MATERIALES Y MÉTODOS. Recolección de la Planta. Obtención del Extracto y Fracciones con Solventes

Transcripción

1 MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de la Planta Los especímenes de la especie Acalypha californica, fueron colectados a 1 Km al norte de la ciudad de Hermosillo, Sonora, en el cerro del Bachoco; y la autentificación fue realizada por el Ing. Jesús Sánchez, taxónomo responsable del herbario de la Universidad de Sonora. Obtención del Extracto y Fracciones con Solventes Preparación del Extracto Metanólico El extracto metanólico fue generado mediante la metodología propuesta por Alday y Espinoza (2008).El material vegetal colectado fue secado a temperatura ambiente y homogenizado a un tamaño de malla de 2 a 3 mm en un molino tipo Whiley. A una cantidad determinada del homogenizado se le adicionó metanol para su extracción (1:10 peso/volumen) y se mantuvo por 10 días a temperatura ambiente, con agitación periódica. Luego fue filtrado en gasa para eliminar partículas grandes y se realizó una segunda filtración usando papel Whatman No 2. Posteriormente, el extracto metanólico fue concentrado en un evaporador rotatorio (Yamato R-300) a 40 C bajo presión reducida. El extracto, así obtenido, se conservó en refrigeración (4ºC) para su posterior uso en los ensayos de actividad antiproliferativa y para su fraccionamiento. Fraccionamiento del Extracto Metanólico de Acalypha californica Mediante Solventes (Fracciones Químicas) Con la finalidad de agrupar los compuestos del extracto metanólico con base a su polaridad, se realizó el fraccionamiento de este mediante los solventes hexano (constante dieléctrica 1.9), acetato de etilo (6.0) y etanol (24.5).La primera fracción que se preparó fue la perteneciente al hexano, para esto aproximadamente 100 g del extracto metanólico de Acalypha californica se trataron con 400 ml de hexano manteniéndose en agitación por 10 horas, este procedimiento fue repetido cinco veces. La parte soluble se filtró 23

2 sobre papel y se concentró por medio del evaporador rotatorio (Yamato R-300) bajo las condiciones que se mencionaron anteriormente. La parte insoluble en hexano fue tratada con acetato de etilo, bajo la metodología descrita para así generar la fracción de acetato de etilo. La fracción insoluble en el solvente anterior se sometió al mismo procedimiento referido, pero utilizando como solvente etanol y generando la denominada fracción etanólica. La parte insoluble en etanol fue etiquetada como fracción residual o residuo metanólico. Actividad Antiproliferativa del Extracto Metanólico de Acalypha californica y de sus Fracciones Químicas Líneas Celulares La evaluación de la actividad antiproliferativa se realizó utilizando como modelo las líneas celulares L-929 (tejido subcutáneo conectivo normal de ratón), M12.A k.c3f6 (linfoma de células B de ratón), HeLa (cáncer cérvico-uterino de humano) y RAW (macrófagos transformados por el virus de la leucemia de Abelson). Los cultivos se mantuvieron en medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado al 5% con suero fetal bovino de SIGMA, inactivado mediante calentamiento. Las líneas celulares fueron incubadas a temperatura de 37 C, en una atmósfera de 5% de CO 2 y una humedad relativa del 80-90% en un equipo Isoterm (Fisher Scientific ) (Acosta, 2007). Evaluación de la Proliferación Celular Debido a que se reportó que el extracto metanólico de Acalypha californica posee la capacidad de reducir la sal MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)2,5-bromuro difeniltetrazolio), se utilizaron dos métodos, previamente comparados, para evaluar la viabilidad de las células y, por ende, la actividad antiproliferativa del extracto metanólico y sus fracciones (Rascón, 2009). Medición del tamaño y granularidad celular por citometría de flujo. Morfológicamente, el rápido encogimiento de las células y la disminución de su granularidad en los estadios finales son los cambios más obvios asociados con la 24

3 apoptosis. Estos cambios pueden permitir distinguir las poblaciones de células viables y apoptóticas, basados en las propiedades de dispersión de la luz medidas por citometría de flujo. De esta forma, la evaluación de la actividad del extracto metanólico de Acalypha californica y sus fracciones con distintos solventes sobre la proliferación de la línea celular M12.A k.c3.f6, se realizó mediante citometría de flujo. En una placa de 48 pozos fueron adicionados 500 L de una suspensión celular ajustada a 200,000 células/ ml, posteriormente estos cultivos fueron incubados por 24 horas en una atmósfera de 37 C y 5% de CO 2. Después fueron adicionados 500 L de medio con extracto para dar las concentraciones finales de 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 g/ml y se incubaron por 48 horas. Los extractos estaban disueltos en DMSO a una concentración de 40 mg/ml por lo que los cultivos control contenían DMSO a las cantidades utilizadas para disolver los extractos a esas concentraciones. Transcurrido el período de incubación, las células fueron resuspendidas y colocadas en tubos de polipropileno, previo filtración mediante organza. Posteriormente los tubos con las células fueron centrifugados por 5 minutos a 700 x g a 4 C; el sobrenadante fue descartado y se resuspendió el sedimento en PBA (PBS + 2% SFB + 0.1% azida de sodio). Se realizaron, así, dos lavados. Finalmente, las células fueron resuspendidas en 150 L de D5F y 150 L de paraformaldehído al 2% para realizar la adquisición de las mismas en el citómetro de flujo (FACS Canto II; BD Systems ). Los parámetros analizados fueron tamaño y complejidad celular, el encogimiento celular resulta en un decremento en la dispersión frontal de la luz y la condensación nuclear causa un incremento transitorio en el ángulo de la dispersión lateral, seguido por una reducción en este parámetro durante las etapas finales de la apoptosis, determinando de esta forma las poblaciones viables y no viables (Rascón, 2009). Ensayo de reducción del MTT. Para evaluar el efecto del extracto metanólico de Acalypha californica y sus fracciones químicas sobre la proliferación de las líneas celulares L-929, HeLa y RAW se utilizó el método de reducción del MTT. 25

4 Brevemente, 50 µl de una suspensión celular ajustada a 200,000 células/ml fueron colocados en cada uno de los pozos de una placa de 96 pozos. Se incubó por un período de 24 horas a 37 C en una atmósfera al 5% de CO 2, para permitir la adhesión de las células. El extracto metanólico y sus fracciones fueron disueltos en DMSO, el cual se utilizó en los cultivos control, y luego diluidos en DMEM suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivado por calor (D5F), para generar diluciones seriadas con las concentraciones finales desde g/ml, así pues se les adicionó 50 L de estas diluciones a los cultivos (cada concentración por triplicado). Los cultivos fueron incubados por 44 horas y se restituyó el medio por medio fresco. 10 L de solución de MTT (5 mg/ml) fueron añadidos a cada uno de los pozos y se incubaron, a las condiciones ya referidas, por 4 horas más. Los cristales de formazan que se formaron fueron disueltos con 2-propanol ácido, y la absorbancia de los cultivos fueron leídas en un lector de ELISA (Bench-mark Microplate Reader, Bio Rad ) usando una longitud de onda prueba de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 655 nm (Modificado de Bruggisser, 2002). Análisis estadístico. Los datos fueron expresados como la media ± la desviación estándar de tres mediciones paralelas, se utilizó el software Graph Pad Prism versión 5.0 para Windows (Graph Pad Sofware, San Diego California, USA). La concentración inhibitoria del 50% (IC 50 ) fue calculada mediante un análisis de regresión no lineal (Graph Pad Prism 5.0) obtenida graficando el logaritmo de la dosis aplicada contra el porcentaje de viabilidad o inhibición de las células. El porcentaje de inhibición fue calculado como:. Fraccionamiento y Perfil Químico de las Fracciones Químicas del Extracto Metanólico de Acalypha californica Los estudios que se indican a continuación fueron realizados en el laboratorio de fitoquímica del Instituto de Química de la Universidad Estadual Paulista Júlio de 26

5 Mesquita Filho, en la ciudad de Araraquara, Brasil; bajo la dirección del Dr. Wagner Vilegas y la Dra. Aline Coqueiro. Materiales, Equipos Básicos y Solventes Para la remoción de contaminantes, los matraces volumétricos, viales y demás vidriería utilizada en los experimentos, fueron lavados con una solución de Extran (Merck ) al 3% (v/v), posteriormente el material fue enjuagado con agua destilada y secado en estufa (Marconi, MA 033) a 50 C. Se utilizaron las balanzas Bioprecisa FA2104 (capacidad de 200g y precisión de 0.1 mg) y Libror AEG-45SM (Schimadzu ) (capacidad de 45g y precisión de 0.01mg). Las fracciones cromatográficas fueron concentradas en un evaporador rotatorio Laborota 4000-efficient (Heidolph ), con sistema de refrigeración (Solab ) y bomba de vacío con condensador secundario. Para la disolución de las fracciones fue utilizado un baño ultrasónico SoniClean 2PS Sanders, con frecuencia de 40 khz. Acetonitrilo, metanol de grado HPLC (Tedia ) y agua ultra pura obtenida de sistema Milli-Q Plus fueron utilizados en la preparación de muestras y eluciones de cromatografía líquida de alta resolución. El resto de los solventes citados en el trabajo son de grado analítico. Cromatografía de Adsorción Con la finalidad de obtener compuestos o grupos de compuestos con actividad antiproliferativa para su posterior caracterización química, la fracción química del extracto metanólico de Acalypha californica que presentó mayor actividad se fraccionó mediante cromatografía en columna de gravedad (38cm de altura y 2 cm de diámetro), utilizando como fase estacionaria sílica gel de malla ( mm), empacando 135 g de sílica y 1.7 g de muestra, y como fase móvil acetato de etilo, 27

6 posteriormente un gradiente de este con metanol y finalmente mezclas de metanol y agua en distintas proporciones. Las subfracciones fueron colectadas cada 250 ml, con un flujo de solvente aproximado a 8 ml/min, procediendo posteriormente a la evaporación del disolvente. La purificación fue monitorizada mediante cromatografía en capa fina, utilizando cromatofolios de sílica gel los cuales se observaron con una lámpara de UV a 254 y 365 nm y se revelaron mediante una solución de sulfato cérico. Cromatografía en Capa Fina : Prospección Preliminar Para realizar una prospección preliminar de la clase de metabolitos contenidos en las fracciones químicas (fracciones de solventes) del extracto metanólico de Acalypha californica, se llevaron a cabo ensayos de cromatografía en capa fina con el uso de agentes reveladores específicos. Las muestras fueron aplicadas en cromatofolios de sílica gel 60 PF 254 (Merck ) (5 cm de altura y 0.5 cm de separación entre cada muestra) y eluidas con el sistema de solventes adecuado a la naturaleza de la muestra. Las cromatoplacas fueron expuestas a la irradiación de luz ultravioleta con 254 y 366 nm; como revelador general se utilizó anisaldehído sulfúrico. Para taninos se nebulizó la placa con cloruro férrico. Para la detección de alcaloides se utilizó el reactivo de Dragendorff y como revelador para esteroides/triterpenoides se utilizó el reactivo de Lieberman- Burchard. Las placas nebulizadas se sometieron a calentamiento en estufa (Quimis ) a 50 C por 3 minutos. Extracción en Fase Sólida Cartuchos de extracción en fase sólida (SPE) fase reversa a base de octadecilsilano (RP18 ) con 500 mg, 6 ml -1 (33µm, Supelco ) o de fase normal (SiO 2 ) 360 mg (55 µm, Classic Waters ) fueron utilizadas en las etapas de limpieza de las fracciones, las soluciones obtenidas del este proceso fueron filtradas en una membrana de PTFE 28

7 (politetrafluoroetileno, teflon, Millipore ) con poro de 0.45 o 0.20 µm para análisis posteriores (HPLC, espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear). En la etapa de extracción en fase sólida de las fracciones, 1mg de la muestra para cada 10mg de la fase de RP18 o SiO 2 fue aplicada en los cartuchos de SPE. En RP18, el cartucho fue previamente activado con metanol (4 ml) y después acondicionado con agua (5 ml). El material a ser aplicado en el soporte de SPE fue previamente solubilizado en aproximadamente 0.5 ml de metanol, con auxilio del baño ultrasónico, siendo posteriormente adicionados 2 ml de agua. La elución en los soportes de RP18 obedeció el siguiente orden general: metanol/agua 2:8 v/v, metanol/agua 1:1 v/v, y metanol. En SiO 2, el cartucho fue acondicionado con cloroformo y luego con hexano (4 ml). La muestra fue disuelta en hexano con auxilio del baño ultrasónico. La elución fue realizada en el orden: hexano, hexano/acetato de etilo 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30 y acetato de etilo. En ambas extracciones se colectaron alícuotas de 15 ml para cada composición del eluyente empleado para la desorción de los analitos (Modificado de Rodrigues,2007). Cromatografía de Exclusión Molecular Para la separación de la fracción de etanol, se hizo uso de la cromotografía de exclusión molecular, donde se utilizó una columna de vidrio de 80 cm de altura por 2 cm de diámetro interno (d.i) empacada con sephadex LH-20 (Pharmacia ). Preparación de la muestra. La cantidad de muestra que se aplicó en la columna fue de entre 3-4 g, ésta se disolvió en 15 ml del solvente o mezcla de solventes con la cual la columna fue empaquetada y con la que se inició la elución, esto con auxilio del baño ultrasónico. Una vez disuelta, la muestra fue centrifugada dos veces por 10 minutos (Centrifuga Combate ). El precipitado fue descartado y el sobrenadante fue aplicado en la columna, con el retiro previo del solvente en exceso de la columna; una vez que la muestra se encontró dentro de la matriz de sephadex 15 ml del solvente de elución 29

8 fueron añadidos. Finalmente, una bomba peristáltica (Pharmacia ) fue conectada a la columna para el abastecimiento de solvente con un flujo de 0.5 ml por minuto. Elución de analitos. Para la separación de la fracción de etanol 3g de ella fueron aplicados en la columna, como fase móvil se utilizó el siguiente gradiente: Agua/metanol 8:2, agua/metanol 1:1 y metanol. En tanto que la fracción de hexanoacetato de etilo se eluyó con n-hexano/cloroformo/metanol 2:2:1, cloroformo/metanol 1:1 y metanol; 3.5 g de esta muestra fueron aplicados en la columna. El solvente fue bombeado hacia la columna con auxilio de una bomba peristáltica. Se colectaron 5 ml (300 gotas) para cada fracción en un colector automático Redifrac (Pharmacia). La purificación fue seguida por ensayos de cromatografía en capa fina, utilizando cromatofolios de sílica gel P 254 (Merck ) los cuales se visualizaron bajo luz ultravioleta con de 254 y 366 nm, y se revelaron con solución de anisaldehído sulfúrico. Perfil Químico de las Fracciones por Cromatografía Líquida de Alta Resolución Para generar el perfil químico de las fracciones etanólica y residual se trabajó con cromatografía líquida de alta resolución, la cual se efectuó en un cromatógrafo analítico (gradiente cuaternario, modelo PU-2089 Jasco ) acoplado a un detector de arreglo de diodos con una barredura de nm e intervalo mínimo de 1nm (modelo MD-2010, Jasco ). Fueron utilizadas columnas de fase reversa RP18 inmovilizadas con octadecilsilano, modelos Luna 2 (Phenomenex ) de 250 x 4.6 mm, con un tamaño medio de partícula de 5µm; así como Synergi Hydro (Phenomenex ) de 250 x 4.6 mm d.i, 4µ m, ambos con precolumna (Phenomenex ) de 4 x 3 mm d.i. Para la separación de los constituyentes químicos de las fracciones ya mencionadas, se utilizó un gradiente exploratorio de elución, teniendo como fase móvil A. Agua con 0.1% TFA y B. Metanol, el flujo fue de 1 ml/min iniciando con 5% de B, posteriormente se generó el gradiente hasta alcanzar 100% de B en 60 minutos. 30

9 El software EZChrom Elite Client/Server versión (Chromatec ) fue utilizado durante la adquisición de los datos cromatográficos, así como para el análisis de los mismos. Cromatografía Líquida de Media Presión La separación de los compuestos de las fracciones de sephadex generadas de la fracción hexano-acetato de etilo se realizó mediante cromatografía líquida de media presión (MPLC), la cual se efectuó en un equipo Gradient Flash System (Büchi ) con una unidad de control (Büchi Pump Manager C-615) acoplada a dos módulos de bombeo (Büchi Pump Module C-601) lo que permitió la concentración binaria de solventes. Se utilizó una columna de propileno de 150 x 12 mm (Büchi ) empacada con sílica gel de 200 mesh. Brevemente, 400 mg de las fracciones se diluyeron en 4 ml de cloroformo y se mezclaron con 200 mg de sílica gel, una vez que el cloroformo se evaporó completamente, se colocó la mezcla en la columna previamente humedecida. El gradiente de elución utilizado fue el siguiente: hexano, hexano /acetato de etilo 9:1, 7:3,1:1, 3:7 v/v, acetato de etilo, acetato de etilo/metanol 8:2. El gradiente fue abastecido con un flujo de 2.5 ml/min. Las fracciones fueron colectadas cada minuto por un colector automático (Fraction Collector DC-1200, Eyela ). La purificación se monitorizó en cromatofolios de sílica gel, los cuales fueron revelados con solución de anisaldehído sulfúrico. Caracterización de Compuestos Estos análisis fueron llevados a cabo en los laboratorios de Química Orgánica del Instituto de Química de la Universidad Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, campus Araraquara, Brasil. 31

10 Espectrometría de Masas Para generar los espectros de masas de las fracciones del extracto se empleó un espectrómetro de masas LCQ Deca (ESI-IT-MS) (Thermo Finnigan ) equipado con un dispositivo de inyección directa de la muestra vía análisis por inyección de flujo continuo. Las matrices estudiadas fueron analizadas en modo de ionización por electrospray (ESI) y las fragmentaciones en múltiples estadios (MS 2, MS 3,MS n ) realizados en una interface de tipo trampa de iones (IT). Se trabajó tanto en modo positivo como negativo para la generación de los espectros de masas en los múltiples estadios, utilizándose como gas de arrastre N 2. El intervalo de adquisición fue de m/z y se realizaron 2 o más eventos de barrido de manera simultánea. El primero de los eventos corresponde a un barrido completo del espectro de masas con la finalidad de adquirir los datos de los iones en el intervalo m/z establecido. El resto de los eventos fueron experimentos en múltiples estadios realizados a partir de los datos del primer barrido para iones precursores seleccionados. La energía de colisión utilizada en los eventos MS n fue entre el 25 y 30% de la energía total del instrumento. Para la adquisición y análisis de los datos de los espectro de masas se utilizó el software Xcalibur versión 1.3 (Thermo Finingan ) (Modificado de Rodrigues, 2007). Resonancia Magnética Nuclear Los experimentos de RMN 1 H- y RMN 13 C- fueron realizados en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de 11.7 T (Varian INOVA), operando en 500 MHz para RMN 1 H- y en 125 MHz para RMN 13 C-. Los solventes utilizados en la disolución de las muestras para la obtención de los espectros fueron D 2 O, CDCl 3 y CD 3 OD (Sigma Aldrich ) con pureza 99.8%. Los desplazamientos químicos fueron dados en (ppm) usando como referencia interna el solvente residual no deuterado H 2 O, CHCl 3 y CH 3 OH en 4.68, 7.2 y 3.3 respectivamente, o tetrametilsilano (TMS) en 0. 32