Procesamiento de imágenes biomédicas para el estudio de la influencia de la radiación electromagnética GSM sobre células madre neurales

Transcripción

1 Procesamiento de imágenes biomédicas para e estudio de a infuencia de a radiación eectromagnética GSM sobre céuas madre neuraes Caros Patero 1 Escuea Universitaria de Ingeniería Técnica Industria (UPM), c/ Ronda de Vaencia,, 801 Madrid 1, cpatero@eai.upm.es Ángees Trio, Aejandro Úbeda Servicio de Bioeectromagnetismo Investigación, Hospita Ramón y Caja, 804 Madrid, angees.trio@hrc.es, aejandro.ubeda@hrc.es Resumen Este trabajo describe un sistema de procesamiento de imágenes digitaes para a enumeración de núceos de céuas madre neuraes. E principa objetivo es contar e número de núceos ceuares en una imagen, proveniente de microscopio, y cuántos de eos contienen una determinada proteína receptora, R1, en su citopasma. Con este fin se ha diseñado un conjunto de agoritmos para una eficiente segmentación de as céuas. Transformaciones no ineaes en as imágenes de coor junto a técnicas de descomposición de histograma en distribuciones cuasi normaes marcan a etapa de preprocesado y umbraización. E postprocesado exige un tratamiento morfoógico con eementos estructurantes en forma ovaada. Además, para resover e probema de soapamiento de os núceos se ha empeado información de os contornos ceuares que ha mejorado os resutados de tradiciona agoritmo watershed, ampiamente utiizado en e soapamiento de as céuas. Paabras Cave: Procesamiento de coor. Umbraización automática. Segmentación de núceos ceuares. 1 INTRODUCCIÓN En a controversia sobre os posibes efectos adversos de a exposición ambienta a microondas de uso en a teefonía móvi, e aspecto sanitario de mayor interés es, con diferencia, e de os potenciaes efectos cancerígenos de estas señaes. En a determinación de potencia carcinógeno de as emisiones de teefonía móvi, os estudios in vitro sobre céuas potenciamente sensibes son cruciaes para a identificación de os mecanismos de a respuesta ceuar. E presente estudio describe e desarroo de un agoritmo capaz de vaorar potenciaes respuestas ceuares reacionadas con e proceso cancerígeno tras a exposición in vitro a señaes GSM. E estudio biomédico se ha enfocado en a expresión de a proteína receptora R1 de as céuas madre neuraes procedentes de sistema nervioso de rata. Una expresión anorma de a proteína R1 en os cutivos tratados sería indicativa de una potencia acción adversa de a seña GSM sobre e metaboismo ceuar. Las céuas madre neuraes fueron expuestas a RF de 1800 MHz; seña GSM-Basic con tasa de absorción específica (SAR) mw/g. Las condiciones de exposición-contro se evaron a cabo en un sistema [14] que consiste en dos cámaras de resonancia situadas en e interior de un incubador de CO. Cada cámara (WG1 y WG) está provista de una antena emisora unida a un generador externo que estimua a azar, una u otra, según un protocoo dobe ciego. A fina de a exposición de a radiación no ionizante se reaizaron anáisis de inmunocitoquímica. La vaoración de as respuestas se reaizó mediante e estudio de as imágenes digitaes provenientes de una etapa de microscopía. E procesamiento digita tiene como objetivo contar aqueos núceos ceuares en cuyo citopasma correspondiente aparece a proteína receptora R1, respecto de tota de núceos en a muestra. Se pretende automatizar esta contabiidad por dobe motivo. En primer ugar, e voumen de as imágenes necesarias para demostrar a hipotética reación causa-efecto es tan ato que exige de una puesta agorítmica. En segundo ugar, se pretende eiminar, en todo o posibe, a subjetividad y a eficiencia imitada de propio anaizador humano. La organización de esta ponencia está reaizada como sigue. En a sección, se presenta un breve estado de as técnicas de procesamiento de imágenes biomédicas reacionadas con e escenario de cuerpos bioógicos ceuares. E tercer párrafo se destina a a descripción de as agoritmias de a Visión Artificia empeadas para contar núceos ceuares y a expresión de a proteína receptora R1. En a sección 4, os resutados experimentaes son presentados,

2 refejando una comparativa entre os distintos agoritmos desarroados y a numeración manua. Por útimo, en 5 se refejan as concusiones de este trabajo. PROCESAMIENTO DE IMÁGENES BIOMÉDICAS RELACIONADAS CON ESCENARIOS CELULARES Aunque todavía e 70% de as imágenes biomédicas son todavía radiografías, cada vez hay un mayor incremento en todos os ámbitos de as Ciencias de a Saud de uso de imágenes digitaes para un posterior tratamiento y amacenamiento: radiografías digitaes, tomografías, resonancias magnéticas, utrasonido, medicina nucear y angiografía de substracción digita, entre otras, que ocupan e 0% restante[10][1]. En os útimos años se ha asistido a un cambio sustancia en a forma de adquirir y manejar este tipo de información. Aunque e procesamiento de imágenes digitaes y todo o que circunda arededor de eo, eva ya más de 0 años impementándose en a industria y en a actuaidad son rutinarias en e campo de contro de caidad de os productos, en e ámbito de a Biomedicina está mucho menos impantada. Sin embargo, en estos momentos se está apicando as potenciaidades de a Visión por Computador a muchas probemáticas de a Medicina y a Bioogía. De esta forma y centrándose en e procesamiento de imágenes con escenarios ceuares bioógicos, se podrían citar os siguientes avances. Los métodos en inmunocitoquímica hacen posibe crear marcajes específicos que muestran a presencia, a forma y a distribución de proteínas, enzimas, neurotransmisores, receptores de membrana, etc., en céuas y tejidos [7][8]. La cuantificación de señaes de fuorescencia FISH (Fuorescence In Situ hybridization), es capaz de rendir información en temas tan dispares como a determinación de a cantidad reativa de oncogenes en procesos tumoraes reacionados con cáncer de mama, o bien en a determinación de quimerismo acanzado por un paciente tras traspante. E diagnóstico de os procesos carcinogénicos se ha visto notabemente favorecido tras a apicación de estas técnicas [16][11]. E cartografiado de secuencias especificas de DNA sobre genomas de distintas especies, se ha visto notabemente mejorado en sus nivees de resoución gracias a a utiización de anáisis digita de imagen [6][9][17]. Sondas de ADN con marcado fuorescente permiten conocer tanto e daño genético como determinar secuencias de genoma humano, ya que a hibridar éstas dentro de un cromosoma, e resutado es una emisión de irradiación dentro de espectro visibe. Su intensidad es proporciona a número de hibridaciones reaizadas. Incuso, partícuas bioógicas de mínimo tamaño, como son os virus, pueden resoverse, anaizarse y cuantificarse a través de información generada desde microscopia óptica [5]. E nive vírico de as céuas puede ser determinada por a reación entre un gen patrón y os virus depositados en ea. Ambos tipos son marcados por fuorocromos de diferentes nivees de ongitud de onda dentro de espectro visibe. ALGORITMIA PARA LA NUMERACIÓN DE NÚCLEOS CELULARES Y DE LA PROTEÍNA RECEPTORA R1 En a figura 1 se muestra una imagen adquirida a través de microscopio procedente de una de as cámaras de ensayo. Se observan as céuas madre neuraes. En coor azu intenso aparecen os núceos ceuares y sus ramificaciones citopasmáticas, aunque éstas útimas de menor intensidad en e coor pero caramente distinguibe por su contorno. Por as Figura 1. Céuas madre neuraes técnicas de inmunomarcaje, a proteína receptora R1 aparece de coor marrón. La información cromática de as imágenes de estudio hace fácimente separabe, e fondo, os núceos y e marcaje específico para R1. E ato vaor de tono (hue) de azu oscuro y en menor medida de azu caro, junto a nive bajo de tono de marcaje R1, requiere de una transformación de RGB a HSV. En a figura se muestra os resutados de este cambio.

3 πk b k = 1 cos k = 0,1,..., p,..., p p () Figura Rodaja tono de a transformación de RGB a HSV donde p es e orden de fitro y e índice de fitro causa, k, va desde 0 hasta e índice de fitro. Los coeficientes tienen simetría arededor de vaor de p. A convoucionar e histograma con a máscara definida, e resutado muestra una mayor aproximación a a expresión de modeo, (1). Sin embargo, presenta un desfase en a dirección de a propagación de fitro como consecuencia de a fase inea de éste. Por dicho motivo, se vueve a procesar a saida con e retardo incuido, de manera que en e conjunto tota, e desfase sea nuo: 4 x 10 4 histograma de a imagen H Con e objeto de poder separar e fondo de a imagen respecto de os núceos y de os citopasmas marcados se procede a a umbraización a partir de histograma de a imagen transformada. La figura a) muestra un histograma en e cua se puede apreciar os tres grupos de información de a imagen: marcaje, fondo y núceos. Sin embargo, una determinación de os umbraes de forma automática a través de características estadísticas de estos grupos no es posibe de momento. E histograma no se ajusta a ningún modeo de función de distribución fácimente parametrizabe Marcaje Fondo Núceos x 104 Siguiendo a ínea de Chang et a[], se propone caracterizar e histograma como a superposición de tres funciones de distribución norma, correspondiente a cada uno de os grupos definidos, caracterizados por sus medias y varianzas (m 1,σ 1), (m,σ ) y (m,σ ), junto con sus respectivas proporciones, P 1, P y P. De manera que a estimación de estos parámetros conduzca a que: h () i P j 1 i m j exp j= 1 πσ j σ i (1) siendo i e nive de gris de a imagen y h(i) a cuantificación de histograma. A partir de esta aproximación se buscará os dos umbraes óptimos que sean capaces de separar os tres grupos, t 1 y t. Ta cua se ha mostrado en a figura a), e histograma no sigue fiemente a expresión (1). Por tanto, se requiere fitraro antes de ser decompuesto. Con este fin se procede a suavizar e histograma a través de un FIR de Gauss. Sea un FIR de orden par y simétrico, esto es, de fase inea o no dispersivo, y cuya secuencia de ponderación coincide con os coeficientes de a máscara de convoución, quedará definido por ser de Gauss en a forma: Figura : Histograma de a imagen transformada a) origina, b) fitrada H = H B G () siendo H e histograma de a imagen transformada, B G a máscara de convoución de Gauss, H e histograma procesado y e operador convoución discreta con desfase nuo. La rapidez de a umbraización se basa en considerar que e índice de máximo vaor de histograma procesado corresponde con a estimación máximo verosími de a media de fondo:

4 [ jmax( h() j )] mˆ fondo = (4) A partir de esta estimación, se va abrir una ventana simétrica que permita conocer e intervao de distribución de fondo. La apertura de esta ventana va a depender de a medida de sesgo, β. se anaiza e agoritmo de as presencias de a proteína R1. La apicación de t produce e soapamiento, a veces, Este parámetro se define como una reación entre e segundo y tercer momento centra de un conjunto de muestras: β = ( 5) donde x y representa e momento centra y eevado a x. β tiene a propiedad de indicar si hay sesgo a a izquierda o a a derecha respecto a a media. Si β>0 significa que a distribución está escorada a a izquierda, en cambio, cuando β<0 indica sesgo de a distribución a a derecha. Para una distribución norma N(m,σ ), a ser una función par arededor de a media, os momentos centraes impares serán { ˆ } = 0 nuos, E ( x m). Por tanto, e sesgo será nuo para distribuciones normaes La técnica de umbraización aquí propuesta se basa en crear una ventana simétrica arededor de a estimación mˆ y computar e sesgo, de forma que fondo su vaor absouto sea menor a un determinado vaor. Por tanto, sea a ventana w, definida en e intervao [ mˆ mˆ ], se cacua e sesgo a partir de as siguientes expresiones: mˆ fondo fondo + w = i w i w ih h () i () i β ( w ) n ( w ) = = n ( i mˆ w) h() i i w ( w) ( w ) i w h () i (6) e vaor de irá desde uno hasta acanzar un intervao ta que: w = [ mˆ fondo mˆ fondo + ] β ( w ) < umbra] (7) os vaores extremos de intervao definirán os umbraes de separación entre e marcaje y e fondo, t = m, y e fondo con os núceos, ˆ 1 fondo t ˆ m + fondo =. En a figura 4 se muestra e procesamiento de histograma y os umbraes seeccionados según e agoritmo propuesto. Sin embargo, ta cua se contempan en as figuras 4.a) y 4.b), os resutados de a umbraización no son definitivos. Por eo, se aborda, a continuación, a probemática de número de núceos totaes y uego Figura 4. Resutados de a umbraización automática, a) Marcaje R1, b)núceos de os núceos ceuares y a presencia de ruido. Un suavizado morfoógico eiminará e ruido. En cambio, para a separación de os núceos se han probado distintas técnicas. Es usua y cásico empear e agoritmo watershed [1] para a separación de as céuas o de cuerpos bioógicos soapados[1][4]. Otra agoritmia probada ha sido e uso de operaciones morfoógicas con eemento estructurante en forma ovaada. No obstante, os mejores resutados se han conseguido a empear a información de os contornos de os núceos. En a detección de os contornos de os núceos se probaron varias técnicas, desde as máscaras de Sobe hasta os métodos de Canny[], pasando por a apaciana de Gauss y e zero-crossing. Todos eos se presentaron ruidosos y poco eficientes. En cambio, e gradiente morfoógico, a empear un eemento estructurante simétrico, no tiene direcciones priviegiadas en a detección de os bordes. Después de depurar os contornos, resutó inmediato a separación de os núceos soapados. Una substracción binaria con saturación entre os núceos y os contornos rompía con os probemas de soapamiento.

5 Probemas adicionaes se han presentado con a apoptosis (muerte ceuar programada), as cuaes no hay que contaras. Aparecen en estado más embrionario, menor tamaño e núceo y sin casi citopasma. E coor de núceo es más oscuro en e azú. Se ha resueto por tamaño, por nive de gris en e verde de RGB respecto a a media y a desviación típica de os núceos etiquetados y por a fata de citopasma. La segunda etapa trata de contar aqueos núceos que han sido marcados, esto es, que presentan en su contorno citpasmático a proteína receptora R1. Tras a eiminación de os puntos espurios procedentes de umbra t 1, se procedió a una diatación binaria de as membranas, acompañada con una intersección de os núceos resutantes de a etapa anterior. Estas operaciones generan as semias de crecimiento condiciona que resutarán a contabiidad de aqueos núceos con presencia en su citopasma de a proteína R1. En a figura 5.a) se muestra os resutados de contabiizar os núceos y en 5.b) e subconjunto de aqueos que tienen asociada a proteína inmunomarcada. 4 RESULTADOS EXPERIMENTALES Los datos anaizados son imágenes procedentes de as céuas madre neuraes depositadas en as cámaras WG1 y WG, de as cuáes no se conoce cuáes han servido para e contro y cuáes para a exposición, esto es, no se conoce en qué cámara se irradió a seña GSM-Basic. Se parte de un tota de 16 imágenes por cada cámara y por cada jornada de experimento. Por cada imagen se añade un informe de a contabiidad manua de os números de núceos totaes y de a enumeración de núceos que tienen en su citopasma correspondiente a presencia de a proteína R1. E conteo es reaizado siempre por a misma persona. Los resutados sobre un experimento, que ha servido como eemento conductor de a mejora agorítmica, quedan refejados en a taba 1. En a primera coumna aparece a referencia de a imagen en su correspondiente cámara (WG1 o WG). La segunda fia muestra e número de núceos contados manuamente. Las tres siguientes refejan os resutados de os distintos agoritmos ensayados: mediante operaciones morfoógicas excusivamente, empeando e agoritmo watershed y por útimo, a apicación de a información de os contornos. WG1 Manua Morfoogía Watershed Morfoogía+ contorno Tota Taba 1. Comparación entre os distintos agoritmos en a numeración de os núceos de a cámara WG1 Figura 5. a) Núceos totaes contados por e agoritmo presentado b) Núceos seeccionados con presencia de proteína R1

6 es de un 18%. WG Manua Morfoogía Watershed Morfoogía+ contorno Tota Taba. Comparación entre os distintos agoritmos en a numeración de os núceos de a cámara WG1. Los resutados indican que en e conjunto de experimento, a diferencia entre e agoritmo propuesto y a contabiidad manua es de un %, en cambio con os procedimientos cásicos van desde e 8% a 15%. Un buen acierto en a enumeración de os núceos conducirá también a un buen resutado de número de núceos cuyo citopasma correspondiente presenta a proteína. En a taba se comparan os resutados manuaes con e agoritmo propuesto. La diferencia WG1 Manua Diatación condiciona WG Manua Diatación condiciona Tot Tot Taba.Comparación entre a contabiidad manua y e agoritmo propuesto respecto a núceos asociados a presencia de R1. E desarroo de estos agoritmos ha sido evado con Image Processing Toobox de MATLAB y con SDC Morphoogy Toobox [15]. 5 CONCLUSIONES E presente trabajo presenta un conjunto de propuestas agorítmicas, basadas en Visión Artificia, para a enumeración de núceos ceuares y cuántos de eos tienen asociada a presencia de una determinada proteína en su citopasma. En primer ugar, son presentadas as transformaciones de RGB a HSV para mejorar a separación entre e fondo, os núceos y e marcaje inmunocitoquímico. Un método novedoso es propuesto para a umbraización de as imágenes transformadas. Se basa en a modeización de histograma como a combinación de tres distribuciones normaes, correspondientes a cada uno de os grupos mencionados: marcaje, fondo, núceos. Se empea e sesgo muestrea para a ocaización óptima de a ventana de fondo, obteniendo os núceos y e marcaje. Para a contabiidad de os núceos y superar e inconveniente de soapamiento de éstos, se recurre a a información de contorno ceuar a través de gradiente morfoógico, junto a postprocesado de a etapa de umbraización. La seección de os núceos con presencia de proteína R1 asociada se ha basado en e crecimiento condiciona de a intersección entre e marcaje y os núceos. Agradecimientos Este proyecto tiene financiación dentro de os proyectos precompetitivos de a Universidad Poitécnica de Madrid. E estudio biomédico incuido en este trabajo forma parte de Proyecto Europeo REFLEX (QLK4-CT ).

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