor de citoquinas, un dominio SH2 donde se unen proteínas inhibidoras de JAK2, un dominio JH1 con actividad cinasa y un dominio JH2 con actividad pseudocinasa cuya función es inhibir el dominio JH1. Localización de las mutaciones en el exón 12 y de JAK2V617F en la proteína JAK2 [116 modificado]. Los casos de PV que presentan mutaciones en el exón 12 tienen valores más altos de hemoglobina en el momento del diagnóstico que los casos de PV JAK2V617F-pos, así como valores de leucocitos y de plaquetas normales [104,115,117,121]. Se conoce, que tanto las mutaciones MLP como las del exón 12 están implicados en la fisiopatología de las NMP [102,104,113]. Además, ambas mutaciones han sido incluidas 18

30 I. REVISIÓN DEL TEMA como los marcadores clonales de las NMP JAK2V617F-neg en la nueva revisión de los criterios diagnósticos WHO 2008 [10] Relación entre genotipo y fenotipo Existen muchos motivos para pensar que exista otra alteración genética, aparte de la mutación JAK2V617F, que influye en el desarrollo de las NMP, entre ellos el hecho de que dicha mutación no aparece en todas las NMP y que la mayoría de estos casos son procesos clonales [123]. Además tampoco está claro como una mutación única JAK2V617F puede causar tres diferentes fenotipos: PV, TE y MFP y qué proceso regula la aparición de la eventual progresión. Se ha postulado que las combinaciones de factores como el número de copias (carga mutacional) de la mutación JAK2V617F, predisposición alélica, factores dependientes del huésped, y mutaciones adicionales darían lugar al fenotipo tan heterogéneo de las NMP [84,100,113, ]. Por otro lado, aunque la mutación JAK2V617F es un evento fisiopatogénico fundamental en PV, se postula que no es el evento clonogénico inicial ni en la PV ni en otras NMP (véase Figura 5) [128]. Mutación desconocida? Mutación V617F (50%) Recombinación mitótica 9pLOH (25%) Heterocigoto V617F Homocigoto V617F Figura 5. Modelo de patogénesis de las NMP [100 modificado]. 19

31 I. REVISIÓN DEL TEMA Es probable que las mutación JAK2V617F constituyan un evento genético secundario que acontece sobre una predisposición genética heredada y sobre una probable adquisición previa de un clon tumoral en la stem cell [100,113,127]. Igualmente, las mutaciones JAK2- exón 12 y las del gen MPL, a pesar de su implicación fisiopatogénica demostrada en las NMP, son probablemente eventos secundarios [100,113,116]. 20

32 I. REVISIÓN DEL TEMA 6. JAK2V617F y clínica 6.1. JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg En varios estudios se ha observado la asociación entre la mutación JAK2V617F y el fenotipo tipo PV es decir con cifras altas de hematocrito, de hemoglobina, y de leucocitos y con cifras bajas de plaquetas y de EPO [4, 43-44]. Sin embargo, los resultados acerca de la asociación entre la mutación JAK2V617F con eventos clínicos como la progresión o la trombosis es el tema que aún se está debatiendo [3-5,43-44,49,129] JAK2V617F: la carga alélica De acuerdo con la teoría de un continum entre la PV y la TE JAK2V617F-pos [43], el desarrollo de la PV podría estar favorecido por adquisición de homocigosidad para JAK2V617F ya que el estado de homocigosis aparece en el 30% de los casos con PV pero muy raramente en la TE (véase Tabla 1) [3-6,43,123,130]. El estado de homocigosis aparece como el efecto de la recombinación mitótica, promovido a su vez por la inestabilidad genética inducida por la mutación JAK2V617F [131]. De acuerdo con el estudio de Tiedt et al, los niveles bajos de expresión de JAK2V617F (heterocigosis) dan lugar a desarrollo de la TE, y niveles más elevados (homocigosis) sucesivamente a MFP y PV [132]. Por lo tanto, es probable que la cantidad del alelo mutado JAK2V617F afecte al fenotipo de las NMP. Recientemente, con la utilización de las técnicas de detección cuantitativas, surgió el término de la carga alélica (la ratio entre el alelo JAK2V617F mutado y no mutado) [87]. Hasta la fecha parece que hay acuerdo entre los autores sobre la relación directa entre la carga alélica de JAK2V617F y la cifra de hemoglobina, leucocitos, presencia de esplenomegalia y prurito e indirecta con la cifra de plaquetas. Sigue habiendo controversia 21

33 I. REVISIÓN DEL TEMA acerca de la relación entre la carga alélica JAK2V617F y aparición de eventos trombóticos, progresión a LMA y a MFsec, supervivencia y necesidad de citorreducción [45-46,124, ] JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica Hasta la fecha, se han publicado muy pocos estudios acerca de los cambios de la carga alélica durante el seguimiento de los pacientes y su implicación clínica. En relación a los pacientes JAK2V617F-neg, hay un consenso según el cual dichos pacientes no adquieren la mutación JAK2V617F a lo largo del seguimiento [43, ]. En las NMP JAK2V617F-pos, se sugiere que la carga alélica en la mayoría de los casos se mantiene estable a lo largo del tiempo [ ], pero en algunos pacientes, se han visto variaciones de la carga alélica JAK2V617F durante el seguimiento. Se observó el descenso o incluso negativización de la carga alélica JAK2V617F en relación con el tratamiento administrado: hidroxiurea (HDU), INF-α, alo-tph [142, ]. Además recientemente, se han publicados criterios de respuesta molecular según European LeukemiaNet (ELN) en estos pacientes [150]. Sin embargo, la implicación clínica de la reducción de la carga alélica JAK2V617F en estos casos no esta clara [145]. Por otro lado, es probable que la carga alélica JAK2V617F se modifique en contexto de la larga evolución de la enfermedad y del desarrollo de la progresión de una NMP a otra o a LMA. Según algunos autores la cantidad de la mutación JAK2V617F puede aumentar con el tiempo en la PV y la MFP [40,137]. En caso de TE, no existen datos concluyentes: se encuentran estudios según cuales la carga alélica se mantiene estable [133] o aumenta [134]. Se sugiere que el aumento de la carga alélica JAK2V617F, en caso de la PV y MFP, se asocia con el desarrollo de una MFsec 22

34 I. REVISIÓN DEL TEMA post-pv, marcada esplenomegalia y aumento de la necesidad de citorreducción [45-46,137,140,151]. En este momento no se dispone de estudios prospectivos de seguimiento de la carga alélica JAK2V617F en este tipo de pacientes Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F La mutación JAK2V617F puede detectarse en sangre total, granulocitos, plaquetas, preparaciones de médula ósea e incluso en biopsias de médula ósea (siempre y cuando éstas no hayan sido procesadas con reactivos que contengan mercurio). Asimismo puede detectarse en progenitores hemopoyéticos obtenidos de cultivos celulares in vitro. Se pueden aplicar diferentes técnicas para detectar la presencia de la mutación de JAK2V617F. De entre las técnicas disponibles, una de las que tiene una mayor sensibilidad es la PCRaleloespecífica cuantitativa (véase Tabla 1). Autor ref. Método de detección PV JAK2V617F-pos (homocigotos) TE: JAK2V617F-pos (homocigotos) MFP: JAK2V617F-pos (homocitogos) 4 Secuenciación 89 (30) Secuenciación 74 (25) 32 (3) 35 (9) 5 Secuenciación 65 (27) 23 (3) 57 (22) 3 Secuenciación/PCR alelo-específica 97 (26) 57 (0) 50 (19) 130 ARMS/piro secuenciación 81 (33) 41 (7) 43 (29) 123 Taqman aleloespecífica Sondas de hibridación Tabla 1. Frecuencias y métodos de detección de la mutación JAK2V617F en las NMP clásicas [152 modificado]. 23

35 I. REVISIÓN DEL TEMA Secuenciación En esta técnica, una secuencia amplificada de DNA se procesa a través de un secuenciador automático, que está basado en el principio de secuenciación de Sanger [153]. Este método utiliza didesoxinucleótidos (ddntp), derivados sintéticos de los nucleótidos que, al incorporarse a la cadena naciente, impiden que continúe la polimerización. Cada uno de los 4 ddntp empleados tiene un marcador fluorescente distinto. En el proceso se lleva a cabo una reacción de síntesis de DNA en la que se incluyen los ddntp, además del DNA que se desea secuenciar, una polimerasa y nucleótidos (dntp). El producto de esta síntesis es una colección de cadenas de DNA de longitudes crecientes en función de dónde se haya incorporado el ddntp. La mezcla de cadenas de DNA se separa de una en una mediante electroforesis. La electroforesis está conectada a un detector de fluorescencia que determina el ddntp que lleva cada fragmento, con lo que se obtiene la secuencia de nucleótidos de la cadena original. El método es semicuantitativo; puede distinguirse entre homocigoto y heterocigoto en ausencia de poblaciones heterogéneas. La sensibilidad obtenida es de alrededor del 20% [3-5,87,152] Pirosecuenciación Dicha técnica está basada en la detección de la bioluminiscencia de la reacción de la luciferasa. Se someten a pirosecuenciación los productos de una PCR realizada previamente. Los pirofosfonatos liberados por la incorporación de nucleótidos llevada a cabo por la polimerasa durante la síntesis de DNA in vitro son utilizados como fuente de ATP. Los nucleótidos específicos son adicionados mediante la reacción para determinar la secuencia de la hebra de DNA de interés. El método es adecuado para la determinación cuantitativa y puede distinguir entre homocigotos y heterocigotos de la mutación. Se estima que posee una sensibilidad del 5% [128,130,152]. 24

36 I. REVISIÓN DEL TEMA PCR alelo-específica Los métodos PCR alélo-específica (PCR-AS) son los más adecuados para realizar medidas cuantitativas en PCR a tiempo real [123]. Es un ensayo muy sensible (0,01-0,1%). Se emplea un oligonucleótido mutado para la amplificación de la secuencia, que es detectada posteriormente mediante electroforesis capilar. En otros procedimientos de AS-PCR se emplean dos parejas de cebadores que amplifican el gen normal y el gen mutado en una sola reacción. Con este sistema, llamado ARMS (Amplification Refractory Mutation System), se obtiene una sensibilidad del 1-2% [130,152,154]. En nuestro laboratorio se utiliza la técnica de la PCR a tiempo real alélo-específica por su alta sensibilidad (2%) y por su capacidad de determinar la carga alélica de células mutadas ya que, como se comenta posteriormente, puede ser un factor pronóstico, que determine decisiones terapéuticas y permitiría, además, evaluar la respuesta a un posible tratamiento. En el año 2009, se publicaron por la primera vez unos criterios de la respuesta molecular según ELN, valorados por la cuantificación de la carga alélica JAK2V617F [150]. 25

37 I. REVISIÓN DEL TEMA 7. Citogenética convencional Las alteraciones citogenéticas en NMP no son frecuentes ni específicas: aparecen aproximadamente en el 20% en la PV, menos de 5% en la TE y en el 40% de los pacientes con MFP. Las alteraciones más frecuentes incluyen la: del(20q), del(13q), +8, +9 y las alteraciones del cromosoma 1. Además, están descritas las alteraciones en los cromosomas 5 y 7 [97, ]. En un tercio de los pacientes con PV se observó la disomía uniparenteral del brazo corto del cromosoma 9 (9pUPD) lo que condujo al descubrimiento de la mutación JAK2 [5]. Según Campell et al, es posible, que la trisomía del cromosoma 9, +9p y del(20q) estén relacionadas con la mutación JAK2V617F [38]. No se ha encontrado un significado pronóstico a las alteraciones citogenéticas en la PV y en la TE [ ]. En cambio en la MFP el cariotipo anómalo parece asociarse a peor supervivencia, pero no se conoce la importancia de cada una de las alteraciones cromosómicas más frecuentes [16,156, ]. 26

38 I. REVISIÓN DEL TEMA 8. Alteraciones inmunológicas en NMP El reciente descubrimiento de la mutación puntual V617F en el gen JAK2, nos ayudó a entender la fisiopatogenia de las NMP. El gen JAK2 pertenece a la familia de Janus quinasas (JAK1, JAK3 y Tyk2) que intervienen en la cascada de transducción de señales intracelulares entre ellos señales cruciales en el desarrollo, proliferación y diferenciación de los linfocitos T. Las deficiencias de JAK1 y JAK2 resultan ser letales, la deficiencia de JAK3 cursa con ausencia de linfocitos T y NK y alteración de la función de linfocitos B; y la deficiencia de Tyk2 cursa con alteraciones en la respuesta pro-inflamatoria y el aumento en la respuesta Th2 [ ]. La mutación en JAK2V617F se ha descrito no solo en la serie mieloide sino también en subpoblaciones linfocitarias B, T y NK [ ], por ello parece razonable esperar que dicha mutación afecta de alguna manera a su número o función. Este aspecto no ha sido analizado hasta ahora en ninguna publicación. 27

39 II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 28

40 II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS 1. Justificación del trabajo Las NMP constituyen un grupo heterogéneo de patologías mieloproliferativas que cursan con diferentes presentaciones clínicas y analíticas, diferentes rasgos anatomopatológicos y precisan de diferentes tratamientos. Bajo el término de NMP se engloban, tanto patologías de baja agresividad (TE y PV) con supervivencia similar a la de población general como de mayor agresividad y peor pronóstico (MFP). Los criterios diagnósticos utilizados tradicionalmente se basaban en muchos criterios de exclusión y alguno de inclusión. El descubrimiento de las nuevas mutaciones en el gen JAK2 (V617F y en el exón 12) y en el gen MPL provocó la revisión de los criterios diagnósticos. En varios estudios se han observado claras diferencias analíticas y algunas clínicas y biológicas (citogenéticas) en los pacientes portadores de la mutación respecto a los que no presentan la mutación. Además se ha visto que en algunos casos la carga alélica varía con el tiempo y con el tratamiento. Aún no se sabe si gracias a la mutación JAK2V617F se puede cambiar la clasificación de las NMP o utilizar la mutación JAK2V617F como el factor pronóstico (seguimiento de la evolución de la enfermedad o de la respuesta al tratamiento). Actualmente la única indicación claramente establecida para el estudio de las mutaciones JAK2 (V617F y exón 12) y MPL es establecer un diagnóstico pero con la limitación de no ser una anomalía completamente específica de las NMP y sobre todo con la limitación de no estar presente en todos los casos. Tampoco se conoce si la presencia de la mutación JAK2V617F puede asociarse a alteraciones en la distribución de subpoblaciones linfocitarias (linfocitos T, B, NK y TNK) en enfermos con NMP. 29

41 2. Hipótesis de estudio II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS Tras la descripción de la mutación JAK2V617F en el año 2005, los criterios diagnósticos de las NMP fueron modificados. De esta forma, se introdujeron cambios en la clasificación WHO 2008 derivados del estudio de la de la mutación de este gen. La mutación JAK2V617F aparece de forma prácticamente constante en la PV. Sin embargo, sólo aparece en aproximadamente la mitad de los casos con TE y MFP. Es posible que las características clínicas y biológicas de la enfermedad incluyendo anomalías citogenéticas y subpoblaciones linfocitarias sean diferentes en pacientes portadores o no portadores de la mutación. Asimismo, la carga alélica de la mutación varía de unos pacientes a otros, siendo posible que a mayor carga alélica más sintomática sea la enfermedad. También se han descrito cambios en la carga alélica de JAK2V617F en el seguimiento de estos pacientes, lo cual sugiere una nueva utilidad del estudio de la mutación con fines de evaluación de la respuesta a los tratamiento y como marcador evolutivo. Como se ha mencionado, la mutación del JAK2V617F aparece en la mitad de los pacientes, habiéndose descrito otras dos mutaciones: JAK2-exon12 y c-mpl que, al igual que la mutación JAK2V617F, están jugando un papel en la etiopatogenia de las NMP. Se postula que las características biológicas y clínicas podrían ser diferentes en los portadores de estas mutaciones. 30

42 3. Objetivos del estudio II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS 3.1. Objetivo general Estudio de las características clínico-biológicas de la mutación JAK2V617F en los pacientes diagnosticados de NMP Objetivos específicos. Validar y comparar los criterios WHO 2008 en relación a los anteriores de 2001 para clasificar a los pacientes con NMP. Determinar si los pacientes con mutación JAK2V617F presentan características clínicobiológicas diferentes a los que no tienen la mutación. Determinar si la carga alélica de la mutación JAK2V617F se asocia a un fenotipo hematológico y clínico y si supone una mayor carga de la enfermedad. Investigar si el cambio de la carga alélica a lo largo del seguimiento comporta un cambio en las características clínico-evolutivas/pronósticas de los pacientes. Estudiar el interés diagnóstico y el significado clínico de nuevas mutaciones tales como JAK2-exón 12 y MPL en los pacientes diagnosticados de NMP JAK2V617F-neg. 31

43 III. MATERIAL Y MÉTODOS 32

44 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Muestra del estudio Se realiza el estudio de seguimiento (ambispectivo) de una cohorte de 183 pacientes con el diagnóstico clínico de NMP: PV (n=45; 24,6%), TE (n=128; 70%) y MFP (n=10; 5%). Los pacientes fueron atendidos de forma rutinaria en el Servicio de Hematología del Hospital Universitario de Santiago de Compostela. El diagnóstico de estos pacientes fue realizado en el período de tiempo comprendido entre el 15 de noviembre de 1975 hasta el día 31 de diciembre de 2008 y la recolección de los datos se realizó entre el 20 de enero de 2006 y el 31 de diciembre de Criterios de inclusión: Enfermos con la sospecha o diagnóstico de NMP tipo PV, TE o MPF según diagnóstico que consta en el informe el clínico, Acceso a los datos clínicos y analíticos de los pacientes tanto en el momento del diagnóstico como a lo largo del seguimiento. Determinación de la mutación JAK2V617F. Se excluyen del estudio a los pacientes con el diagnóstico de otras NMP distintas de las mencionadas, así como los síndromes mieloproliferativos/mielodisplásicos y con las sospechas de alteraciones analíticas reactivas. Este estudio se ajustó a los criterios de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de datos de su historia clínica como para la obtención, almacenamiento y estudio de muestras sanguíneas con los fines específicos de este estudio. Dicho estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia. 33

45 III. MATERIAL Y MÉTODOS 2. Metodología 2.1. Variables del estudio Todas las variables clínicas y analíticas fueron obtenidas de las historias clínicas, e incluye tanto datos al diagnóstico como evolutivos. Los datos se resumen en la Tabla 6 del apartado de resultados Variables clínicas Datos demográficos: edad y sexo Factores de riesgo cardio-vascular: tabaquismo, diabetes mellitus, hipertensión arterial, hiperlipemia, historia previa (máximo dos años antés del diagnóstico de la NMP) de trombosis Esplenomegalia: objetivada en el examen físico ó por pruebas de imagen Presencia de prurito Eventos vasculares: o Trombosis mayor (arterial y venosa): infarto cerebral y miocárdico, angina, trombosis arterial periférica, trombosis venosa profunda incluida la cerebral y trombosis de la vena esplénica, embolismo pulmonar. Se consideraron todos los que ocurrieron en los 2 años previos al diagnóstico y los que ocurrieron posteriormente o Hemorragia mayor: un descenso de la Hb de >= 2 g/dl, necesidad de transfusión de hematíes o de la intervención quirúrgica. Se recogieron tanto los eventos al diagnóstico como durante el seguimiento Progresión de la enfermedad: de una NMP a otra NMP o a LMA 34

46 III. MATERIAL Y MÉTODOS Tipo de tratamiento citorreductor Respuesta hematológica al tratamiento citorreductor según se ha definido por un grupo de expertos de ELN [150]: o En la TE: Respuesta hematológica completa (RCh): plaquetas < 400 x 10 9 /L y no síntomatología relacionada con la enfermedad (eventos microvasculares, prurito, cefalea) y bazo de tamaño normal (por pruebas de imagen) y cifra de leucocitos 10 x 10 9 /L Respuesta hematológica parcial (RPh): pacientes que no cumplen criterios para RC, plaquetas < 600 x 10 9 /L o descenso > 50% desde los valores iniciales Falta de respuesta: cualquier respuesta que no cumple los criterios de RP o En la PV: RCh: Hematocrito < 45% sin necesidad de flebotomía y plaquetas 400 x 10 9 /L y cifra de leucocitos 10 x 10 9 /L y bazo de tamaño normal (por pruebas de imagen) y no síntomatología relacionada con la enfermedad (eventos microvasculares, prurito, cefalea). RPh: no cumple criterios de RC pero Hematocrito < 45% sin necesidad de flebotomía o cumplimiento de 3 de otros criterios No respuesta (NR): cualquier respuesta que no cumple los criterios de RP Respuesta molecular al tratamiento citorreductor según ELN: 35

47 III. MATERIAL Y MÉTODOS o Respuesta genética completa (RCg): disminución de la alteración molecular (la carga alélica JAK2V617F) hasta su total desaparición o Respuesta genética parcial (RPg): Disminución 50% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor basal (si valor basal de JAK2V617F < 50%) Disminución 25% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor basal (si valor basal de JAK2V617F > 50%) o No respuesta (NRg): todos los cambios de la carga alélica JAK2V617F que no cumplan al menos criterios de RP Variables analíticas Hematimetría: valores de hemoglobina, leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos, plaquetas FAL leucocitaria Lactato deshidrogenasa sérica (LDH) Nivel de eritropoyetina sérica 2.2 Estudio de las mutaciones A todos los pacientes se les realizó una determinación cuantitativa de la mutación JAK2V617F. En 124 pacientes se realiza la determinación periódica de dicha mutación y la frecuencia del estudio depende de la accesibilidad a las muestras según visitas asistenciales y consentimiento de los pacientes. 36

48 III. MATERIAL Y MÉTODOS En algunos pacientes JAK2V617F-neg se realizó una determinación de mutación JAK2- exon12 (n=2) y c-mpl (n=45) (véase apartado 4 de metodología). 2.3 Estudio morfológico de médula ósea Se revisaron 146 (85%) cilindros de biopsia de médula ósea (BMO) y 109 (64%) muestras de aspirados medulares (AMO) de los pacientes incluidos al estudio. El análisis de la BMO fue realizado, en nuestro centro hospitalario, por un anatomopatólogo y la revisión del AMO por un hematólogo experto en citología, ambos sin conocimiento previo del diagnóstico ni de datos analíticos ni del estado mutacional de JAK2V617F. Se analizaron solamente las muestras extraídas al diagnóstico y previamente al inicio del tratamiento citorreductor. En el análisis de BMO se valoraron: celularidad total, cantidad de megacariocitos, sincitios y fibrosis; la serie eritroide y mieloide fueron analizados en AMO. Para la valoración de las muestras se utiliza una escala semicuantitativa previamente descrita [ ]: normal: 0, levemente aumentado 1+, moderamente aumentado 2+ y muy aumentado 3+. Finalmente, según los datos obtenidos, se emitió un diagnóstico confirmatorio o se excluyó el diagnóstico de la NMP. 37