Especialización en Bacteriología Clínica. María Rosa Viñas Servicio Enterobacterias INEI-ANLIS C.G.Malbrán

Transcripción

1 Especialización en Bacteriología Clínica Chaco, 7-8 de junio María Rosa Viñas Servicio Enterobacterias INEI-ANLIS C.G.Malbrán

2 Tribu I: ESCHERICHIEAE. Género: Escherichia Escherichia coli Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Escherichia vulneris Escherichia blattae Género: Shigella Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei

3 GÉNERO SHIGELLA * Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados, no móviles de la familia ENTEROBACTERIACEAE, tribu ESCHERIACHIEAE, no produce gas a partir de carbohidratos. El género se diferencia en cuatro especies y esta separación se basa en caracteres bioquímicos y antigénicos. Shigella dysenteriae, serogrupo A: 13 serotipos.(*) Shigella flexneri, serogrupo B: 8 serotipos. (*) Shigella boydii, serogrupo C: 20 serotipos. (*) Shigella sonnei, serogrupo D: 1 serotipo. (*) La cantidad de serotipos por grupo cambia cuando se definen nuevos serotipos.

4 Infección por Shigella spp. La shigellosis está distribuída en todo el mundo, endémica en países tropicales y de clima templado incidencia en verano. Riesgo para viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas. Brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento como cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella: único huésped al ser humano y a los primates. Se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral o por alimentos contaminados, el vector de transmisión son las moscas y/ o aguas estancadas. Altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de 10 a 100 organismos.

5 SHIGELLOSIS PRESENTACION CLINICA Diarrea acuosa asociada con vómitos y deshidratación leve a moderada. Disentería caracterizada por pequeños volúmenes de materia fecal con sangre, mucus y dolor abdominal. Disentería: consecuencia de la invasión de la mucosa colónica, multiplicación y muerte celular, inflamación y ulceración de la mucosa con la consiguiente aparición de sangre en materia fecal. Complicaciones posteriores a una Shigellosis : bacteriemia, convulsiones y problemas neurológicos, artritis reactiva (en pacientes inmunocomprometidos: niños, ancianos) y Sindrome urémico hemolítico que se presenta en niños infección por Sh. dysenteriae serotipo 1: tasa de letalidad del 20%

6 GENE GLOBE PATHWAYS INVASION POR SHIGELLA

7 FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO DE Shigella (Muestra clínica) Observación en fresco MUESTRA (Hisopo en Cary Blair) Coloración de Gram Suspensión salina MacConkey, EMB, SS, Hektoen, XLD Colonias típicas TSA TSI LIA P. Bioquímicas Serotipificación

8 Métodos rápidos: Ensayos de PCR estandarizados para Shigella spp. Nombre de la Técnica PCR Shigella spp. / EIEC (E. coli enteroinvasivo) Blanco Método Tipo de muestra Requerimientos. Tiempo de procesamiento ipah ( Antígeno plasmídico de invasión) (Hartman et al,1990) PCR simple Prueba de tamizaje Muestras de agua y cepa aislada Detección en muestras de agua a partir de caldo de enriquecimiento GN, luego de 18 h de incubación a 37 C Detección preliminar del aislamiento a partir de TSA, luego de 24 h de incubación a 37 C Especificidad / Sensibilidad E: Shigella spp. /EIEC

9 El género Shigella es un género bioquimicamente poco reactivo; presenta las propiedades indicadas en TABLA IV. Las placas de medio selectivos y diferenciales : agar McConkey y agar EMB a 37ºC, 18 a 24 horas. Las colonias características, se siembran en estría de TSA, TSI y LIA, a 37ºC, 18 a 24 hs. TSI: -K/A, LIA: -K/A Prueba Bioquimica Shigella spp. SH2 - Glucosa (gas) - Glucosa (ácido) + Movilidad - Citrato Simmons - Adonita (fermentación) - Malonato (utilización) - Voges-Proskauer - Arginina dehidrolasa - Lisina decarboxilasa - Ornitina decarboxilasa - ó + (S. sonnei) Salicina (fermentación) - Lactosa (fermentación) - Urea (hidrólisis) - Sacarosa (fermentación) - Xilosa (fermentación) - Fenilalanina deaminasa - Inosita (fermentación) - Rojo de metilo % o más en 1-2 días; % o más en 1-2 días

10 ATIPIAS TSI alcalino/ácido sin gas, LIA alcalino/ácido, SIM (- v -), acetato negativo, urea negativa, se realiza la serología para Shigella. (pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a 100º C). TSI alcalino/ácido con gas, LIA alcalino/ácido, SIM (- - -), acetato negativo, urea negativa, se debe realizar serología para Shigella, porque hay ciertos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh flexneri y Sh. boydii que pueden producir gas a partir de glucosa. Shigella sonnei ONPG negativas, lactosa -

11 TABLA V. Caracteres Bioquímicos Diferenciales entre Especies de Shigella spp. Especie D-Manitol ONPG Ornitina decarboxilasa *Sh. dysenteriae **Sh. flexneri ***Sh. sonnei Sh. boydii * S. dysenteriae 1 son ONPG +, ** S. flexneri se caracterizan por fermentar manitol, S. flexneri 4 y 6 más comunes entre variedades S. flexneri manitol-negativo, *** S. sonnei ONPG Utilización de Azúcares, pruebas orientativas para la diferenciación a nivel de especie de Shigella spp.: Dulcita, Xilosa, Ramnosa, Rafinosa y Glicerol (Tabla con % ) Ej. S. boydii utiliza xilosa ó ducitol, glicerol S sonnei utiliza rafinosa, rhamnosa, permite diferenciar de otros subgrupos ó especies

12 TABLA VI. Caracteres Bioquímicos Diferenciales entre Shigella y E. coli. Prueba Bioquímica Shigella Escherichia coli Indol - o + + Lisina decarboxilasa - +, (+), - Ornitina decarboxilasa - o + +, (+), - Arginina dehidrolasa -, +, (+) (+), +, - Mucato (utilización) - + Acetato (utilización) - +, (+) Citrato Christensen - +, (+), - Glucosa (gas) - + Lactosa (fermentación) -, (+) + Sacarosa (fermentación) -, (+) +, (+), - Salicina (fermentación) - +, (+), - Movilidad - + ó % o más en 1-2 días; (+) luego de 3 o más días; - 90% o más, + o mayoría de cepas positiva, - o + mayoría de cepas negativa Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae, 4th. Edition

13 * Las pruebas del acetato y mucato tienen considerable valor para diferenciar ambos géneros: Prueba Bioquímica *Shigella Escherichia coli **Escherichia coli inmóvil Acetato (utilización) ó - Mucato (utilización) ó - Glucosa c/gas SIM -, -, - -,+, + -,+, - ó -, -, - Citrato Christensen - - ó + + ó - + : 90% o más en 1-2 días; - : 90% o más, + o mayoría de cepas positiva, - o + mayoría de cepas negativa *S. flexneri 4a suele utilizar acetato como fuente de carbono positivo 2-7 días reacción débil ** biotipos E.coli no móviles anaerógenos, lactosa - en TSI : K/A similar a Shigella

14 FIGURA III. Flujograma de Serotipificación para Shigellaspp. Cepa con características bioquímicas de Shigella Estria en TSA Aglutinación con solución fisiológica Negativa Positiva Aglutinación con OShB Cepa rugosa Negativa Positiva Sh. flexneri(se prueban serotipos 1 a 6) Aglutinación con OShD Negativa Positiva Sh. sonnei Aglutinación con OShC Negativa Positiva Sh. boydii(se prueban serotipos indol + y - - Aglutinación con OShA Negativa Positiva Sh. dysenteriae(se prueban serotipos indol + y - Calentar (ver pág.13)

15 Probables Fuentes de Infección por Shigella spp. Transmisión persona a persona (vía fecal- oral), alimentos contaminados ej. vegetales crudos (vector las moscas), manipuladores de alimentos y aguas contaminadas. Shigella spp. causa infección intestinal aguda en niños, viajeros, inmunocomprometidos y asociados a brotes en condiciones de déficit de saneamiento,y estudios epidemiológicos señalan al agua como fuente de infección Sobrevida en el agua es limitada (hs a días), dependiendo de la cantidad de contaminación, temperatura del agua (suceptible a clorinación, luz UV ) Requerimiento de Técnicas sensibles para la detección en muestras de agua

16 Detección de Shigella spp. en agua por PCR: Ensayo experimental

17 Flujograma de aislamiento de Shigella spp. a partir de agua Ensayo experimental (basado en BAM- FDA) Filtrado a través 0.22 um * 50 ml de muestra de agua mineral inoculadas experimentalmente con UFC de Shigella spp. Filtros ml caldo Enriquecimiento Shigella Broth GN ó equivalente 1 ml caldo, centrifugar y llevar a 500 ul de agua calidad molecular Extracción de ADN por hervido Incubar 37 ±1 C ON Agar MC ó equivalente > colonia sospechosas PCR ipah Identificación bioquímica y serotipificación Identificación de Shigella spp./e. coli (EIEC) * Recomendable filtrar 3 ó más litros de agua para concentrar

18 CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO para Alimento (BAM-FDA) Caldo Shigella: con o sin novobiocina. Shigella Broth: Tryptone, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, Glucose, Tween 80, Distilled water. Caldo GN: desarrollado para gram negativos, pero no es específico para Shigella aunque favorece su desarrollo. Caldo GN (Gram negativos) Phosphate-buffered tryptone glucose broth;

19 AISLAMIENTO DE SHIGELLA spp. DE ALIMENTOS 25 gr MUESTRA 225 ml Shigella Broth (novobiocina 0.5ug/ml para S. sonnei) 225 ml Shigella Broth (novobiocina3ug/ml Shigella spp.) Incub. 20 hs, 44ºC Aislamiento en Medio selectivo: MacConkey ó equivalente Colonias típicas Incub 20 hs,. 42ºC TSI, LIA, Caldo glucosa, movilidad, TSA Pruebas para: movilidad; SH 2 ; prod. gas; ferm. sacarosa y lactosa; indol. DESCARTAR FOOD AND DRUG ADMINISTRATION P. Bioquímicas - Serotipificación

20 Vigilancia desde el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) - En el período , 2324 aislamientos de Shigella spp. remitidos Figura 1: Distribución de los serogrupos de Shigella flexneri 73,0% Shigella spp. ( ) Shigella boydii 1,7% Shigella sonnei 24,5% Shigella dysenteriae 0,8% - Sh. flexneri es el serogrupo prevalente, con 1695 aislamientos (73.0%), seguido por Sh. sonnei con 569 (24.5%) y en muy baja proporción por Sh. boydii 40 (1.7%) y Sh. dysenteriae 19 (0.8%) (Figura 1). Se mantiene la prevalencia de Sh. flexneri y Sh. sonnei, como ocurre en Argentina, desde la década de los años 90. Sh. flexneri el serotipo 2 sigue siendo el más frecuente y los serotipos 3 y 1. Es de destacar la presencia de aisl, de Sh. flexneri no tipificables. Sh. boydii y Sh. dysenteriae, serogrupos muy poco frecuentes en el país. A pesar de la subnotificación de casos de shigelosis, se observa que Shigella spp. continúa siendo un enteropatógeno que representa un riesgo de importancia para la salud pública en nuestro país.

21 SNVS y SIVILA Vigilancia de diarreas Notificación de casos de diarreas estudiados por laboratorios de todo el país durante años 2010 (98 lab), 2011 (137 lab) y 2012 (85 lab hasta SE13sobre un total muestras estudiadas(fig. 1). El patógeno más frecuentemente aislado fue Shigella. P o rc e n ta je P o s itiv o s 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% Porcentaje de Pruebas positivas por agente etiológico bacteriano según SE. Total país. Periodo y 2012 (SE 13). Porcentaje total de positividad: 17,6% % Positivos para Campylobacter % Positivos para E coli % Positivos para Vibrio cholera % Positivos para Salmonella % Positivos para Shigella % Positivos bacterianas ` Fig. 1. Porcentaje de positividad general y para cada agente etiológico por SE 0% Semana Epidemiologica

22 Sobre un total de 1752 aislamientos de Shigella spp , en concordancia con lo notificado a SIVILA: se observó predominio de S. flexneri (73%), seguido por S. sonnei (24%), con variaciones en la distribución de estos serogrupos en diferentes regiones y a través del tiempo. Se observó un aumento de S. flexneri atípica* AA479 en 2011 (33%) en relación a 2010 (30%). Detección y caracterización de Shigella flexneri atípica : se identificó un grupo de aislamientos de S. flexneri atípicos que no podían clasificarse en ninguno de los serotipos conocidos, presentarndo aglutinación con el antisuero IV Denka Seiken y con los factores grupales 7,8 pero no con el antisuero IV del INPB-ANLIS Carlos G. Malbrán. El INPB produjo un antisuero policlonal para detección de esta variante, que se ha diseminado en todo el país desde su identificación inicial en en 2009.

23 VIGILANCIA DESDE EL LRN Desde 2009 el LRN observó un aumento de aislamientos de S. flexneri que no pudieron ser clasificados dentro de los serotipos reconocidos internacionalmente.

24 Vigilancia del LRN: S. flexneri atípicas: 1,7% en 2008 y 16% en 2009, reconocidos por 1ra vez en tres provincias y luego en el resto del país alcanzando un 30,4% en Distribución de serotipos de S. flexneri LNR, Enero 2007 a Diciembre 2010 N Aislamientos de Shigella flexneri Serotipos de S. flexneri S. flexneri atípicas S. flexneri 2 S. flexneri 3 S. flexneri S. flexneri 6 S. flexneri 4, 5, X e Y Caracterizar feno-genotípicamente una selección de aislamientos de S.flexneri atípicos emergentes en Argentina y estudiar el comportamiento epidemiológico de esta variante desde su reconocimiento en el país.

25 Caracterización feno-genotípica de una selección de S. flexneri atípicas? Caracterización fenotípica Car. genotípica PCR m1 m2 S. flexneri Serotype Typing S. flexneri IV sera (INPB) Typing S. flexneri IV sera (DS) Study of agglutination assay with: Grouping 3,4 sera (INPB & DS) Grouping 6 sera (INPB & DS) Grouping 7,8 sera (INPB & DS) AA479 antisera MASF IV-1 antisera Biochemical assays: Acetate / mannitol / Indol Resistant to: AMP-SXT Results of PCR a ssays gtriv gtrx set1-b sen 4a / + / - S / S a / + / - S / S a / - / + R / R Y / + / - S / S Y NR - / + /- S / R Y / + /- S / S X / + /- R / R X / + /- R / R - + atypical NR - / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical NR - / + / + R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical / + / + R / R - + atypical / + / + R / R - + atypical NR - / + / - S / S - + atypical NR - / + / - R / R - + atypical NR - / + / - R / R - + atypical NR - / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical NR - / + / - R / R - + atypical / + / - R / R - + atypical NR - / + / - R / R NR: no determinado Mab MASF IV-1, Dr Kaisar Talukder, icddr,bangladesh

26 Diapositiva 25 m1 mpichel, 03/06/2013 m2 mpichel, 03/06/2013

27 S. flexneri atípicas análisis PFGE PFGE- NotI: relación genética de aislamientos de S. flexneri atípicos y cepas de serotipos variantes X, Y and tipo 4. Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] PFGE-NotI PFGE-NotI Isolate State Isolate Date NotI-PFGE pattern S. flexneri serotype SF461/10 SF478/09 SF564/09 SF66/10 SF1241/10 SF412/09 SF1460/10 SF612/10 SF617/10 SF493/09 SF479/09 SF571/09 SF2080/09 SF730/09 SFB67X-1 SF1004/09 SF465/10 SF294/09 SF743/09 SFB4a-1 SF472/09 SFB69Y-1 SF2029/09 SFB4a-6 SF1944/06. CABA Jujuy Jujuy Salta Río Negro Río Negro Río Negro Río Negro ND Tucumán Jujuy Buenos Aires La Pampa ND La Pampa ND Río Negro ND ARJZXN ARJZXN ARJZXN ARJZXN ARJZXN ARJZXN ARJZXN ARJZXN Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical ARJZXN Atypical ARJZXN Atypical 2009 ARJZXN Atypical 2009 ARJZXN Atypical 2009 ARJZXN Atypical ARJZXN X variant ND ARJZXN X variant ARJZXN Atypical ARJZXN Atypical 2009 ARJZXN Atypical ARJZXN Atypical ND ARJZXN a ARJZXN Y variant ND ARJZXN Y variant ARJZXN Y variant ND ARJZXN a 2006 ARJZXN a

28 Conclusiones y Desafios futuros Los resultados sugieren la emergencia de una variante de S. flexneri variante X, semejante a lo observado en China (Ye et al, JCM 2010). La relación genética determinada entre los aisl. señala su diseminación. La distribución del antisuero AA479 a la RD y PTA facilitó la detección de nuevos casos y brotes. Se destaca la necesidad de evaluar y actualizar el esquema vigente de serotipificación de Shigella Acuerdos de estudio y grupos de trabajo en Shigella International Meeting,Mayo, Bs As, Argentina Fortalecer la vigilancia, diagnóstico, control y prevención de las infecciones por Shigella spp.

29 Se notificaron al LRN : Brotes: 5 de Shigella sonnei y 2 de Shigella flexneri Se implementó un estudio prospectivo para detección temprana de brotes en colaboración con la Universidad de Harvard, USA (Proyecto MIDAS) en seis provincias de la región centro-sur. En se detectaron e investigaron 17 señales de alerta, 14 de las cuales fueron confirmadas por PFGE y/o estudios epidemiológicos.

30 Análisis por PFGE de aislamientos de Shigella flexneri asociado a un brote en, Argentina en el marco del Proyecto MIDAS (incluyendo pacientes de Argentina y Chile) Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] PFGE-No PFGE-NotI 100 Aislam. Provincia Ciudad Fecha aisl. Serotipo Shigella Sf415/ Shigella flexneri 3 Sf416/ Shigella flexneri 3 Sf417/ Shigella flexneri 3 Sf418/ Shigella flexneri 3 Sf419/ Shigella flexneri 3 Sf420/ Shigella flexneri 3 Sf421/11 Centenario Shigella flexneri 3 Dendograma de relación genética de aislamientos de S. flexneri 3 de (febrero 2011) PFGE con NotI. Patrón nuevo en la BDN y evento regional comunicado en el marco de la Red PulseNet América Latina y El Caribe; y según el Reglamento Sanitario Internacional.

31 FIGURE 2. Dendrogram showing the degree of genetic relatedness S. sonnei SXT isolates included in Event 7 (January February 2010 in La Pampa). The rectangle highlights 7 S. sonnei isolates from Event 7 with an indistinguishable PFGE pattern which had not previously been recorded in the National Data Base (NDB). The remaining 7 S. sonnei isolates identified statistically and epidemiologically as part of Event 7, exhibited high genetic relatedness (from 91.4 to 97.4% similarity) to the most frequent pattern within the event, confirming the relation of the cases. Isolate Province Date of isolate

32 S. sonnei asociados al brote familiar: estudio por PFGE demostraron la relación genética de los aislamientos, confirmando la ocurrencia de los casos por la exposición de los pacientes a una misma fuente de infección : cubierta de crema de almendras (una rosca vienesa de elaboración artesanal) PPFG E-XbaI Nº aislamiento Ciudad Origen F. aislamiento Patrón XbaI SS1392/12 SS1393/12 SS1394/12 Lujan Lujan Lujan Human Human Human ARJ16X ARJ16X ARJ16X SS1395/12 Lujan Human ARJ16X SS1396/12 Lujan Human ARJ16X SS1397/12 Lujan Food ARJ16X Figura 1. Dendograma de relación genética de aislamientos de S. sonnei recuperados en Luján en julio de 2012 con XbaI. Todos los aislamientos mostraron 100% de similitud. Esto fue posible por la oportunidad en la investigación del brote y en la toma de muestras

33 Resistencia a antimicrobianos Red WHONET-ARG ( ) 2011) % de NS en Shigella spp. Red WHONET-Arg Años (N=5.052) % AMP SXT NAL CIP NIT FOS ESBL Antibiótico Shigella spp (N=5052): 67% de resistencia (R) a ampicilina (AMP), 55% R a trimetoprima/sulfametoxazol (SXT) en 5052 aislamientos Fenotipos inusuales determinados en el LNR: 7 Shigellas spp. con AmpC plasmídico tipo CIT; y 3 Shigellas spp con fenotipo de betalactamasa de espectro extendido CTX-M y PER. Shigella spp: porcentaje de resistencia, 2010 CIP NAL AMP C3G FOS CHL SXT NIT 5µg 30µg 10µg 30µg 50µg 30µg 1.25/23. 75µg 300µg Especie Nº I R I R I R I R I R I R I R I R S. sonnei ,2 0 0,5 0,3 21-0,2 0 0,2 NT NT ,2 S. flexneri ,1 0 0,2 0,5 0,4 82-0,1 0 0,1 NT NT ,3 0,1

34 GFN (WHO-Global Foodborne Infections Network), Aislamientos de Shigella spp. origen humano Distribución de Shigella spp S. sonnei S. flexneri S. boydii S. dysenteriae (12) Otras Na: Número total de aislamientos: (100%) Ns: Número total de aislamientos serotipificados: (98,5%) Países que reportaron datos: Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Ecuador, Paraguay, Perú y Venezuela.

35 Conclusiones Incidencia de casos como primer agente de origen bacteriano (SIVILA) y asociado a brotes, mejorar la detección de fuente de infección con técnicas sensibles. En el marco de la Red de Diarreas uso del En el marco de la Red de Diarreas uso del antisuero AA479 como screening de este nuevo subserotipo de S. flexneri cuya sero -prevalencia aumentó en el país en los últimos años.

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