INFORME FINAL ACTIVIDAD SUPRESORA DE LAS CÉLULAS REGULADORAS T CD4+CD25+ EN LAS ESPONDILOARTROPATÍAS

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1 INFORME FINAL ACTIVIDAD SUPRESORA DE LAS CÉLULAS REGULADORAS T CD4+CD25+ EN LAS ESPONDILOARTROPATÍAS REGISTRO SIP DIRECTOR DE PROYECTO: DRA. ETHEL AWILDA GARCIA LATORRE RESUMEN Las células T reguladoras naturales CD4+CD25+FoxP3+ están implicadas en procesos inflamatorios de pacientes con espondiloartropatías similar a lo reportado para artritis reumatoide. Nosotros hemos demostrado que ambos grupos de pacientes presentan un aumento significativo de éstas células en muestras de líquido sinovial en comparación con su muestra pareada de sangre periférica, y que los niveles de estas células reguladoras en sangre, de ambos tipos de pacientes, son iguales a los de los sujetos sanos. Es importante determinar la actividad supresora de estas células en los pacientes pero es necesario estandarizar la metodología. El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad supresora de las células T reguladoras naturales en muestras de sangre periférica de sujetos sanos. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de sujetos sanos mediante gradiente de centrifugación con Ficoll-Paque, de éstas se separaron y purificaron las poblaciones celulares efectoras TCD4+CD25- y las reguladoras TCD4+CD25+ bright por columnas magnéticas (MACS) y se analizaron por citometría de flujo. Se co-cultivaron las células en placas de 96 pozos en U y se estimularon con perlas magnéticas (anti-cd3, anti-cd28). Se utilizaron como testigo de proliferación positiva y negativa a las T efectoras o a las reguladoras, respectivamente. La actividad supresora de las células T reguladoras en co-cultivos se determinó midiendo la proliferación celular mediante la incorporación de timidina tritiada. Los resultados demuestran que de acuerdo al análisis por citometría de flujo, la purificación de las poblaciones celulares por el método de columnas magnéticas es mayor al 90%. Las células T CD4+CD25+ bright no proliferaron frente al estimulo mientras que las efectoras si lo hicieron. En co-cultivos 1:1 de células T efectoras con T reguladoras, la proliferación celular disminuyó significativamente con respecto al cultivo de células T efectoras solas. En conclusión los resultados indican que este método se puede aplicar al estudio de la actividad supresora de las T reguladoras naturales. INTRODUCCIÓN Los linfocitos T CD4+CD25+ son células reguladoras naturales que se generan en el timo y constituyen del 5% al 10% de la población de células T CD4+ de

2 sangre periférica (Kronenberg y Rudensky 2005); se ha demostrado que controlan a células auto-reactivas mediante el contacto célula a célula; expresan la cadena alfa del receptor de alta afinidad para IL-2 (IL-2R), conocido como CD25, y el factor de transcripción FoxP3+; son anérgicas y no proliferan in vitro. (Roncador y col 2005, Sakaguchi 2005). La disminución en la población de células CD4+CD25+ Treg naturales o una atenuación en su actividad supresora puede conducir a autoinmunidad, inmunopatología o alergia; en contraste, un incremento en el número de células Treg o aumento en su actividad supresora puede llevar a la incapacidad de responder a agentes infecciosos o a la eliminación de células tumorales. (Sakaguchi 2005). Las espondiloartropatías (SpA) son un grupo de enfermedades crónicodegenerativas, que presentan una carga genética asociada al antígeno HLAB27, sin embargo no se ha determinado su naturaleza autoinmune. (Burgos-Vargas 2002, Weisman y col 2006). En nuestro grupo de trabajo hemos estudiado la participación de las células T reguladoras naturales en el desarrollo de las espondiloartropatías, y se ha demostrado que los porcentajes de éstas células evidencian un aumento significativo en muestras de líquido sinovial con respecto a su muestra pareada de sangre periférica, lo cual nos lleva suponer que las células T reguladoras naturales tienen una participación directa en este proceso (Vega-Rendón C 2007). Es importante determinar la actividad supresora de estas células pero es necesario estandarizar el método con muestras de sujetos sanos. En este proyecto nos propusimos evaluar la función supresora de las células T reguladoras, midiendo la proliferación de las células T efectoras activadas en un sistema de co-cultivo en muestras de sangre periférica de sujetos sanos. HIPÓTESIS: La actividad supresora de las células T reguladoras naturales en muestras de sangre periférica de sujetos se puede determinar en co-cultivos mediante la incorporación de timidina tritiada. General: OBJETIVOS Determinar la actividad supresora de las células T reguladoras naturales en muestras de sangre periférica de sujetos sanos. Específicos:

3 Obtener y purificar las poblaciones de células T CD4+CD25- y células T CD4+CD25+bright del total de células mononucleares de sangre periférica en sujetos sanos. Determinar la actividad supresora de las células T reguladoras naturales en muestras de sangre periférica de sujetos sanos. MATERIAL Y MÉTODOS MUESTRAS BIOLÓGICAS. Se analizaron 9 muestras de sangre periférica de sujetos sanos. MÉTODOS 1. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante centrifugación por gradiente de densidad con Ficoll-Paque 2. Se purificaron las poblaciones celulares TCD4+CD25- y TCD4+CD25+bright por columnas magnéticas (MACS). La separación magnética se dio en dos pasos: primero, la selección de los linfocitos T CD4+ se logró por la adición a las CMSP, previamente purificadas, de un anticuerpo anti-cd4 seguido de la separación en una columna magnética MACS (Miltenyi Biotec). De esta forma se obtienen únicamente las células CD4+. En un segundo paso, a estas células CD4+ se le adicionaron 10μL de microperlas CD25+bright, y se logró la separación en la columna magnética MACS. En este paso se colectaron las células no marcadas (CD4+CD25-), que salen en la primera pasada por la columna y la fracción de células T reguladoras CD4+CD25+bright marcadas que salen al presionar con mayor fuerza al émbolo. Para comprobar la estandarización del método de separación se llevó a cabo la tinción de los marcadores de cada población celular con anticuerpos fluorescentes anti-cd4 FITC y anti-cd25 PE; y posteriormente se adquirieron 15,000 eventos de cada muestra en el programa CellQuest del citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). 4. Determinación de la actividad supresora Estandarización de la medición de la proliferación celular por el método de incorporación de timidina tritiada. Se utilizaron muestras de sangre periférica de sujetos sanos, las cuales fueron procesadas como se describió anteriormente para obtener dos poblaciones celulares: linfocitos T CD4+CD25- (T efectoras) y linfocitos T CD4+CD25+bright (T reguladoras naturales). Se contaron las células en cámara de Neubauer.

4 Se utilizaron placas estériles de 96 pozos con fondo redondo (Nunc). Los ensayos se realizaron por triplicado, colocando en cada pozo la misma cantidad de células reguladoras y respondedoras por experimento. Cada una de las poblaciones de células T (CD4+CD25- y CD4+CD25+bright ) se estimularon con 10 µl de perlas de activación (CD3,CD28) (Miltenyi Biotec), en una proporción de 1:2; esto es una perla por cada 2 células, conforme a las instrucciones del fabricante. Las placas se incubaron a 37 C en atmósfera húmeda con 5.0% de CO 2, durante 60 horas, al cabo de las cuales se pulsó cada pozo con 10 µc de timidina tritiada, permitiendo su incorporación durante 16 horas. Las células fueron colocadas en la placa de acuerdo al siguiente esquema: * Células T CD4+CD25- sin estímulo. * Células T CD4+CD25- con estímulo. * Células T CD4+CD25+ sin estímulo. * Células T CD4+CD25+ con estímulo. * Cocultivo 1:1 de ambas poblaciones celulares, T CD4+CD25+ y TCD4+CD25- sin estímulo. * Cocultivo 1:1 de ambas poblaciones celulares, T CD4+CD25+ y TCD4+CD25- con estímulo. Las células se cosecharon en un equipo apropiado para ello sobre papel de fibra de vidrio, después de secos los papeles se cortaron y los pedacitos de papel se colocaron en viales con líquido de centelleo (PPO 5 g [2,5-diphenil oxazole], POPOP 0.2g [1,4-bis, 5-phenyl-2-oxazolyl- benzene; 2,2 -pphenylene-bis [5-phenyloxazole]], en un litro de tolueno). La incorporación de la timidina se determinó en un contador de centelleo (Beckman LS 6000 IC). Los índices de estimulación en cada caso se obtuvieron al dividir el promedio de las cuentas por minuto (cpm) de los tres pozos con estímulo entre el promedio de las cpm de los tres pozos sin estímulo, se consideró linfoproliferación positiva cuando los índices de estimulación eran a 3.0.

5 RESULTADOS Purificación de las poblaciones celulares TCD4+CD25- y TCD4+CD25+bright por columnas magnéticas (MACS). En las figuras que se muestran a continuación se ilustran los resultados de un ejemplo representativo de las ocho muestras biológicas de sujetos sanos que se estudiaron. En la figura 1 se muestra el análisis por citometría de flujo de las células mononucleares obtenidas de la separación por Ficoll-Paque antes de pasarlas por las columnas magnéticas. Se marca la región R1 que corresponde a la población de linfocitos de acuerdo a su tamaño y granularidad. COLUMNA2.001 R TAMANO Figura 1. Análisis por citometría de flujo de la población de linfocitos totales obtenidos por centrifugación en Ficoll-Paque. La región R1 indica a la población de linfocitos totales que se identifican por su tamaño y granularidad a partir del paquete de células mononucleares de sangre periférica obtenido por centrifugación en Ficoll- Paque

6 En la figura 2 se ilustra la pureza de la población de linfocitos T CD4+ obtenidos después de la purificación en la primera columna de separación. Se observa en la gráfica de puntos la población de interés y en el histograma correspondiente la pureza de la población CD4+. A) B) COLUMNA2.002 COLUMNA2.002 M2 R1 M1 CD3 PerCP CD4 FITC Histogram Statistics File: COLUMNA2.002 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #1 Panel: CLAUDIA Gate: G1 Gated Events: Total Events: X Parameter: CD4 FITC (Log) Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median All 1, M1 3, M2 41, Figura 2. Análisis por citometría de flujo en donde se muestra la pureza de la población de linfocitos T CD4+. En A) se muestra la gráfica de puntos donde se señala con un círculo la región R1 que define a los linfocitos T CD4+ de acuerdo a su granularidad y a la presencia de la molécula CD3 en su superficie. En B) se muestra el histograma correspondiente a la región R1 en donde se observa la homogeneidad de la población de linfocitos T CD4+.

7 En la figura 3 se ilustra la pureza de la población de linfocitos T CD4+ después del primer paso por la columna de separación y la presencia de las dos poblaciones CD25+ y CD25 en la muestra. A COLUMNA2.002 Quadrant Statistics CD4 FITC File: COLUMNA2.002 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #1 Panel: CLAUDIA Gate: G1 Gated Events: Total Events: X Parameter: CD4 FITC (Log) Y Parameter: CD3 PerCP (Log) Quad Location: 10, 12 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL *** *** *** *** LR *** *** *** *** B COLUMNA2.002 CD4 FITC Quadrant Statistics File: COLUMNA2.002 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #1 Panel: CLAUDIA Gate: G1 Gated Events: Total Events: X Parameter: CD4 FITC (Log) Y Parameter: CD25 PE (Log) Quad Location: 10, 12 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Figura 3. Análisis por citometría de flujo de la pureza de la población de linfocitos TCD4+ obtenidos en la primera columna de separación. A) En esta gráfica de puntos se observa la pureza de la población de linfocitos TCD3+CD4+ totales obtenidos de la primer columna. B) Gráfica de puntos donde se observan las poblaciones T CD4+CD25+ (cuadrante superior derecha) y CD4+CD25- (cuadrante inferior derecha) en la población purificada de linfocitos T CD4+.

8 En la figura 4 se muestra un ejemplo de la pureza de las poblaciones de Linfocitos TCD4+CD25+ y TCD4+CD2- obtenidas después de la separación en la segunda columna. A. COLUMNA2.003 Quadrant Statistics CD4 FITC File: COLUMNA2.003 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #2 Panel: CLAUDIA Gate: G1 Gated Events: Total Events: X Parameter: CD4 FITC (Log) Y Parameter: CD25 PE (Log) Quad Location: 10, 12 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR B. COLUMNA2.001 Quadrant Statistics CD4 FITC File: COLUMNA2.001 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #3 Panel: CLAUDIA Gate: G1 Gated Events: 5647 Total Events: X Parameter: CD4 FITC (Log) Y Parameter: CD25 PE (Log) Quad Location: 14, 9 Quad Events % Gated % Tota X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Figura 4. Pureza de las dos poblaciones de interés determinadas por citometría de flujo. A) Linfocitos T CD4+CD25- (cuadrante Inferior derecha) y B) linfocitos T CD4+CD25+ (cuadrante superior derecha) después de la segunda purificación en las columnas magnéticas.

9 Medición de la proliferación por el método de timidina tritiada. En ocho muestras de pacientes se purificaron las poblaciones T CD4+CD25+ y T CD4+CD25- como se ilustró en los ejemplos de las figuras 1-4. Para estudiar la actividad supresora de las células T CD4+ CD25+ sobre las células respondedoras T CD4+CD25- se determinó la activación de las células T CD4+CD25- por el mitógeno y la actividad supresora de las células TCD4+CD25+ por medio de la incorporación de timidina tritiada. En la figura 5 se muestra el promedio de las ocho muestras analizadas expresadas en cuentas por minuto (cpm). Cada barra representa el promedio de cpm de las diferentes condiciones experimentales. También se muestra el error estándar en cada caso CPM CD4+CD25- con estimulo CD4+CD25- sin estímulo CD4+CD25+ CD4+CD25+ con estimulo sin estimulo CÉLULAS 1:1 reg/efec con estimulo 1:1 reg/efec sin estimulo Figura 5. Promedio de cuentas por minuto de cada población en estudio. Cada barra representa lo siguiente: Células T CD4+CD25- con y sin estímulo; células T CD4+CD25+ con y sin estímulo y cocultivos 1:1 (CD4+CD25+:CD4+CD25+) con y sin estímulo..

10 En la figura 8 se grafican los índices de proliferación obtenidos en los cocultivos de células respondedoras con células supresoras en presencia del estímulo mitogénico y de las poblaciones por separado con el estímulo mitogénico. Los resultados nos indican que las células respondedoras solas presentan un índice de estimulación de 4.8. las células supresoras responden muy poco con un índice de y en el co-cultivo el índice es de Estos resultados nos indican que las células supresoras inhiben la actividad proliferativa de las células efectoras en aproximadamente un 50%. 6 ÍNDICE DE PROLIFERACIÓN Células TCD4+CD25- Cocultivo 1:1 Células TCD4+CD25+ CÉLULAS Figura 8. Promedio del Índice de proliferación celular en las diferentes condiciones experimentales. Cada barra representa: células T CD4+CD25-, cocultivos 1:1 (CD4+CD25+:CD4+CD25+) y células T CD4+CD25+, respectivamente. CONCLUSIONES Las columnas magnéticas empleadas permitieron obtener poblaciones funcionales de células T reguladoras y de células T efectoras con alto grado de pureza El método de incorporación de timidina tritiada empleado para medir la actividad proliferativa de las células T efectoras puras frente a un estímulo mitogénico permitió demostrar la actividad supresora de las células T reguladoras puras sobre estas células T efectoras. La técnica diseñada permitirá hacer estudios semejantes en otros sistemas.

11 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Burgos Vargas R 2002, Contribuciones de la reumatología mexicana al área de las espondiloartropatías, Rev Mex Reumatol 17: Kronenberg M, Rudensky A Regulation of immunity by selfreactive T cell. Nature 435: Roncador G, Brown PJ, Maestre L, Hue S, Martínez-Torrecuadra JL, Ling KL Prtap S, Toms C, Fox BC, Cerundolo V, Powrie F, Banham AH Analysis of FOXP3 protein expression in human CD4+CD25+ regulatory cells at the single-cell level. Eur J Immunol 35: Sakaguchi S Naturally arising Foxp3 expressing CD25+CD4+regulatory cell in immunological tolerance to self and non self. Nat Immunol 6: Vega-Rendón, C Determinación de linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ en sangre periférica y líquido sinovial de pacientes con espondiloartropatías. Tesis de Maestría en Ciencias Quimicobiológicas, ENCB, IPN Weisman MH, Reveille JD, Heijde DVD Ankylosing spondylitis and the spondyloarthropathies. Mosby Elsevier. 1 edición. pp 1-29.