Efecto de hemocianinas de moluscos en la maduración de células dendríticas murinas

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1 UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Efecto de hemocianinas de moluscos en la maduración de células dendríticas murinas Memoria para optar al Título de Bioquímico Miguel Ignacio del Campo Zaldívar Departamento de Investigación y Desarrollo, Biosonda S.A. Fundación Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Profesor Patrocinante: Javier Puente Ph.D. Director de Tesis: María Inés Becker Ph.D. Santiago de Chile, Noviembre 2007

2 A mis padres, Rafael y Margarita. ii

3 AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer a la doctora María Inés Becker por haberme aceptado como su alumno en este proyecto, por ser un ejemplo de amor por la ciencia y sus esfuerzo por contagiarme con ello, por su apoyo y ayuda no sólo en lo académico, sino también por ser una maestra en todo ámbito; por su voluntad, trabajo y dedicación por esta tesis. Agradezco al doctor Alfredo de Ioannes por permitirme desarrollar la tesis en Biosonda S.A., a toda la gente del laboratorio que aportó en este trabajo, a Augusto Manubens, Esteban Nova, Francisco Vargas, Alejandra Fuentes, Cecilia Espinoza, Andrea Gonzalez y en especial a Leidy Lagos, por su ayuda incondicional como compañera y como amiga; y a todo el grupo humano que conforma Biosonda S.A., a Marcela Cabezas, Lorena Macaya y don José Peña. Gracias a todos quienes me ayudaron en el desarrollo experimental de esta tesis, al profesor Alejandro Munizaga y Ximena Vergés por su aporte en las Microscopías, a Valeska Simons y a la doctora María Rosa Bono por ayudarme en el análisis de las citometrías de flujo, y a Bruno Moltedo por sus aportes en reactivos y en la discusión de este trabajo. Agradezco también al doctor Javier Puente, por haber aceptado patrocinar esta tesis. Gracias a mis padres, Rafael y Margarita, a mis hermanos, Rafael, Javiera y Gabriel, por haberme dado todo para desarrollarme como persona; a mis amigos, Xavier, José Luis y Ricardo; a mis compañeros de colegio y de universidad, y a todos a quienes de alguna u otra forma ayudaron en el desarrollo de este trabajo. iii

4 Esta Tesis forma parte del proyecto FONDECYT titulado Estudio de la estructura de la hemocianina de moluscos en relación a sus mecanismos de inmunoestimulación en mamíferos y percibió apoyo parcial de la Fundación COPEC-PUC proyecto SC0014 titulado Desarrollo de productos inmunoestimulantes en base a hemocianina de C. concholepas Los resultados obtenidos han sido presentados en los siguientes congresos y seminarios: Immunomodulatory effect of CCH and KLH, members of the hemocyanin family, on the maturation of dendritic cells. Becker MI, Del Campo M, Lagos L, Fuentes A, Manubens A, De Ioannes AE, Moltedo B, 9th International Conference on Dendritic Cells. September Edinburgh, England. Abstract P3.103, pp: 84. Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células dendríticas. Del Campo M., Moltedo B., De Ioannes A. E., Becker, M. I. XLIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile de Noviembre Pucón, Chile. Abstract R-134, pp. R Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células dendríticas. Del Campo M., Moltedo B., De Ioannes A. E., Becker, Seminario de Ingeniería en Biotecnología: Aplicaciones Industriales de procesos biotecnológicos de Abril Universidad de Viña del Mar. Viña del Mar, Chile. Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células dendríticas. Del Campo M, Lagos L, Manubens A, Ioannes A, Moltedo B, Becker MI. XXX Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile de Septiembre Termas de Chillán, Chile. Libro de Resúmenes, Pág. 64, Resumen 77. Participación de células natural killer en el efecto inmunoestimulante de hemocianinas. Lagos L, Del Campo M, Manubens A, Moltedo B, De Ioannes A, Puente J, Becker MI. XXX Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile de Septiembre Termas de Chillán, Chile. Libro de Resúmenes, Pág. 42. iv

5 ÍNDICE Página ABREVIATURAS 1 RESUMEN 3 SUMMARY 5 INTRODUCCIÓN 7 Estructura de las hemocianinas de moluscos 7 Mecanismos de inmunoestimulación de hemocianinas 8 Las células dendríticas y su rol en la presentación de antígenos 10 HIPÓTESIS 13 OBJETIVO GENERAL 14 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14 MATERIALES Animales de experimentación Reactivos Soluciones Material plástico y otros 18 v

6 5. Equipos 18 MÉTODOS Aislamiento y cultivo de DCs Aislamiento y cultivo de células NK Análisis por microscopía de luz con contraste de fase Análisis por microscopía confocal Análisis por microscopía electrónica de transmisión Marcación de proteínas con Alexa Tinción negativa de proteínas Análisis por citometría de flujo Análisis por ELISA para medición de citoquinas Análisis por Westernblot (WB) para determinar degradación de CCH Desglicosilación de CCH e inmunización para evaluar título de Ac 24 RESULTADOS Caracterización de cultivos de DCs murinas a partir de células precursoras de médula ósea 27 vi

7 2. Determinación de la incorporación de CCH por DCs in vitro e in vivo Efecto de CCH sobre la maduración de DCs Capacidad proteolítica de las DCs frente a CCH Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas, in vivo e in vitro 41 DISCUSIÓN 46 CONCLUSIONES 53 BIBLIOGRAFÍA 54 vii

8 ÍNDICE DE FIGURAS Página Fig 1 : Esquema de la organización general de hemocianinas de molusco 9 Fig 2 : Mecanismo de inmunoestimulación de CCH y maduración de DCs 11 Fig 3 : Establecimiento y caracterización de la población DC 28 Fig 4 : Análisis de la incorporación de CCH por DCs 29 Fig 5 : Análisis de la incorporación de CCH por DCs 31 Fig 6 : Efecto de CCH sobre la maduración de DCs 33 Fig 7 : Efecto de CCH sobre la maduración de DCs: Expresión de marcadores de maduración evaluados por citometría de flujo 34 Fig 8 : Análisis de la pérdida de la capacidad fagocítica 36 Fig 9 : Capacidad proteolítica de DCs sobre CCH 37 Fig 10 : Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC 39 Fig 11 : Efecto de CCH sobre la secreción de interleuquinas en cocultivos NK/DC 40 Fig 12 : Tratamiento de desglicosilación química y enzimática de CCH y sus subunidades 42 Fig 13 : Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas, in vivo 44 viii

9 Fig 14 :Secreción de IL12 por efecto de CCH y sus subunidades desglicosiladas, en cultivos DCs in vitro 45 ix

10 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Respuesta inmune humoral de ratones contra CCH y sus subunidades Desglicosiladas 44 x

11 ABREVIATURAS Ac : Anticuerpo. ATP : Adenosin trifosfato APC : Antigen presentation cell, célula presentadora de antígeno BCR : B cell receptor, receptor de antígeno de célula B BSA : Bovine serum albumin, albumina sérica bovina. CCH : C. concholepas hemocyanin, hemocianina de C. concholepas. CD : Cluster of diferentiation, grupos de diferenciación. D-MEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium, medio Eagle modificado de Dulbecco DCs : Células Dendriticas ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay, ensayo inmuno enzimático en fase sólida. FAL : Fosfatasa alcalina FITC : Fluorescein isothiocyanate, Isotiocianato de fluoresceina FUs : Unidades funcionales GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos HPC : Hematopoietic progenitor cell, célula progenitora hematopoyética ILs : Interleuquinas INFγ : Interferón γ KLH : Key hole limpet hemocyanin, hemocianina de Key hole limpet Lamp : Lisosomal associated membrane protein, proteína de membrana asociada a lisosoma LB : Linfocitos B LPS Lipopolisacárido LT : Linfocitos T MET : Microscopia electrónica de transmisión MHCI y MHCII : Mayor histocompatibility complex class I and II, complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y II. MLCF : Microscopía de luz con contraste de fase NK : Natural Killer, células asesinas naturales OVO : Ovoalbúmina PE : Phycoeritrin, Ficoeritrina PBS : Phosphate buffer saline, tampón fosfato salino 1

12 PHA : Phytohemaglutinine, fitohemaglutinina PMSF : Phenylmethylsulphonyl fluoride, fenilmetil sulfoniflúoruro PNGasa F : N-glicosidasa F Respuesta Th1 Respuesta de Linfocito T helper de tipo 1, caracterizada por un aumento en la expresión de INFγ RPMI-1640 : Medio formulado en Roswell Park Memorial Institute. SFB : Suero fetal bovino SSC y FSC : Size scatter y Forward scatter, dispersión de tamaño y dispersión de granulosidad. TCR : T cell receptor, receptor de antígeno de célula T TLR : Toll like receptor, receptores de tipo Toll TNF α : Tumoral necrosis factor α, factor de necrosis tumoral α WB : Westernblot 2

13 RESUMEN Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c + ) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kda hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h. Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. 3

14 Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental. 4

15 ABSTRACT EFFECT OF MOLLUSK HEMOCYANINS ON THE MATURATION OF MURINE DENDRITIC CELLS Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C. concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties, increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response. Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment in lymphoid tissues. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kda, were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h. In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and 5

16 secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the modulation of DCs by CCH. Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo. 6

17 INTRODUCCIÓN Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno, presentes en la hemolinfa de una gran variedad de moluscos y artrópodos. En estos phylum, dichas proteínas difieren considerablemente en la secuencia primaria, en el peso y en la organización de sus subunidades, así como también en su capacidad de unir oxígeno (van Holde et al.,1995), siendo de interés en este trabajo, las hemocianinas de moluscos, por su importancia en el campo de la inmunología. Las hemocianinas han sido modelos de estudio en bioquímica principalmente por su gran tamaño, por ser metaloproteínas, por tener una cinética alostérica en la unión de O 2 y por su compleja estructura cuaternaria. A estas proteínas se les descubrió una capacidad inmunogénica notable en vertebrados, debido, en parte, a su carácter xenogénico, a su gran tamaño (4-9 MDa), por tener una estructura cercana a una simetría D 5, en que los epítopos pueden estar repetidos hasta 60 veces, y por poseer un alto porcentaje de azúcares en su estructura (2 a 4% de su peso). Las hemocianinas han sido utilizadas como antígeno experimental, como proteínas transportadoras para producir anticuerpos contra haptenos y péptidos; se han usado, también, en el desarrollo de vacunas contra patógenos y algunos tipos de cáncer; como adyuvantes en la presentación antigénica de células dendríticas (DCs) pulsadas con lisados de melanoma y como inmunoestimulante en la terapia del cáncer superficial de vejiga (Harris et al., 1999; Markl et al, 2001). La hemocianina de la lapa californiana Megathura crenulata (cuyo nombre vulgar es keyhole limpet, KLH), ha sido la única utilizada con tales propósitos por los últimos 30 años. Sin embargo, en el último tiempo, se ha comenzado a estudiar la hemocianina del molusco chileno Concholepas concholepas (cuyo nombre vulgar es Loco), y se la ha denominado CCH. La hemocianina de Concholepas, ha demostrado ser una alternativa a KLH, tanto en su capacidad transportadora de haptenos y péptidos para producir anticuerpos (Manosalva et al., 2004), así como también en su efecto antitumoral no específico en la terapia del cáncer superficial de vejiga (Moltedo et al., 2006); aun cuando difiere con KLH en su origen y en su estructura cuaternaria. Estructura de las hemocianinas de moluscos Las hemocianinas tienen un tamaño que les permite ser fácilmente reconocidas por microscopia electrónica de transmisión (MET) usando tinción negativa. Presentan una forma de cilindro hueco de 300 a 400 Å de diámetro, compuesto por 10 subunidades de 400 KDa aproximadamente, que se organizan en una estructura básica conocida como decámero, que puede 7

18 alcanzar una masa molecular de 3,5 a 4,5 MDa. Dentro de la clase de los bivalvos y los gastrópodos, estos decámeros pueden asociarse como dímeros estables gracias a una interacción cara-cara asimétrica entre ellos, dando por resultado estructuras enormes que alcanzan pesos moleculares entre 8 a 9 MDa. Las subunidades están formadas por 7 u 8 dominios globulares denominados unidades funcionales (FUs) de 50 KDa aproximadamente, las cuales se encuentran ordenadas como en un collar de perlas y unidas covalentemente por pequeñas regiones flexibles denominadas linkers constituidos por 10 a 15 aminoácidos (Fig. 1A). En cada FU se encuentran dos centros binucleares de cobre donde se coordina reversiblemente la unión de una molécula de oxígeno, lo que le da el color azul característico a la proteína (De Ioannes P., et al., 2004) Gracias a profusos estudios usando diferentes condiciones experimentales que permiten disociar y reasociar las subunidades de diferentes hemocianinas de moluscos, se ha podido dilucidar la composición y la estructura de las subunidades en la proteína, llegando a la conclusión que tanto KLH como CCH poseen 2 subunidades denominadas KLH1 (390 KDa) y KLH2 (350 KDa), y CCHA (405 KDa) y CCHB (350 KDa) respectivamente, que coexisten en la circulación de los animales. Sin embargo, en KLH las subunidades se organizan formando homodecámeros, mientras que en CCH forman heterodidecámeros (De Ioannes P. et al., 2004) (Fig. 1C y 1D ). Mecanismos de inmunoestimulación de hemocianinas. El uso de KLH como un antígeno proteico modelo, debido a su poderosa inmunogenicidad en comparación a otras proteínas como Ovalbumina, por ejemplo, ha contribuido a la comprensión de la respuesta inmune timo dependiente y al rol que los linfocitos T (LT) CD4+ juegan en ella. Sin embargo, el mecanismo por el cual realizan su acción inmunoestimulante es aún poco claro. No obstante, se ha especulado que dicho efecto sería distinto a la acción linfoproliferativa producida por fitohemaglutinina (PHA) sobre los linfocitos T, o a la proliferación de linfocitos B (LB) inducida por el Lipopolisacarido bacteriano (LPS). Se ha postulado que la inmunogenicidad intrínseca de estas proteínas podría relacionarse con la existencia de LB de memoria, generados por una previa estimulación con xenoantígenos que contienen epítopos peptídicos y/o carbohidratos similares a hemocianina, los cuales podrían ser reconocidos por una reacción cruzada, o deberse a alguna característica fundamental de KLH desconocida hasta ahora (Harris et al., 1999). Nuestro laboratorio ha demostrado que CCH al igual que KLH, por si sola, es decir, sin necesidad de adyuvantes, puede prevenir el crecimiento de tumores, utilizando un modelo murino 8

19 A B Decámero Subunidades Subunidad Didecámero C SUBUNITS SUBUNIDADES DECAMERO DIDECAMERO Organización n de KLH y CCH D KLH Homogeneous Homodecámeros CCH Heterodecámeros Fig 1. Esquema de la organización general de hemocianinas de molusco. A. Hemocianina de gastropodo y sus componentes. B Esquema de Didecámero de hemocianina con microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa donde se aprecia la forma de cilindro hueco (Markl, 2001, con modificaciones) C. Esquema comparativo entre la estructura de KLH y la CCH, donde se representan sus organizaciones homodidecamérica y heterodidecamerica, respectivamente. D. Análisis electroforético de KLH y CCH en condiciones nativas, SDS no reductoras y SDS reductoras. Se observan las dos subunidades de KLH y CCH y se demuestra que la interacción entre ellas no involucra uniones covalentes (De Ioannes, et al., 2004, con modificaciones) 9

20 de cáncer de vejiga, disminuyendo el tamaño tumoral en ratones sensibilizados además de aumentar su sobrevida. A su vez, se ha determinado un aumento en la actividad lítica de células Natural Killers (NK) por efecto de dichas hemocianinas, induciendo también un patrón de interleuquinas de respuesta de tipo Th1, caracterizado por un aumento en la expresión de INFγ (Moltedo et al., 2006). Estos antecedentes nos han llevado a postular un mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas en el cual las células dendríticas (DCs) jugarían un rol pivotal, al ser las mediadoras de la inmunidad innata y la adaptativa, vía secreción de IL-12. Esta interleuquina induciría la activación de las células NK, con la consiguiente secreción de INFγ, configurando una respuesta de tipo Th1 (Fig. 2A). Para validar este mecanismo, resulta indispensable, entonces, establecer el efecto que producen dichas hemocianinas sobre la activación y maduración de las DCs y, como consecuencia, sobre la presentación antigénica a los linfocitos o dando señales a las células NK, o ambas. Las células dendríticas y su rol en la presentación de antígenos Las DCs son conocidas como las células presentadoras de antígeno profesionales, ya que juegan un rol clave en la iniciación y modulación de las respuestas inmunes. Fueron visualizadas por primera vez en 1868 en la piel, siendo conocidas como células de Langerhans; sin embargo, hace sólo 35 años, fueron reconocidas en todos los epitelios y órganos del sistema inmune, caracterizándolas como DCs (Steinman 1991). Las DCs son capaces de activar tanto linfocitos B como linfocitos T. Los LB son capaces de reconocer directamente el antígeno nativo a través de inmunoglobulinas de membrana (B cell receptor, BCR); en cambio, los LT, reconocen al antígeno a través de sus receptores (T Cell Receptor, TCR), previo procesamiento y presentación de una célula presentadora de antígeno (antigen presentation cell, APC), en el marco de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o II, (Mayor Histocompatibility Complex, MHCI y MHCII), fenómeno conocido como restricción MHC (Banchereau y Steinman, 1998). Las DCs pueden ser aisladas y cultivadas in vitro. Dependiendo de su origen, las DCs humanas pueden clasificarse en, al menos, cuatro subclases: DCs derivadas de monocitos sanguíneos CD14 +, DCs intersticiales o dérmicas derivadas de células progenitoras hematopoyéticas (hematopoietic progenitor cell, HPC) CD34 +, células de Langerhans derivadas de HPCs CD34 + y DCs plasmocitoideas (Ratzinger et al., 2004). En cambio, las DCs murinas se clasifican dependiendo de su localización y función en: DCs mieloides y linfoides, que se distinguen por la expresión de CD8α. Las DCs mieloides, CD8 α -, obtenidas desde células precursoras de medula 10

21 A Inmunidad innata Inmunidad adaptativa Células NK Células dendríticas Tumor ADCC IFNγ IL12 Respuesta primaria IL2 IFNγ Respuesta secundaria IFNγ Linfocitos T Respuesta tipo Th1 Linfocitos B B Fig 2. Mecanismo de inmunoestimulación de CCH y maduración de DCs. A. Mecanismos propuesto por nuestro equipo de investigación sobre la inmunoestimulación de hemocianinas. B: Comparación entre DC en estado inmaduro y DC en estado maduro, donde se mencionan las principales diferencias; de Banchereau y Steinman, 1998, modificada. 11

22 ósea, pueden pertenecer al subtipo CD4 + o CD4 -, expresan CD11b +, CD11c + y MHCII en la superficie celular, se localizan en las zonas marginales del bazo y los nódulos linfáticos y pueden migrar al sistema linfático periarteriolar bajo estimulación de señales inflamatorias como LPS, por ejemplo (Banchereau, et al., 2000). El factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos (GM-CSF) e IL3, son interleuquinas capaces de generar diferenciación de los precursores a DCs mieloides y DC linfoides respectivamente, siendo indispensables para su sobrevida (Inaba et al., 1992; Saunders, et al.,1996). En este trabajo, se utilizó células CD11c +, molécula que participa en la adhesión al endotelio vascular, y que se ha establecido como el marcador general para DCs. Las DCs inmaduras capturan y procesan antígenos en tejidos periféricos, lo que induce su activación, migrando a los órganos linfoides secundarios, donde van a estimular a los LT naive que poseen un TCR capaz de reconocer al antígeno presentado. Durante este proceso, las DCs aumentan la expresión de moléculas de MHC II (señal de presentación antigénica), destinadas a interactuar con los TCRs, y sobre expresan una serie de moléculas coestimulatorias, como CD40, CD80 y CD86; que tienen ligandos específicos de activación en LT. También aumentan la secreción de interleuquinas como IL12 e IL18, capaces de gatillar una respuesta celular de tipo Th1 en los LT helper. In vitro e in vivo, sólo unas pocas DCs son necesarias para provocar una fuerte respuesta en LT. La duración del proceso depende de la localización de las DCs y de la naturaleza del antígeno. La presentación antigénica de las DCs es un proceso dependiente de ATP y requiere, inequívocamente, la incorporación del antígeno y su debido procesamiento (Banchereau y Steinman, 1998). Delamarre et al. (2005) determinaron que las DCs poseen un potencial proteolítico limitado, lo cual aumenta la capacidad de diseminar los antígenos a través del sistema inmune, reduciendo al mínimo la destrucción de antígenos internalizados, lo que permite que la presentación antigénica pueda ocurrir en los nódulos linfaticos días después de haber sido incorporados los antígenos. La maduración de las DCs involucra una serie de eventos coordinados a nivel funcional, fenotípico y génico. Estas modificaciones se pueden resumir en: pérdida de receptores de endocitosis y fagocitosis, cambios en la morfología celular (aumento en la relación superficie/volumen, por la aparición de largos procesos de membrana), cambios en los compartimentos del MHC II, aumento en la expresión de las moléculas coestimulatorias, modificaciones en los compartimentos lisosomales y cambios en la expresión de moléculas de adhesión. Entre los agentes que pueden inducir maduración se encuentran el LPS, citoquinas como TNF α y GM-CSF, y ligandos de LT como CD40L. IL10 inhibe la maduración (Banchereau y 12

23 Steinman, 1998). Estos cambios que se producen en las DCs pueden ser utilizados como marcadores de maduración, por lo tanto, son herramientas que permiten evaluar la respuesta frente a un antígeno en estudio, como en el caso de este trabajo, donde se estudió el efecto de CCH. Sabiendo entonces que las hemocianinas son capaces de generar inmunoestimulación sin necesidad de adyuvantes, ya que tienen una adyuvanticidad intrínseca (Frost y Lance, 1978) que potencian respuestas de tipo Th1, nos hemos abocado a estudiar el efecto de estas proteínas sobre la activación, maduración y su consiguiente presentación por parte de las DCs, tanto in vivo como in vitro. HIPÓTESIS Las hemocianinas de gastrópodos, por sí solas, son capaces de inducir la activación y maduración en DCs, lo cual permite activar la inmunidad innata (NK) y adaptativa, vía procesamiento y presentación a células T naive, para generar un ambiente de citoquinas inmunoestimulantes. 13

24 OBJETIVO GENERAL Determinar la capacidad que tienen las hemocianinas en modular la maduración de las DCs, para generar una respuesta inmunoestimulante, ya sea por un aumento en la expresión de MHC II o por un aumento de las moléculas coestimulatorias o ambas, tanto in vitro como in vivo. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Caracterizar un cultivo de DCs murinas a partir de células precursoras de médula ósea. 2. Determinar incorporación de CCH por DCs, tanto in vitro como in vivo. 3. Estudiar el efecto de CCH completa o de sus subunidades aisladas, sobre la maduración de DCs. 4. Estudiar la inmunogenicidad tanto in vitro e in vivo generada por CCH y sus subunidades, deglicosiladas, generando tales condiciones en la proteina. 5. Determinar la capacidad proteolítica de las DCs, estudiando el estado de procesamiento de CCH a diferentes tiempos de incubación. 6. Estudiar el efecto de CCH sobre las DCs a nivel de inmunidad innata, realizando co cultivos con células NK. 14

25 MATERIALES 1. Animales de experimentación Ratones C57BL/6 y C3H/HeJ, fueron adquiridos en Jackson Laboratory (Bar Harbor USA), o en el Departamento de Biología Celular, Facultad de Odontología, Universidad de Chile, y fueron mantenidos en el bioterio de Biosonda S.A, Chile, en un área restringida que se mantiene a 22-24ºC, con ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con agua y alimento ad libitum. Los ratones utilizados tenían 2 a 4 meses de edad. 2. Reactivos 2.1. Cultivo celular. Medio de cultivo D-MEM y RPMI 1640; Aminoácidos no esenciales (MEM NEAA, 11140); Penicilina 1x10 4 U/ml (100x); Streptomicina 1x10 4 ug/ml ; L-Glutamina 200mM (100x); Piruvato de Sodio 100mM (100X) de Gibco, USA; Suero fetal de bovino (SFB) de Hyclon, USA; IL-2 1x10 4 U/ml de BD Pharmingen, USA; GM-CSF de sobrenadante de la línea celular secretora J558L de GM-CSF (J558L-GM-CSF) donado por el Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Ciencias, Universidad de Santiago, dirigido por la Dra Mónica Imarai Proteínas y compuestos biológicos. Hemocianina de Concholepas concholepas y sus subunidades (CCH A y CCH B) de Biosonda S. A.; Conjugados anti IGg de conejo y ratón, marcados con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) y Fosfatasa alcalina (FAL), respectivamente; Ovoalbumina (OVO), Albúmina de suero de bovino (BSA) de Pierce, USA, PNGasa F de Elizabethkingia meningsepticum, 50U; LPS de E.coli tipo 0111.B4 de Sigma-Aldrich, USA, donado por el Laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, dirigido por María Rosa Bono. 2.3 Reactivos inmunológicos Aislamiento Celular Kit aislamiento células CD11c+, Kit aislamiento células NK, Columnas magnéticas (MACS, magnetic cell sorting) de Miltenyi Biotec, Alemania. 15

26 Determinación citoquinas Mouse Total IL-12 ELISA Kit (Endogen, USA). Mouse IFNγ Screening Set y Mouse TNFα ELISA de Pierce, USA Marcación de proteínas Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Molecular Probes, USA), CCH-Alexa 647 donada por Bruno Moltedo, del Departamento de Microbiología, The Mount Sinai School of Medicine, New York, USA Anticuerpos Marcados Marcadores de superficie asociados a fluoróforos, anti-cd11c-pe (Ficoeritrina), anti- CD11c-FITC, anti IAb-FITC, Lamp-FITC, Anti H-2Kb-PE, anti-cd49b-pe; anti-cd19- PE; anti-cd14-pe; anti- CD3-PE de BD (Biosciences Pharmingen). PE: Espectro de absorción de 566 nm (luz verde) y espectro de emisión de 575 nm (luz roja). FITC: Espectro de absorción de 488 nm y espectro de emisión de 530 nm. 3. Soluciones 3.1. Medios de cultivo y soluciones estériles Medio de cultivo: D-MEM y RPMI 1640, Gibco, Medios de cultivo complementados con 10% SFB; 1% aminoácidos no esenciales; 1% Glutamina; 1% antibióticos. Solución lisis de glóbulos Rojos: NH4Cl (0.15M); KHCO3 (10Mm); NaEDTA (0.1Mm). Tampón fosfato salino: Fosfato de sodio 0,1M, Cloruro de Sodio 0,15M ph 7,2, de Pierce. PBS- SFB 2% Soluciones de reacción deglicosilación química Tampón acetato 0,1M, Peryodato de sodio 15mM, ph5,5. Etilenglicol puro Soluciones de reacción deglicosilación enzimática Solución de reacción para PNGasa en condiciones nativas (según instrucciones del fabricante): KH 2 PO 4 40mM, EDTA 10mM, ph 6, Soluciones no estériles Tampón fosfato salino ph 7.2, Triton X-100, Nonidet NP-40, Tween 20, SuperBlock R de Pierce. Tampón FAL (carbonato-bicarbonato 0,2 M, MgCl 2, 1mM a ph 9,64), PMSF 1mM (100x). 16

27 3.3. Soluciones de montaje para diversos experimentos que usan células fijadas Citometría de flujo PBS-SFB 2%; PBS-Paraformaldehído 3.7%, PBS-Tween 0,02% Inmunofluorescencia Medio DABCO:1,4-diazobiciclo[2.2.2]octano 0,1g/ml; glicerol 90%; PBS 10%, ph 7.2, azida 0,4mg/ml Microscopía electrónicade transmisión. Acetato de uranilo 4% en metanol 50%; Citrato de plomo 0,1% en H 2 O, Glutaraldehído 2% en tampón Cacodilato de Sodio 0,1 M, ph Soluciones de electroforesis Geles SDS PAGE en gradiente 5-15%, en condiciones reductoras. Tampón de corrida: SDS 1 ug/ml, Tris 25mM, Glicina 192mM, ph 8,3. Tampón de carga 4X: SDS 0,08 g/ml, Tris/HCl 50%, Glicerol anhidro 40%, β- mercaptoetanol 4%, en PBS, ph 6, Geles nativos de agarosa 1,5% Tampón de corrida: Tris 100mM, Ácido Bórico 500 mm, ph 7,4 Tampón de carga 2x: Glicerol anhidro con azul de bromofenol Tinción geles Solución de fijación: Metanol 50% y Ácido Acético 10% en H 2 O. Solución de tinción: Metanol 50%, Ácido Acético 10% y 0,1% Coomasie en H 2 O. Solución de decoloración: Metanol 5% y Ácido Acético 7%, en H 2 O Soluciones de inmunowesternblot Tampón de transferencia: Tris base 25mM, Glicina 192 mm, Metanol 20%. Solución bloqueadora de membrana: PBS-Caseína 1%. Solución de revelado: 1 Step TM NBT/BCIP, de Pierce Cuantificación de proteínas Reactivo Coomasie (Coomasie Plus Protein Reagent,), BSA stock de Pierce. 17

28 4. Materiales plásticos y otros Tubos cónicos de 15 y 50 ml (Axygen, USA); pipetas de 1, 2, 5, 10 y 25 ml; placas de Petri; tubos Eppendorf; botellas 50, 75, 200 ml; placas 24 pocillos; Filtros Millex GV 0,22 µm; Millicell de 0,4um (Transwell), Stericup de 250, 500 y 1000 ml, 0,22µm (Millipore); placas de ELISA de 96 pocillos de poliestireno fondo plano; Cámara de Neubauer; Jeringas de 1,5 y 10 ml de Terumo, USA. Tubos Khan. Porta y cubre objetos. 5. Equipos Lector ELISA 7520 con filtros de absorción a 405 nm, 450 nm, 490 nm y 600 nm (Cambridge Technology, Inc). Estufa de cultivo de células, con regulación de CO2 y temperatura (Nuaire). Campana de flujo laminar (Clean Room Procusts, Inc). Baño termoregulado (Lab-Line). Microscopio de contraste de fase (Nikon). ph metro (Orion 3 Star). Balanza analítica; Balanza granataria electrónica (Sartorius). Microcentrifuga (Ependorff). Citómetro de flujo laminar (Beckton Dickinson, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile). Microscopio de barrido láser confocal Olympus Fluoview FV (Japan). Microscopio Electrónico de Transmisión (Phillips Tecnai 12, Servicio Microscopía Electrónica Pontificia Universidad Católica). Lavador de placas ELISA (Bio-Tek). Separador Magnético (MACS); Microscopio de luz invertido; Agitador de células (Labnet, USA); Amicon (Millipore). 18

29 MÉTODOS 1. Aislamiento y cultivo de DCs Extracción de precursores de médula ósea murina y diferenciación a DCs. El aislamiento celular se realizó según Inaba et al., 1992, con modificaciones. Ratones de la cepa C57BL/6 de alrededor dos meses de edad, fueron sacrificados por dislocación cervical, para luego extraerles la tibia y el fémur quirúrgicamente y bajo el ambiente de una campana de flujo laminar, removiendo el músculo y colocándolos en una solución de etanol 70% por 1 min. Luego, cortando las puntas de los huesos con tijeras, se perfundió la médula ósea con una jeringa de 2,5 ml con medio de cultivo RPMI Una vez colectada la médula, se centrifugó a rpm por 8 min Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 a 2 ml de solución de lisis de glóbulos rojos durante 2 min, deteniendo su efecto mediante la adición de 3 veces el volumen de medio. Se centrifugó nuevamente a rpm por 8 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino 10% (SFB), aminoácidos no esenciales 1%, glutamina 1% y antibióticos 1% (Penicilina y Estreptomicina) y además factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos (GMCSF) diluido 1:30. Se contaron las células en un microscopio de luz con una cámara de Neubauer y se sembraron en placas de 24 pocillos 1x10 6 células por ml. El cultivo se mantuvo en una estufa a 37ºC y en un ambiente al 10% de CO 2 y 100% de humedad. El medio de cultivo fue removido completamente a los 2 y 4 días y se reemplazó por medio fresco Enriquecimiento de DCs. El protocolo de aislamiento corresponde al indicado por el proveedor del Kit de aislamiento CD11c + de Miltenyi. Al quinto día de haber extraído los precursores de médula ósea del ratón, las células fueron recolectadas y contadas, y luego fueron centrifugadas a rpm por 10 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en una relación de 400 ul de tampón de columna para 1x10 8 células. Las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-cd11c + que tiene unido esferas magnéticas a razón de 100ul para 1x10 8 células por 15 min a 4ºC. Luego se hicieron pasar por una columna imantada, realizándose de esta forma una selección positiva al retener la columna a las células CD11c +, eluyendo el resto. Luego, sacando la columna del campo imantado se eluyeron las DCs. 19

30 1.3. Cultivo de DCs. Las células aisladas fueron contadas y se sembraron entre 0,5 a 1x10 6 células por ml, en placas de 24 pocillos, en medio RPMI 1640 complementado, listas para ser estudiadas. 2. Aislamiento y cultivo de células NK 2.1. Extracción de células mononucleares y aislamiento de NK. Ratones de la cepa C57BL/6 de alrededor dos meses de edad, fueron sacrificados por dislocación cervical, se les extrajo quirúrgicamente el bazo bajo campana de flujo laminar y se depositó sobre una placa de Petri con 5 ml de medio D-MEM. Se perfundieron cuidadosamente y se colectó las células con pipeta Pasteur, luego se centrifugó por 20 min a rpm. Los glóbulos rojos fueron lisados agregando a cada bazo 1 ml de solución de lisis de glóbulos rojos durante 2 min y luego se agregó 10 ml de medio D-MEM completo y se centrifugó nuevamente por 20 min a rpm. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio D-MEM completo. Se contaron las células y luego se centrifugaron durante 10 min a rpm y se prosiguió al aislamiento de las células NK según las indicaciones del Kit de aislamiento de células NK de Miltenyi Biotec. Este kit realiza una selección negativa de NKs, ya que no las retiene al hacerlas pasar por un campo magnético, previo marcaje del resto de las células con anticds específicos, unidos a esferas mágneticas, las cuales quedan pegadas al iman. Con este procedimiento se obtuvo un 70% aprox. de células NK Cultivo de células NK Se cultivaron 5x10 5 células por ml en placas de 24 pozos, solas o en co-cultivo con DCs y NKs de 2 días (relación 1:1), con contacto celular o con sistema de placas de cultivo transwell, en medio D-MEM completo suplementado con IL-2 (1x10 4 U/ml) y 2-β ME (2x10-5 M), en una estufa a 37ºC y en un ambiente 10% CO 2 y 100% humedad. 3. Análisis por microscopía de luz con contraste de fase (MLCF) Los cultivos DC o cocultivos NK/DC fueron fotografiados directamente en los pozos, durante los tiempos indicados, tratados o no con 100 ug/ml de CCH o 100 ng/ml de LPS. Se utilizó para ello un microscopio de luz equipado con contraste de fase del 20

31 Servicio de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga 4. Análisis por microscopía confocal 5x10 5 a 1x10 6 células fueron incubadas en un pozo que contiene un cubre objeto circular, donde se adhieren las células. El sobrenadante fue retirado y se fijaron las células en el mismo pozo con 500 ul de PBS-Paraformaldehído 3.7%, por 20 min a 25ºC. Luego se retiró el cubre objeto y se montaron con una gota de DABCO en un portaobjeto para ser analizados por el Servicio de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga. 5. Análisis por microscopía electrónica de transmisión Los cultivos DC o cocultivos NK/DC fueron tratados según el método general descrito por Luft, Se centrifugaron y fijaron en un pellet de 5x10 5-1x10 6 con glutaraldehído al 2 % en tampón cacodilato de sodio 0.1 M, ph 7.4 y luego fueron postfijados con OsO4, deshidratados y embebidos en Epon (Poliscience). La resina se polimerizó a 60ºC durante 48 hr y luego se realizaron cortes finos de Å de grosor en un ultramicrótomo. Los cortes se recogieron en grillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo al 4% en 50% metanol durante 1-5 min, se lavaron con 50% etanol frío, y luego se tiñeron con citrato de plomo de acuerdo al método descrito por Reynolds, Finalmente se lavaron con agua destilada y se observaron al microscopio electrónico a 80 KV. Este protocolo fue realizado por el Servicio de Microscopía, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga. 6. Marcación de proteínas con Alexa488 Se utilizó el procedimiento descrito por el fabricante. A 1ml de CCH (10mg/ml) se agregó 100 µl de Bicarbonato de Sodio. Paralelamente se disolvió un vial del fluoróforo en Dimetilformamida y se dejó agitando por 1 hr. Se neutralizó por 30 min con 100 µl de Hidroxilamina y se dializó para eliminar el exceso de reactivo. Se usó un sistema Amicon Ultra Free para eliminar los agregados y esterilizar la preparación. CCH- Alexa647 fue donada por Bruno Moltedo, del Departamento de Microbiología, The Mount Sinai School of Medicine, New York, USA. 21

32 7. Tinción negativa de proteínas. Las proteínas fueron teñidas también según el método de Fernández-Morán et al., en 1966, con modificaciones según De Ioannes P., et al., Distintas concentraciones de muestra se colocaron en grillas de cobre recubiertas por Parlodion al 3% en acetato de amilo. Luego las muestras fueron teñidas por 1 min con 10 ul de acetato de uranilo al 2%. Las grillas fueron secadas en una pieza libre de humedad y observadas en un microscopio electrónico Phillips Tecnai 12, en el servicio de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga. 8. Análisis por citometría de flujo Preparación de muestras. Cultivos DCs o co cultivos NK/DC, tratados con diferentes concentraciones de CCH, CCH-Alexa488, CCH-Alexa647, OVO y/o LPS, a los tiempos indicados, se resuspendieron las células del pozo por suave pipeteo y se recolectaron en tubos Ependorff. Se centrifugaron a rpm por 3 min, eliminándose el sobrenadante y resuspendiendo en 200 ul de PBS-SFB 2%. Luego se agregó 1,5 ul del Ac de interés asociado a un fluoróforo (anticd11c + -PE o FITC, anti IA b -FITC, anti H-K b -PE, anti Cd86-FITC, anti-cd49b-pe; anti-cd19-pe; anti-cd14-pe; anti-cd3-pe) por 20 min. a 4ºC. Se centrifugó a rpm por 3 min, se eliminó el sobrenadante y se lavaron las células con 250 ul de PBS-SFB 2%. Se centrifugó nuevamente y se eliminó el sobrenadante. Para fijar las células, se resuspendieron en 200 ul de PBS- Paraformaldehído 3.7% a 25ºC por 30 min. Se centrifugó, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 300 ul de PBS-SFB 2%. Para los experimentos con células permeabilizadas, luego de ser fijadas, las células se resuspendieron en 200 ul de PBS-Triton 0,5%, por 20 min, a 25 ºC. Se lavaron y se eliminó el sobrenadante. Para analizar incorporación de CCH en DCs permeabilizadas, se incubaron las células en 200ul de suero de ratón pre inmune (1:125) por 24 hrs, a 4ºC. Luego se centrifugaron las células, y resuspendieron en 200 ul de suero anti-cch policlonal de conejo (1:250) por 1 h a 25ºC. Se centrifugó, se lavó y se resuspendió con un conjugado Anti IgG de conejo marcado con FITC (1:250), por 1 h a 25ºC. Se centrifugó, se lavó y se resuspendió en 300ul de PBS-SFB 2%. Para analizar la expresión de Lamp en DCs permeabilizadas, se incubó en 200 ul de 22

33 PBS-SFB 2%-Triton 0.05%, con 1,5 ul anti Lamp-FITC por 20 min a 25ºC. Se centrifugó, lavó y resuspendió en 300 ul de PBS-SFB 2%. Las células, listas para ser analizadas por citometría de flujo, se traspasaron a tubos Khan, y fueron analizadas en el laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, dirigido por María Rosa Bono. Los controles usados fueron: a cada tiempo de análisis, DCs no tratadas, como control de autoflorecencia, DCs marcadas sólo con CD11c para establecer la población DC+, DCs incubadas sólo con CCH-alexa488 o CCH-Alexa647 para el análisis de la perdida de capacidad fagocítica y DCs incubadas sólo con el conjugado Anti-IgG de conejo marcado con FITC, para el análisis de incorporación de CCH Criterio para la determinación de la población de DC por citometría de flujo. Los resultados de la citometría fueron analizados por el programa computacional WINMDI. En este programa se trabajaron los datos con gráficos del tipo densidad de puntos e histogramas. En el primero de estos gráficos se determinó una población de un cierto tamaño y granulosidad (size scatter v/s forward scatter, SSC v/s FSC) característico para DCs. Esta población se analizó para establecer que porcentaje presenta el marcador CD11c+, el cual es el marcador específico más utilizado en la literatura para reconocer una población de las DCs. Se analizó entonces en FSC v/s FL1 o FL2 (canales en los cuales se lee la fluorescencia de FITC o PE, respectivamente) y se estableció la población positiva para el marcador, como se muestra en la figura 3C La intensidad de esta marca se analizó luego con el gráfico de histograma. 9. Análisis por ELISA para medición de citoquinas. Para medir las citoquinas IL12, TNF α y INF γ, se tomó 125 ul de sobrenadante de medio de cultivo de DCs o cocultivos NK/DC, a diferentes tiempos. Se guardaron los sobrenadantes a -20ºC hasta su uso (aprox. 3 semanas) La concentración de citoquinas se midió por un test de ELISA de captura con kit comerciales, según los protocolos del fabricante, los cuales tienen incorporados estándares de concentración conocida. La lectura de la reacción se realizó a 450 nm. Como controles se usaron suero de ratones no inmunizados, medios de cultivo complementados sin células y medios de cultivo de DC complementados y con IL-2. 23

34 10. Análisis por Westernblot (WB) para determinar degradación de CCH. Para determinar si las DCs eran capaces de degradar CCH a diferentes tiempos, se realizó IMB con extractos de 2x10 6 DC, siguiendo el protocolo descrito por Towbin, et al., en 1979, con modificaciones. Se incubó con CCH a diferentes tiempos y las células fueron lavadas y resuspendidas en Suero Fisiológico (0,9% NaCl), 0,5%Nonidet P-40 y 10uM de PMSF (inhibidor de serina-proteasas) por 20 min. Luego se agregó tampón de carga de electroforesis 4x en condiciones reductoras y se calentó a 100ºC por 5 min. Las muestras fueron corridas en un gel de gradiente del 5-15% SDS-PAGE y transferidas a una membrana de Nitrocelulosa por 4hr a 100 miliamp. La membrana se bloqueó con PBS-1% Caseína toda la noche, y fue incubada con suero anticch policlonal de conejo (1:2000) por 3 hrs, a 25ºC. Se lavó la membrana con PBS-0,02% Tween dos veces por 10 min, y se incubaron con Anti IgG de conejo marcado con FAL, por 1hr a 25ºC. Luego se lavó nuevamente y se incubó con el reactivo 1-Step TM NBT/BCIP, hasta la aparición de las bandas. Como control se usaron extractos sin CCH y extractos a los cuales se les agregó CCH al momento de realizarlos. 11. Desglicosilación de CCH e Inmunización para evaluar título de Ac Desglicosilación química Preparación de la proteína El protocolo empleado se obtuvo de The protein protocols, Handbook, de Walker JM, (1996). Se dejó incubando 0.5 mg/ml de CCH, CCH A y CCH B en una solución con tampón acetato 0,1M y Peryodato de sodio 15mM (concentración para desglicosilación completa), por 1 h en oscuridad, a 25ºC. Luego el exceso de peryodato se eliminó agregando 25 ul de etilenglicol puro y se dejó reposar las muestras a 4ºC toda la noche. Las muestras se concentraron con el sistema Amicon ultra-15, hasta alcanzar un volumen de 3 a 4 ml. Luego fueron dializadas toda la noche contra PBS para eliminar el tampón acetato Análisis electroforéticos de proteínas desglicosiladas químicamente. Las proteínas nativas y desglicosiladas se analizaron por electroforesis en geles nativos de agarosa 1,5%, según el procedimiento de Becker et al., 2007, y por geles en gradiente del 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras, según el procedimiento 24

35 general descrito por Laemmli en 1970, con modificaciones. Los geles nativos fueron corridos por 4 hrs a 20 volt. Se cargó 2,5 ug de proteína por pozo. Las proteínas fueron diluidas en el tampón de corrida y tampón de carga 1:1. El gel fue teñido con Azul de Coomasie. Geles en gradiente del 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras fueron cargados con 5 ug de proteína, tampón carga 4x y corridos por 12 hrs a 40 volt y teñidos con Azul de Coomasie Desglicosilación enzimática Preparación de la proteína Para la desglicosilación enzimática se utilizó la enzima Peptide-N-glycosidase F (PNGasa F, Sigma), la cual corta las uniones de Asparragina con el oligosacarido. El protocolo que se siguió fue desglicosilación en condiciones nativas, según el procedimiento del producto, con variaciones. Brevemente, 1 mg/ml de proteína (CCH, subunidades de CCH y Fetuína como control positivo) se incubaron con 10 unidades de enzima (20 ul) a 37ºC por 6 días. Luego las muestras se dejaron a 4ºC. Por electroforesis se comprobó la desglicosilación Análisis en geles SDS-PAGE en condiciones reductoras. Geles en gradiente 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras, fueron cargados con 5 ug de proteína, salvo la fetuína (control positivo) que se cargó 7,5 ug en tampón de carga 4x, y fue corrido por 12 hrs a 40 volt y teñido con reactivo Coomasie Inmunización de animales de experimentación. 2 ratones de las cepas C57BL/6 y C3H/HeJ, fueron inmunizados vía intraperitoneal, dos veces cada 14 días con 150 ug de proteína (CCH, CCH A, CCH B, nativas y desglicosiladas, tanto de forma química, como enzimática) y sangrados 28 días después de la primera inmunización. Se obtuvieron los sueros y se midió el título de Ac. contra el antígeno homólogo y heterólogo para determinar el grado de reacción cruzada Cuantificación de título de Anticuerpos contra CCH o sus subunidades mediante ELISA. Se utilizó el procedimiento general descrito por Crowther y Abu-Elzeein., en 1980, con 25

36 modificaciones. Placas para ELISA de 96 pocillos, fueron activadas durante toda la noche a 4ºC con 100ml/pozo de una solución del antígeno (CCH o sus subunidades, con y sin tratamiento de desglicosilación), a una concentración de 10mg/ml. Posteriormente, se realizaron 3 lavados con 250ml/pozo de PBS-0,02% Tween y se procedió a bloquear los sitios reactivos remanentes de la placa con 250 ml/pozo de SuperBlock (Pierce), por 1 h a 25 C. Se realizaron 3 lavados de 250 ml/pozo con PBS-0,02% Tween. Luego se incubaron los sueros en diluciones seriadas con un factor de 2 (de 1:10 a 1:1280). Las diluciones de los sueros se realizaron con SuperBlock y se dejó incubando por 3 h a 37 C. Se realizaron 3 lavados, de 250 ml/pozo con PBS-Tween 0.02% y se agregó 100ml/pozo de SuperBlock con anti IgG de ratón marcado con FAL, y se incubo por 1 h a 37ºC. Se hicieron 3 lavados de 250ml/pozo con PBS-Tween 0,02 %.Luego se colocó 100 ml/pozo de una solución 1 mg/ml de pnpp en tampón FAL (carbonato-bicarbonato 0,2 M, MgCl 2 1mM a ph 9,64) y se dejó incubando durante 15 a 30 min a 37 C. La reacción fue detenida con 100ml/pozo de NaOH 3N y se leyó la DO a 405 nm. El título de Ac se estableció como la dilución en que la absorbancia máxima obtenida decae a la mitad. Las mediciones se realizaron tres veces, y se empleó para su análisis estadístico ANOVA de dos vías, del programa computacional GraphPad Prism 4. 26

37 RESULTADOS 1. Caracterización de cultivos de DCs murinas a partir de células precursoras de médula ósea. Para la obtención del cultivo de DCs a partir de precursores de médula ósea, se siguió el protocolo descrito por Inaba et al. (1992), en ratones de la cepa C57BL/6. Al quinto día de extraídas las células, se estableció como tiempo cero. Durante la primera etapa de trabajo, dedicada a establecer la incorporación de CCH por DCs, no se trabajó con cultivos enriquecidos en dichas células. Sin embargo, debido a la heterogeneidad morfológica del cultivo, observadas por MLCF, fue necesario enriquecerlos en DCs para descartar efectos de otros tipos celulares como macrófagos y fibroblastos. El cultivo, entonces, fue enriquecido con el Kit de aislamiento CD11c + de Miltenyi. La caracterización de la población DC, se llevó a cabo por diversas metodologías que permitieron analizar sus características morfológicas y también la expresión de los antígenos CD (cluster of diferentiation, grupos de diferenciación) propios de esta población de células. Por MLCF se observó una población relativamente homogénea, destacándose células de gran tamaño adheridas al sustrato y con procesos de membrana que incrementaron en número y longitud en el transcurso del tiempo (Fig 3A). Por MET se analizó con mayor detalle el fenotipo celular, destacándose la presencia de numerosos organelos, grandes vacuolas, vesículas y lisosomas primarios, propios de este tipo celular (Fig 3B). Al analizar por citometría de flujo cultivos no enriquecidos, se encontró que un 15-38% de la población expresaba el marcador CD11c +, específico de DCs y sus subclases. En cambio, en cultivos enriquecidos, fue de un 60-75% (Fig 3C). En estos últimos, se determinó el porcentaje de otros tipos celulares contaminantes, encontrándose en un experimento representativo que el 1% correspondía a linfocitos T (CD3 + ), 0,6% a linfocitos B (CD19 + ), 2,25% a células NK (CD49b + ) y 1,25% a macrófagos (CD14 + ). Por el tamaño y la granulosidad de la población que no presentó marca se asumió que se trataba de células muertas. 2. Determinación de la incorporación de CCH por DCs in vitro e in vivo. Para determinar si las DCs incorporan CCH, en primer lugar, se incubó 1x10 6 células con CCH-Alexa488 (100 ug/ml). Por microscopía confocal, se observó que existe colocalización entre las células marcadas con CD11c + -PE y las que presentaron la marca del fluoróforo (Fig 4A). Sin embargo, esto no indicaba si la proteína estaba ingresando a la célula o si sólo estaba asociada a la membrana. Para determinar si efectivamente CCH estaba al interior 27

38 A B C R1: 87,36% R2: 62,19% Fig 3. Establecimiento y caracterización de la población DC. A. MLCF de un cultivo DC de 8 días, donde se aprecia un cultivo relativamente homogéneo, con células adheridas al sustrato, y aspecto fusiformes. B. MET de DC de 5 días, donde se observa su enorme tamaño y morfología característica: gran número de organelos y vesículas, procesos membranosos y una alta relación citoplasma/núcleo. C. Caracterización de la población DC por citometría de flujo en un cultivo enriquecido. Se indica el porcentaje de células CD11c +, que varió entre 52%-70%. 28

39 A Células CD11c+ CCH-AlexaFluor 488 Colocalización B Sin CCH >30 min 60 min 180 min CD11c+PE células 15,33% 18,80% 55,64% 78,33% DCs permeabilizadas 15,29% 19,72% 25,02% 31,27% DCs no permeabilizadas Anti-IgG de conejo-fitc % CD11c+ con CCH 50 ug/ml 100 Células permeabilizadas 75 Células no permeabilizadas Tiempo (min) Fig 4. Análisis de la incorporación de CCH por DCs. A. Microscopía confocal de DCs de 5 días, incubadas con CCH-Alexa488 (100 ug), a tiempos <30min. En color rojo se aprecia la marca del Ac anti-cd11c +, en verde la marca del fluoróforo, y luego, al sobreponerlas, se aprecia en amarillo las zonas de probable colocalización. B. Análisis de incorporación de CCH por citometría de flujo en DCs permeabilizadas y no permeabilizadas, a diferentes tiempos, incubando con CCH (50 ug), y revelado con suero anti-cch de conejo y anti-igg de conejo conjugado con FITC. Se observa el rápido aumento de las DCs-CCH +, al permeabilizó, en comparación a las no permeabilizadas. 29

40 de las DCs, realizamos un análisis por citometría de flujo de DCs incubadas con CCH (50 ug/ml) a diferentes tiempos (>30, 60, 180 min), tanto en células permeabilizadas como no permeabilizadas (ver Métodos 8.1). La presencia de CCH se reveló a través de un suero anti- CCH de conejo y de una incubación posterior con un conjugado anti-igg de conejo marcado con FITC. En las DCs permeabilizadas, donde los Ac anti-cch pueden detectar a la proteína en el interior de la célula, obtuvimos un aumento de la población DC-CCH + en el tiempo, que alcanzó un 78,33% a los 180 min. Sin embargo, en DCs no permeabilizadas, es decir, donde los Ac anti-cch sólo se unen a CCH localizada en la membrana plasmática de la célula, encontramos un aumento menor de esta población, llegando a un 31,27% en el mismo tiempo de análisis (Fig 4B). Al analizar por MET las DCs incubadas en forma permanente con CCH, se encontró que la proteína es incorporada por un proceso de endocitosis vía vesículas de clatrina, observándose la formación de una vesícula rodeada por el canastillo característico que forma esta proteína (Fig 5A). Luego, a 1 h y 24 h de incubación, se observó moléculas intactas de CCH en vesículas de un contenido claro y con membranas similares a las de vacuolas y lisosomas, lisas y menos electrón densas, en comparación a las con clatrina, como se muestra en la Fig 5B. Por el contrario, al realizar incubaciones de pulsos de CCH durante 24 h, y observando a las 48 h, no encontramos moléculas de hemocianinas en dichas vesículas. Estos resultados fueron corroborados por estudios in vivo, en donde se inyectó vía intraperitoneal CCH-Alexa 488 (100 µg) y CCH (100 µg), como control negativo, en ratones C57BL/6, y luego, analizando en exudado peritoneal a diferentes tiempos, se encontró presencia de la marca fluorescente de un 15,3% a las 72 h, en la población CD11c + (Fig 5 C). Del conjunto de estos resultados, concluimos que CCH fue incorporada por DCs rápidamente (<30 min), localizándose también en la membrana plasmática, sin ingresar a la célula, hasta 180 min. In vivo, se detectó CCH en DCs hasta 72 h después de haber sido inyectados los ratones. 3. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs Dado que determinamos que CCH es incorporada por DCs a tiempos tempranos de incubación, el paso siguiente fue conocer si CCH tenía efecto sobre su maduración. Para ello, evaluamos diversos parámetros que diferencian una DC inmadura de una madura, tales como cambios en su morfología, y también cambios funcionales, como una mayor expresión de MHCII y moléculas coestimulatorias, aumento en la secreción de IL12 y pérdida de la capacidad fagocítica. Este conjunto de parámetros fueron evaluados y nos permitieron establecer si tal condición era inducida por CCH. Hay que hacer notar, que la hemocianina 30

41 A B Control DCs 1hconCCH 24h con CCH 48h con pulso 24h C Tiempo 24 h 48 h 72 h FSC-Height CCH-Alexa Contol, CCH 94% 3,4% 97,3% 0,3% 95,6% 2,3% FL1-Height 81,2% 16,1% 85,3% 12,3% 83,2% 15,3% CCH-Alexa 488 Fig 5. Análisis de la incorporación de CCH por DCs. A. MET, DCs incubadas con CCH (100 ug) a diferentes tiempos. Se observa la endocitosis de la proteína vía vesículas de clatrina en tiempos tempranos de incubación. B. CCH muestra una localización en vesículas y/o lisosomas secundarios. A las 48 h de incubación, luego de un pulso de 24 h, ya no se observan moléculas intactas. C. Incorporación in vivo de CCH, inyectando CCH-Alexa488 (100 ug) y CCH (100 ug) como control, intraperitonealmente. Se detectó presencia de CCH hasta las 72 h, en un 15% de la población DC. 31

42 utilizada en estos experimentos es libre de LPS, lo cual fue certificado a través de un ELISA comercial específico para LPS realizado por Biosonda S.A., y mediante bioensayos en ratón, realizados por el Departamento de Microbiología, de la Escuela de Medicina de The Mount Sinai, New York, USA. En primer lugar, por MLCF y MET, observamos cultivos de DCs de 8 días, incubados con pulsos de 24 h de CCH (100 ug/ml) y de LPS (100 ng/ml), no detectándose diferencias entre los cultivos control y los experimentales, tanto en su distribución como en su morfología; tampoco se observó cambios morfológicos al comparar células con y sin CCH, no encontrándose moléculas de CCH íntegras en el interior de vesículas. En cambio, al observar los cultivos incubados con LPS, si se observaron diferencias notables en el aspecto del cultivo, las células presentaron una apariencia más redondeada, con pérdida de los procesos de membrana y claros indicios de haber entrado en apoptosis: presencia de cuerpos electrón densos, vesículas multilaminares y pérdida de la integridad de mitocondrias, reflejada en la ruptura o ausencia de las crestas mitocondriales (Fig 6A). Al medir la secreción de IL12 se encontró un aumento significativa a las 72 h con respecto al control, por efecto de CCH (p 0,05). En las DCs incubadas con LPS (control positivo), se detectó un notable aumento a las 24 h que se mantuvo en el tiempo (Fig 6B). De igual forma, se midió la secreción de TNF α y INF γ hasta las 72 h, y de acuerdo a lo esperado, no se encontró dichas citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos de DCs (datos no mostrados). Posteriormente, por citometría de flujo, evaluamos la expresión temporal de MHCII y de la molécula coestimulatoria CD86, inducidas por CCH (100 ug/ml) y LPS (10 y 100 ng/ml) como control positivo, encontrando que no hay cambios hasta las 72 h en ninguna de las condiciones respecto a las células control no tratadas, lo cual se corroboró por la intensidad de la fluorescencia de estas poblaciones (Fig 7A y 7B). Para determinar si CCH podría presentarse en forma cruzada, es decir, que pudiera ser vista como un antígeno propio, se evaluó la expresión de MHCI en el tiempo. No se encontró diferencias hasta las 72 h, al comparar con el control sin tratamiento. Sin embargo, fue llamativo el aumento encontrado con una proteína no relacionada como Ovoalbumina (OVO), tanto en el porcentaje de la población MHCI como en la intensidad de la fluorecencia, fenómeno que atribuimos a una contaminación con LPS presente en esta proteína (datos no mostrados). Al medir la expresión de Lamp (proteína asociada a membrana lisosomal) en DCs permeabilizadas, encontramos un aumento del 67,11% de la población Lamp +, a las 72 h de 32

43 A DCs Control DCs CCH DCs LPS Microscopia electronica Microscopía de luz B IL *** 3 ** 24 h 48 h pg/ml IL * 72 h 0 DC DC CCH DC LPS 1* P< 0,05 DC CCH v / s DC, a 72 h 2*** P< DC LPS v / s DC, DC CCH a 24 h 3** P<0.01 DC LPS v / s DC CCH a 48 h y 72 h Fig 6. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs. A. Microscopia de luz con contraste de fase y MET, en DCs de 8 días, incubadas durante 48 h con CCH (100 ug) y LPS (100 ng), con un pulso de 24 h. No se observan diferencias entre las DC tratadas con CCH y las células no tratadas. Las flechas indican presencia de cuerpos multilaminares y pérdida de la integridad de mitocondrias en DCs tratadas con LPS. B. Secreción de IL12 determinado por ELISA. Los resultados representan 5 experimentos independientes, en que 1x10 6 cél/ml fueron incubadas con CCH o LPS a distintos tiempos. 33

44 A % Control Población MHCII CCH LPS 10 ng LPS 100 ng 24 h 48 h 72 h veces de aumento Control Intensidad MHC II CCH LPS 10 ng LPS 100 ng 24 h 48 h 72 h B % Población CD86 24 h 48 h 72 h veces de aumento Intensidad CD86 24 h 48 h 72 h 0.0 DC DC CCH DC LPS 1.0 DC DC CCH DC LPS C % Población Lamp 24 h 48 h 72 h veces de aumento Intensidad Lamp 24 h 48 h 72 h 0 Control CCH LPS 10 ng LPS 100 ng 0.0 Control CCH LPS 10 ng LPS 100 ng Fig 7. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs: Expresión de marcadores de maduración evaluados por citometria de flujo. A. La expresión de MHCII, no aumentó por efecto de CCH ni LPS en el tiempo, tanto en el porcentaje como en la intensidad de la marca fluorecente. Resultado representativo de 4 experimentos independientes. B. La expresión de la molécula coestimulatoria CD86, tampoco aumento por efecto de CCH en el tiempo, y sólo lo hizo por efecto de LPS a las 24 h, usado como control positivo. Resultado preliminar de un solo experimento. C. CCH aumento la expresión de Lamp a las 72 h de incubación, en comparación a las células no tratadas. Resultado representativo de 3 experimentos independientes. 34

45 haber incubado CCH con respecto a las no tratadas, lo cual se refleja también, en un aumento en la intensidad de la fluorescencia de 1.88 veces; aumento 7.5 veces en las incubadas con CCH y 4 veces en las no tratadas(fig 7C). Finalmente, también se evaluó la pérdida de la capacidad fagocítica de las DCs frente a CCH marcada con dos fluoróforos diferentes y agregadas en forma diferida. Se observó que, tanto a las 30 h como a las 78 h de haber incubado con CCH-Alexa488 (verde), sólo un 10% de la población deja de incorporar CCH-Alexa647 (rojo), cuando se agregó en un pulso de 6 h, lo cual señaló que el haber incorporado CCH no generó una pérdida en la capacidad fagocítica de las células (Fig 8A). Al incubar CCH-Alexa488 con LPS para obtener un fenotipo maduro en DC, y luego incubar CCH-Alexa647, contrariamente a lo esperado, se observó que las DCs incorporaban más CCH que cuando no fueron tratadas con LPS, es decir, no hubo pérdida en la capacidad fagocítica de estas células, a los tiempos analizados y en nuestras condiciones de estudio. Esto lo interpretamos como que las DCs entraron a un proceso apoptótico, que daría cuenta de este fenómeno (Fig 8B). 4. Capacidad proteolítica de las DCs frente a CCH. Por Westernblot analizamos si las DCs, son capaces de degradar CCH luego de haber sido incorporada. Para ello, se incubó CCH en cultivos de DCs durantes diferentes tiempos, realizando luego extractos celulares (2x10 6 células). Se observó que CCH ya se encuentra degradada por las DCs a las 7 h, en fragmentos de tamaño entre 80 KDa y 40 KDa, siendo la banda más intensa una de aprox 45 KDa, que disminuye en tiempos sucesivos (Fig 9B). Las bandas detectables por WB desaparecen casi por completo a las 52 h, y no se detectan a las 72 h (datos no mostrados), señalando que a este tiempo CCH fue totalmente procesada. No se evidenció diferencias en el procesamiento de CCH en DCs incubadas con LPS (100 ng). Como control, se agregó CCH en un extracto celular sin PMSF (inhibidor de serina proteasas), con lo que se comprobó que el procesamiento de CCH en fragmentos de tamaño cada vez menor, se debe a un efecto de su incorporación en la célula y no a la proteólisis por efecto de la preparación del extracto; observándose las bandas características de CCH: CCHA (400 KDa) y CCHB (350 KDa); y los productos del autoclivaje de CCHA: CCHA1 (300 KDa) y CCHA2 (100 KDa), como fuera reportado por De Ioannes et al (2004). Este mismo extracto no mostró bandas en los tamaños antes descritos, descartándose una marca inespecífica. En un gel en gradiente del 5-15% SDS-PAGE en condiciones reductoras se realizó la prueba de carga, cuyos resultados se muestran en la Fig 9A. 35

46 A 30 h 78 h B Fig 8. Análisis de la pérdida de la capacidad fagocítica. A. DCs de 5 días fueron incubadas con CCH-Alexa488 (100 ug, verde) por 24 h, luego fueron lavadas e incubadas con CCH-Alexa647 (100 ug, rojo), con pulso de 6 h y analizadas por citometría de flujo. Se encontró que sólo un 10% de las DCs pierden la capacidad de incorporar la proteína marcada, independientemente del tiempo de incubación. B. DCs incubadas con LPS (100 ng), aumentaron a los tiempos señalados, la incorporación de CCH. 36

47 A Suero Anti CCH B Gel SDS PAGE CCHA CCHB CCHA1 CCHA Fig 9. Capacidad proteolítica de DCs sobre CCH. A. WB de extractos de DCs incubados a distintos tiempos con CCH. B. Gel SDS-PAGE de extractos de DCs como control de carga, donde se destaca el perfil de corrida de las sub unidades de CCH: CCHA, (400 KDa), CCHB (350 KDa) y CCH A1 (300 KDa) y CCH A2 (100 KDa) Carril 1: Extracto DC con CCH s/pmsf (control negativo). Carril 2: Extracto DC incubado 7 h con CCH. Carril 3: Extracto DC incubado 7 h con CCH y LPS. Carril 4: Extracto DC incubado 24 h con CCH. Carril 5: Extracto DC incubado 24 h con CCH y LPS. Carril 6: Extracto DC incubado 31 h con CCH. Carril 7: Extracto DC incubado 52 h con CCH. 37

48 5. Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC. Para validar el mecanismo de inmunoestimulación de CCH propuesto en esta tesis, consideramos fundamental analizar su efecto sobre cocultivos NK/DCs, es decir, determinar si tiene un efecto activador sobre la inmunidad innata. Con este propósito, se realizaron cocultivos de dichas células en una relación de las poblaciones celulares de 1:1, estudiándose parámetros similares de maduración evaluados para los cultivos de DCs aisladas, previamente descritos. Los cocultivos se dejaron por 48 h, correspondiendo a DCs de 6 días y NKs de 2 días, incubadas con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml) al momento de juntarlas, y pretratando ambos grupos celulares previamente por 24 h con CCH (100 ug/ml). Por MLCF, se apreciaron cambios notables en el aspecto del cocultivo que fueron pretratados con CCH, observándose una morfología madura por parte de las DCs: células de gran tamaño con múltiples procesos de membrana, rodeadas por varias NKs mucho más pequeñas. Mediante MET se apreció una clara asociación entre las células NKs y DCs, reflejada en la complementariedad de los procesos de membrana y en múltiples sitios de contacto celular en que no se observa espacio entre ellas, aunque no pudimos definir un tipo de unión específica como por ejemplo gap juntion. Este interacción de membrana, si bien existe en los cocultivos incubados con CCH y sin tratamientos, nos pareció menos numeroso que en los casos que se pretrató con CCH (Fig 10A). En los cocultivos también se analizó por citometría de flujo la expresión de MHCII y de CD86 en DCs a las 48 h, encontrándose aumentos de ambos marcadores de maduración en todas las condiciones de incubación con CCH, al comparar con cocultivos no tratados, tanto en la población como en la intensidad de la marca fluorescente (Fig 10B y 10C). Al medir la secreción de IL12 e INFγ, por ELISA, en los sobrenadantes de los cocultivos con contacto celular y sin contacto celular, separados por el sistema transwell (sólo permite el intercambio de sustancias solubles), a los tiempos de 24 h y 48 h, se encontró que existe una mayor secreción de estas citoquinas en los cocultivos pretratados con CCH, comparando con las DCs solas, en cocultivos NK/DC con y sin CCH, que no mostraron diferencias a estos tiempos (Fig 11A y 11B). Se midió también la secreción de TNFα, obteniéndose un nivel basal entre 100 y 400 pg/ml para los pozos controles e incubados con CCH, y en torno al doble de concentración para los pozos incubados con LPS (datos no mostrados). Como control positivo se usó LPS (100 ng/ml), el cual produjo una fuerte secreción de IL12 e INFγ a las 24 h, manteniéndose en el tiempo hasta las 72 h de análisis. 38

49 A B 60 Población MHCII 6 Intensidad MHCII % veces de aumento C 0 NK/DC NK/DC CCH NK/DC LPS NK (CCH)/DC DC (CCH)/NK 0 NK/DC NK/DC CCH NK/DC LPS NK (CCH)/DC DC (CCH)/NK % NK/DC Población CD 86 + NK/DC CCH NK/DC LPS NK (CCH)/DC DC (CCH)/NK veces de aumento NK/DC NK/DC CCH Intensidad CD86 + NK/DC LPS NK (CCH)/DC DC (CCH)/NK Fig 10. Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC. A. Microscopia de luz con contraste de fase y MET, de cocultivos NK/DCs de 48 h, con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml). Se destaca la morfología celular y con mayor aumento el detalle del contacto entre las células. B y C. Expresión de marcadores de maduración evaluados por citometría de flujo. Se muestra un aumento en la expresión de MHCII y CD86 por efecto de CCH, tanto en la población positiva para el marcador, como en su intensidad de fluorecencia, al comparar con el control sin tratamiento. Los datos corresponden a resultados preliminares de un sólo experimento. 39

50 A pg/ml IL-12 IL h *** * * *** *** 48 h *** p<0,001 * p<0,05 0 IFNγ h 48 h DC DC-CCH DC-LPS NK NK-CCH NK-LPS NK-DC C NK-DC T NK-DC/CCH C NK-DC/CCH T NK-CCH/DC C NK-CCH/DC T DC-CCH/NK C DC-CCH/NK T NK-DC/LPS C NK-DC/LPS T DC DC-CCH DC-LPS NK NK-CCH NK-LPS NK-DC C NK-DC T NK-DC/CCH C NK-DC/CCH T NK-CCH/DC C NK-CCH/DC T DC-CCH/NK C DC-CCH/NK T NK-DC/LPS C NK-DC/LPS T DC NK Cocultivo NK-DC B pg/ml IFNγ DC NK Cocultivo NK-DC Fig 11. Efecto de CCH sobre la secreción de interleuquinas en cocultivos NK/DC. Secreción de IL12 e INFγ determinada por ELISA, en cocultivos NK/DC, incubados y preincubados con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml). A. La secreción de IL12 muestra una tendencia al aumento en los cocultivos pretratados con CCH, siendo significativo a las 24 h con contacto celular (C) y a las 48 h sin contacto celular (T), en comparación a los controles. Datos obtenidos de 3 experimentos independientes B. La secreción de INFγ muestra un comportamiento similar al observado para IL12. Datos obtenidos de 2 experimentos independientes. En ambos casos el LPS gatilla una fuerte secreción antes de las 24 h, que se mantiene en el tiempo. IL12 es secretada sólo por las DCs e INFγ es secretado sólo por las células NK, de acuerdo a lo descrito en la literatura. 40

51 6. Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas, in vivo e in vitro. Para determinar si la extrema inmunogenicidad de CCH se debe a su gran tamaño y/o a la presencia de azúcares en su estructura, se analizó la respuesta inmune humoral de ratones contra la proteína y sus subunidades desglicosiladas (denotadas como CCH-D, CCHA-D y CCHB-D), y también se midió su efecto sobre la secreción la IL12 en cultivos de DCs in vitro. Como control se usaron las mismas proteínas en forma nativa. Las proteínas fueron desglicosiladas mediante un protocolo químico, usando Peryodato de sodio, y otro enzimático, usando PNGasa F (ver Métodos 11.1 y 11.2), porque cortan en diferentes sitios las cadenas de oligosacáridos. Posteriormente, las proteínas tratadas se analizaron mediante geles de diversa naturaleza y también se observó su estructura mediante MET utilizando tinción negativa. Al analizar las proteínas desglicosiladas químicamente mediante electroforesis en geles nativos de agarosa al 1,5%, se observó que este tratamiento produce cambios en su migración, pero aparentemente estas conservan su estructura cuaternaria. Al realizar geles SDS-PAGE en condiciones reductoras, las proteínas desglicosiladas no entraron al gel, sugiriendo su agregación. Sin embargo, esto no fue corroborado al observar las proteínas por MET con tinción negativa, porque no se observó diferencias entre las desglicosiladas y los controles. (Fig 12A y 12C). En el caso de la desglicosilación enzimática, para confirmar si el tratamiento enzimático con PNGasa fue efectivo, realizamos el análisis en geles SDS-PAGE en condiciones reductoras. Una pérdida de azúcares se refleja en una pérdida de masa y por tanto, en una diferencia de la migración. Sin embargo, debido al gran tamaño de CCH, esta diferencia en la migración fue difícil de visualizar. Por esta razón, se usó como control positivo fetuína, glicoproteína que tiene una masa de azúcares en torno al 20% (Spiro y Bhoyroo, 1974). La mayor migración electroforética de la fetuína indica que la reacción enzimática de desglicosilación ha ocurrido. Por MET, se observó que, por efecto del protocolo nativo seguido para generar la desglicosilación enzimática, no se produjeron diferencias para CCH-D con respecto a CCH; en CCHA y CCHA-D se observó un cierto grado de polimerización, encontrándose moléculas que emulan la estructura de CCH parcialmente; en CCHB y CCHB-D, en cambió, se vio una polimerización lineal, que describen filamentos con forma de cinta en espiral. Estas polimerizaciones se apreciaron también en los controles, sugiriendo que ocurren en el tiempo, a partir del momento en que las subunidades fueron disociadas y aisladas hace más de 1 año (Fig 12B y 12C). 41

52 A CCH CCH-D CCHA CCHA-D CCHB CCHB-D CCHA CCHA-D CCH CCH-D CCHA CCHA-D CCHB CCHB-D CCHA CCHA-D STD CCHB CCHB-D CCHB CCHB-D B CCHB-D CCHB CCHA-D CCHA CCH-D CCH Fet D Fet STD C Control Tratamiento CCH CCHA CCHB Fig 12. Tratamiento de desglicosilación química y enzimática de CCH y sus subunidades. A. Desglicosilación química, gel nativo de agarosa al 1,5% (Izquierda), donde se aprecian cambios en la migración de las proteínas desglicosiladas. Gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras (Derecha), mostrando que las proteínas desglicosiladas no ingresaron al gel. B. Desglicosilación enzimática, gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras, donde la mayor migración de fetuína indica que la reacción de desglicosilación ocurrió. C. Microscopia electrónica de proteínas desglicosiladas y sus controles. Se observa que no hubo formación de agregados entre las proteínas por efecto del tratamiento. Las subunidades almacenadas en el tiempo (más de un año, a 4ºC) forman polímeros, de forma notable en CCHB. 42