UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES NUCLEARES FACULTAD DE MEDICINA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES NUCLEARES FACULTAD DE MEDICINA ININ EFECTO DEL PÉPTIDO TAT(49-57) SOBRE LA BIODISTRIBUCIÓN Y DOSIMETRÍA DE RADIOFÁRMACOS ANÁLOGOS DE LA BOMBESINA T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FÍSICA MÉDICA P R E S E N T A CLARA LETICIA SANTOS CUEVAS Directoras de Tesis: Dra. Guillermina Ferro Flores Dra. Eva Leticia Rojas Calderón TOLUCA, MÉXICO JUNIO 2011

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3 AGRADECIMIENTOS y RECONOCIMIENTOS El presente trabajo se realizó en el Departamento de Materiales Radiactivos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, bajo la dirección y tutoría de la Dra. Guillermina Ferro Flores, con el apoyo financiero de CONACyT (Proyecto: CONACYT- SALUD Mexico) y de la Agencia Internacional de Energía Atómica (Contrato No /RO). A la Dra. Guillermina Ferro Flores del Departamento de Materiales Radiactivos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por todo su apoyo en la realización de este proyecto. A la co-dirección de la Dra. Eva Leticia Rojas Calderón de la Gerencia de Ciencias Ambientales del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por las asesorías en el tema de la simulación por el método Monte Carlo Al comité doctoral, Dras. Consuelo Arteaga de Murphy y Martha Pedraza López, del Departamento de Radiofarmacia del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán por las facilidades prestadas para la realización de este trabajo. A la Dra. Rocío García Becerra y al Lic. David Ordaz Rosado del Departamento de Biología de la Reproducción del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán por su ayuda y aportaciones en el área biológica. A la Dra. Flor de M. Ramírez de la Cruz del Departamento de Química del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por su colaboración en el diseño de los radiofármacos desarrollados en esta tesis. A los miembros del jurado Drs. Guillermina Ferro Flores, Consuelo Arteaga de Murphy, Rocío García Becerra, Jeanette Rodríguez Cortés, Fernando Ureña Núñez, Eugenio Torres García y Miguel Angel Camacho López por sus valiosas aportaciones Al Posgrado en Ciencias con Especialidad en Física Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma del Estado de México.

4 ÍNDICE Resumen Abstract i iii CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Introducción Objetivo General Objetivos Específicos Referencias 6 CAPÍTULO 2: MARCO TEÓRICO Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo Análogos de la somatostatina Análogos del péptido liberador de la gastrina Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y 21 receptores de gastrina Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores 21 de angiogénesis tumoral Péptidos ligantes para receptores de neurotensina Péptidos de internalización Tat Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen 24 óptica Fluorocromos de infrarrojo cercano Quantum Dots Nanopartículas de oro Sistemas multifuncionales con nanopartículas de óxido de hierro conjugadas a péptidos para imagen por resonancia magnética Péptidos para imagen molecular con técnicas multimodales Radioterapia de blancos moleculares 32

5 Proceso Auger Efecto Auger en la terapia de blancos moleculares Rango de las partículas y proximidad al ADN Muerte celular inducida por radiación El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida La necrosis en la radioterapia dirigida La catástrofe mitótica inducida por radiación Cuantificación del efecto Auger Metodología de cálculo de dosis absorbida de radiación Sistema MIRD para cálculo de dosis interna Modelos radiofarmacocinéticos Modelos Empíricos Modelos Analíticos Modelos Compartimentales Dosimetría celular Esquema MIRD celular Simulación Monte Carlo Códigos de simulación del transporte de radiación Código de simulación Monte Carlo PENELOPE Geometría del sistema Definición de materiales Descripción del programa principal Microdosimetría Referencias 66

6 CAPÍTULO 3: MARCO METODOLÓGICO Obtención de los radioconjugados [ 99m Tc]EDDA/HYNIC-Lys 3 -BN ( 99m Tc-BN), [ 99m Tc]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 99m Tc-Tat-BN) y [ 188 Re]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 188 Re-Tat-BN) Síntesis de HYNIC-Lys 3 -BN Síntesis de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN Modelado Molecular Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys 3 -BN con 99m Tc Procedimiento de radiomarcado de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN con 99m Tc Procedimiento de radiomarcado de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN con 188 Re Evaluación de la pureza radioquímica de 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN Estabilidad en suero humano Desafío a la cisteina Pruebas in vitro Líneas celulares Prueba de internalización y unión no específica Internalización nuclear de 99m Tc-Tat-BN Modelo Biocinético Análisis estadístico Localización in vitro de Tat-BN internalizado en células de cáncer por inmunocitoquímica Efecto del 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular Pruebas in vivo Estudios de biodistribución 89

7 Inducción de tumores en ratones atímicos Imágenes Dosimetría subcelular Referencias 94 CAPÍTULO 4: RESULTADOS 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-BN Diseño y preparación HYNIC-Lys 3 -BN N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN Modelaje Molecular: Diseño de (Acm) 2 -S 2 N 2 -Tat-Lys 3 -BN, Tc(O)S 2 N 2 -Tat-Lys 3 -BN por cálulos semiempíricos 4.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 99m Tc-Tat-BN) Estabilidad en suero de 99m Tc-Tat-BN Desafío a la cisteina Pruebas in vitro Captación in vitro de 99m Tc-Tat-BN Internalización celular de 99m Tc-Tat-BN Biodistribución subcelular de 99m Tc-Tat-BN Modelos biocinéticos subcelulares de 99m Tc-Tat-BN Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de cáncer por inmunocitoquímica Efecto del 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular Pruebas in vivo Estudios de Biodistribución in vivo de 99m Tc-Tat-BN Imágenes de ratónes atímicos con tumores inducidos PC Dosis absorbida celular de 99m Tc-Tat-BN 119

8 Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células PC Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células MCF Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células MDA- MB Resumen de dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer Discusión y conclusiones Referencias 133 CAPÍTULO 5. RESULTADOS 188 Re-N 2 S 2 -Tat(49-57)-BN Diseño y preparación Modelaje Molecular: Diseño de Re(O) 2S 2 N 2 -Tat-Lys 3 -BN por cálculos semiempíricos 5.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 188 Re-N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN (188Re-Tat-BN) Estabilidad en suero humano de 188 Re-Tat-BN Desafío a la cisteina Pruebas in vitro Captación in vitro de 188 Re-Tat-BN Internalización celular de 188 Re-Tat-BN Biodistribución subcelular de 188 Re-Tat-BN Modelos biocinéticos subcelulares de 188 Re-Tat-BN Pruebas in vivo Estudios de Biodistribución in vivo de 188 Re-Tat-BN Dosis absorbida celular de 188 Re-Tat-BN Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células PC Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células MCF Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células MDA- MB

9 Resumen de dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en 158 células de cáncer 5.9. Discusión y conclusiones Referencias 166 CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES GENERALES Y TRABAJO A 169 FUTURO 6.1 Conclusiones generales Relevancia y trabajo a futuro 173 ANEXOS Santos-Cuevas CL, Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Ramírez Fde M, Luna-Gutiérrez MA, Pedraza-López M, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D. Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)- bombesin: a target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int J Pharm Jun 22;375(1-2): Ferro-Flores G, Ramírez Fde M, Meléndez-Alafort L, Santos-Cuevas CL. Peptides for in vivo target-specific cancer imaging. Mini Rev Med Chem Jan;10(1): Santos-Cuevas CL, Ferro-Flores G, Rojas-Calderón EL, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D, Arteaga de Murphy C, Pedraza-López M. 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-bombesin internalized in nuclei of prostate and breast cancer cells: kinetics, dosimetry and effect on cellular proliferation. Nucl Med Commun Apr;32(4): Registro de patente: Clara Leticia Santos-Cuevas, Guillermina Ferro- Flores, Flor de María Ramírez de la Cruz 99m Tc-Tat-Bombesina como un nuevo radiofármaco para la detección temprana de cáncer de mama. MX/a/2010/ Registrada.

10 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de infrarrojo cercano o radionúclidos. Figura 2 Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN (E= 105 Kcal/mol). Figura 3 Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos. Figura 4 Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de µm y mm respectivamente. Figura 5 Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K. Figura 6 Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía depositada al ADN se reduce significativamente. Figura 7 Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha) Figura 8 Estructura de la molécula HYNIC-Lys 3 -BN. 96 Figura 9 Estructura de la molécula N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN. 97 Figura 10 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N 2 S 2 -Tat(49-57)- Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Tc(O): [Tc(O)N 2 S 2 ]. 100

11 Figura 11 (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-uv 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99m Tc-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado. Figura 12 Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99m Tc-Tat-BN recién marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente). Figura 13 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 99m Tc-N 2 S 2 - Tat(49-57)-Lys 3 -BN después de incubarlo en suero humano a 37 C durante 2 h. Figura 14 Internalización dependiente del tiempo de 99m Tc-Tat- BN y 99m Tc-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C). Figura 15 Biocinética del 99m Tc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C). Figura 16 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. Figura 17 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. Figura 18 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MDA-MB231. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. Figura 19 Efecto del Tat-BN y 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN (ng/ml)

12 Figura 20 Captación de (A) 99m Tc-Tat-BN y (B) en tumores inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos. 118 Figura 21 Estructura de la molécula N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN. 137 Figura 22 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Re(O)N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Re(O): [Re(O)N 2 S 2 ]. Figura 23 Influencia de la concentración del péptido sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (ph=3, [tartrato] = 106 mg/ml, [ácido ascórbico] = 4.35 mg/ml, 18 C). Figura 24 Influencia de la concentración de ácido ascórbico sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (ph=3, [tartrato] = 106 mg/ml, 18 C). Figura 25 (A) HPLC de exclusion molecular, se representa el cromatrograma-uv 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 188 Re-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado. Figura 26 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 188 Re-Tat-BN después de incubarlo en suero humano a 37 C durante 2 h. Figura 27 Internalización dependiente del tiempo de 188 Re-Tat- BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA- MB231 (C). Figura 28 Biocinética del 188 Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA- MB231 (C)

13 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Incidencia y distribución de GRPr en carcinomas de mama primarios. Tabla 2 Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos terapéuticos Tabla 3 Ejemplos de emisores de electrones Auger. 38 Tabla 4 Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores de electrones Auger. 39 Tabla 5 Características de las rutas de muerte celular. 44 Tabla 6 Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con 188 Re. 82 Tabla 7 Gradiente de concentración de la fase móvil. 83 Tabla 8 Geometría y volumen de citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Tabla 9 Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo. Tabla 10 Espectro de radiación promedio del 99m Tc utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo. Tabla 11 Espectro de radiación promedio del 188 Re utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo. Tabla 12 Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N 2 S 2 -Tat-Lys 3 -BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex. Tabla 13 Captación celular de 99m Tc-Tat-BN y 99m Tc-BN en diferentes líneas de cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)). Tabla 14 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer PC3. Tabla 15 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer MCF7. Tabla 16 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB

14 Tabla 17 Biodistribución del 99m Tc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo). Tabla 18 Biodistribución de 99m Tc-BN y 99m Tc-Tat-BN en ratones atímicos con tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos (n=3) Tabla 19 Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células PC Tabla 20 Dosis absorbida de electrones de CI y Auger del Tc en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. Tabla 21 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99m Tc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo Tabla 22 Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células MCF Tabla 23 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99m Tc en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. Tabla 24 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99m Tc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo. Tabla 25 Dosis absorbida de 99m Tc-Tat-BN en células MDA- MB23. Tabla 26 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99m Tc en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. Tabla 27 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99m Tc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo. Tabla 28 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 99m Tc-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer

15 Tabla 29 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de electrones CI y Auger de Tc. Tabla 30 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de electrones CI y Auger de 99m Tc en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Tabla 31 Distancias de enlace del los complejos calculado Re(O)-N 2 S 2 -Tat-Lys 3 -BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y CONFLEX. Tabla 32 Captación celular de 188 Re-Tat-BN en las líneas celulares de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (% del total de actividad ± DS). Tabla 33 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188 Re-Tat-BN en células de cáncer PC3. Tabla 34 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188 Re-Tat-BN en células de cáncer MCF7. Tabla 35 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188 Re-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231. Tabla 36 Biodistribución de 188 Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo) Tabla 37 Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células PC Tabla 38 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188 Re en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. Tabla 39 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188 Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo Tabla 40 Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células MCF Tabla 41 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188 Re en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. 156

16 Tabla 42 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188 Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo. Tabla 43 Dosis absorbida de 188 Re-Tat-BN en células MDA- MB231. Tabla 44 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188 Re en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación. Tabla 45 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188 Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo. Tabla 46 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 188 Re-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer. Tabla 47 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de radiación β, electrones CI y Auger de 188 Re. Tabla 48 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de radiación β, electrones CI y Auger de Re en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB

17 Capítulo 1 Introducción y Objetivos 1

18 1. 1. Introducción Las técnicas de obtención de imágenes moleculares, directa o indirectamente, monitorean y registran la distribución espacio-temporal de procesos moleculares o celulares para aplicaciones bioquímicas, biológicas, diagnósticas o terapéuticas. En el caso de la medicina nuclear, el blanco molecular debe unirse a una sustancia radiomarcada (radiofármaco) de forma altamente específica. Las moléculas bioactivas radiomarcadas que se unen a receptores específicos pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos, análogos de DNA y oligonucleótidos antisentido (antisense), entre otros [1]. En los últimos años se ha demostrado la utilidad diagnóstica de los péptidos radiomarcados para la detección específica de diversas neoplasias, para ello se utilizan herramientas desarrolladas por la biología molecular pero con métodos aplicables in vivo [2-4]. El grupo de neuropéptidos llamados bombesinas (BN) comprende un gran número de péptidos originalmente aislados de la piel de batracios y estimulan las contracciones del músculo liso y regulan la temperatura. Posteriormente se encontró que además están ampliamente distribuidos en células neurales y endócrinas humanas [5,6]. Las principales BNs de origen mamífero son dos: el péptido liberador de la gastrina (GRP) y la neuromedina B (NMB). Los receptores del péptido liberador de la gastrina (GRPr) se encuentran distribuidos en muchos órganos pero se sobre-expresan en la membrana de las células malignas, especialmente las de cáncer de mama y de próstata y en las células de cáncer metastásicas a ganglios linfáticos axilares y pélvicos [7,8]. La BN se unen específicamente al GRPr y este enlace es el fundamento para marcar la BN con radionúclidos emisores de radiación gamma o positrones (Ej. 99m Tc, 111 In, 18 F) para la obtención in vivo de imágenes de los GRPr por técnicas de medicina nuclear molecular [6-9]. Es importante mencionar que 2

19 después de la interacción receptor-ligante (GRPr-BN) en la membrana celular, una parte del complejo es internalizado al citoplasma celular [10]. En el ámbito de la química de radiofármacos existe, el interés por desarrollar análogos de la BN marcados con 188 Re. El 188 Re es un radionúclido emisor de radiación gamma, útil en la obtención de imágenes gammagráficas, pero también es emisor de radiación β. Una biomolécula dirigida a un receptor específico de una célula de cáncer marcada con un radionúclido emisor de partículas β, tiene el potencial para ser utilizada en la radioterapia de blancos moleculares [11,12-14]. Idealmente un radiofármaco debería depurarse rápidamente de la sangre, acumularse en el sitio blanco y la radiactividad no unida a los sitios receptores eliminarse rápidamente por vía renal, tanto por razones dosimétricas como para mejorar el contraste de la imagen. La excreción hepatobiliar produce dosis absorbida de radiación innecesaria al paciente y aumenta la radiación de fondo que interfiere con la calidad de las imágenes. Los análogos de la BN marcados con 188 Re y la mayoría de los derivados radiomarcados con 111 In y 99m Tc hasta ahora reportados, presentan como vía principal de eliminación la excreción hepatobiliar, lo que hasta cierto punto ha limitado su aplicación en la práctica clínica [8,15-29, 12-14]. Evidentemente la diferencia en la lipofilia de los diferentes complejos está fuertemente influenciada por el compuesto o compuestos químicos que se utilicen en la esfera de coordinación del radiometal. Recientemente se reportó la preparación y evaluación preclínica del conjugado [ 99m Tc]EDDA/HYNIC-Lys 3 - BN ( 99m Tc-BN) como un radiofármaco con rápida depuración renal y específico para detectar a partir de una imagen gammagráfica, la expresión y sobreexpresión de proteínas GRPr [6]. El diagnóstico y tratamiento de enfermedades por nuevos mecanismos que involucren el transporte eficiente de fármacos a blancos moleculares específicos intracelulares es de grán interés en el ámbito médico-farmacéutico. 3

20 El dominio básico de la proteína Tat del VIH-1, es decir el Tat (49-57), es un péptido que penetra o atraviesa fácilmente la membrana celular por lo que, conjugado a diferentes fármacos, proteínas, péptidos y nanopartículas, actúa como un caballo de Troya al incrementar de forma significativa la internalización celular de los diferentes fármacos o biomoléculas [36-45]. Por lo tanto, un nuevo conjugado del tipo [ 99m Tc]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 99m Tc-Tat-BN) podría incrementar de manera significativa la internalización del radiofármaco y con ello el contraste de las lesiones cancerosas en las imágenes y mejoraría la sensibilidad y especificidad de los estudios diagnósticos. Si se considera que la internalización se incrementará, las emisiones de electrones Auger del 99m Tc, podrían jugar un papel fundamental en la energía depositada dentro de la célula (dosis de radiación absorbida) con un posible efecto sinérgico en la terapia del cáncer si se activan por ejemplo rutas apoptóticas. Por otro lado, si la biocinética y la especificidad de la Lys 3 - BN unida al Tat(49-57) es favorable, un conjugado del tipo [ 188 Re]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 188 Re-Tat-BN) podría ser potencialmente útil en radioterapia de blancos moleculares Objetivo General Preparar, caracterizar y comparar la cinética y dosimetría celular in vitro e in vivo de los radiofármacos de 99m Tc-BN y 99m Tc-Tat-BN como agentes de diagnóstico para la detección temprana y específica de cáncer de próstata y de mama por técnicas de imagenología en medicina nuclear molecular. Asimismo evaluar el potencial del radiofármaco 188 Re-Tat-BN como un posible agente para radioterapia de blancos moleculares. 4

21 1.3. Objetivos específicos 1. Obtener los radiofármacos 99m Tc-BN, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN con purezas radioquímicas mayores al 90 %. 2. Evaluar la estabilidad en suero humano y la unión a proteínas séricas mediante cromatografía líquida de alta eficiencia de los complejos 99m Tc-BN, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN. 3. Evaluar la captación específica in vitro de 99m Tc-BN, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN en células de cáncer de las líneas PC3 (próstata humano), MCF7 (mama humano) y MDA-MB231 (mama humano). 4. Evaluar la cinética de internalización in vitro de 99m Tc-BN, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB Estimar y comparar la dosimetría de los radiofármacos 99m Tc-BN y 99m Tc-Tat-BN por el método Monte Carlo empleando el código PENELOPE 2008 en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB231 a partir de los datos cinéticos experimentales. 6. Estimar la dosimetría del radiofármaco 188 Re-Tat-BN en células de cáncer por el método Monte Carlo (código PENELOPE 2008) a fin de calcular por simulación el potencial terapéutico de un conjugado de Lys 3 -BN radiomarcado con un emisor β. 7. Evaluar la biodistribución en ratones sanos BALB/c de los complejos 99m Tc-BN, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN. 8. Evaluar la biocinética de los complejos 99m Tc-BN y 99m Tc-Tat-BN en ratones atímicos con tumores inducidos con células PC3. 5

22 1.4. Referencias [1] Thakur M and Lentle BC. Report of a summit on molecular imaging. Radiology 236: (2005). [2] Van Den Bossche B and Van de Wiele C. Receptor imaging in oncology by means of nuclear medicine: Current status. J Clin Oncol 22: (2004). [3] Kwekkeboom DJ, Mueller-Brand J, Paganelli G, Anthony LB, Pauwels S, Kvols LK, O'dorisio TM, Valkema R, Bodei L, Chinol M, Maecke HR, Krenning EP. Overview of results of peptide receptor radionuclide therapy with 3 radiolabeled somatostatin analogs. J Nucl Med 46: 62S-66S (2005). [4] Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Melendez-Alafort L. Third generation radiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Current Pharm Anal 2: (2006). [5] Varvarigou A, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vincentis G. Synthesis, chemical, radiochemical and radiobiological evaluation of a new 99m Tclabelled bombesin-like peptide. Cancer Biother Radiopharm 17: (2002). [6] Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Rodríguez-Cortés J, Pedraza-López M, Ramírez-Iglesias MT. Preparation and Evaluation of 99m Tc-EDDA/HYNIC-[Lys 3 ]- Bombesin for Imaging of GRP Receptor-Positive Tumours. Nucl Med Commun 27: (2006). [7] Gugger M and Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in non-neoplastic and neoplastic human breast. Am J Pathol 155: (1999). [8] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD, Laurenti C, Iori F, Remediani S, Chiarini S, Stella S. 99m Tc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur J Nucl Med Mol Imaging 30: ( 2003). [9] Lin KS, Luu A, Baidoo KE, Hashemzadeh-Gargari H, Chen MK, Brenneman K, Pili R, Pomper M, Carducci MA, Wagner HN. A new high affinity technetium-99mbombesin analogue with low abdominal accumulation. Bioconjug Chem 16:43-50 (2005). [10] Reubi JC. Peptide receptors as molecular targets for cancer diagnosis and therapy. Endocrine Reviews 24: (2003). [11] Ferro-Flores G. and Arteaga de Murphy Consuelo, Pharmacokinetics and Dosimetry of 188 Re-based Targeted Radiotherapeutics, Advanced Drug Delivery Reviews, in press, (2007). [12] Smith CJ, Sieckman GL, Owen NK, Hayes DL, Mazuru DG, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiochemical investigations of [ 188 Re(H 2 O)(CO) 3 -diaminopropionic acid-sssbombesin(7-14)nh 2 ]: syntheses, radiolabeling and in vitro/in vivo GRP receptor targeting studies. Anticancer Res 23:63-70 (2003). [13] Moustapha ME, Ehrhardt GJ, Smith CJ, Szajek LP, EckelmanWC, Jurisson SS. Preparation of cyclotron-produced 186 Re and comparison with reactor-produced 186 Re and generator-produced 188 Re for the labeling of bombesin Nucl Med Biol 33:81-89 (2006). [14] Garcia-Garayoa E, Rüegg D, Bläuenstein P, Zwimpfer M, Khan IU, Maes V, Blanc A, Beck-Sickinger AG, Tourwé DA, Schubiger PA. Chemical and biological characterization of new Re(CO) 3 /[ 99m Tc](CO) 3 bombesin analogues. Nucl Med Biol 34:17-28 (2007). [15] Soluri A, Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou A, Scafe R, Massa R, Schillaci O, Spanu A, David V. 99mTc [LEU13]bombesin and a new gamma camera, the imaging probe, are able to guide mammotome breast biopsy. Anticancer Res 23: (2003). [16] Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, Schaer JC, Gugger M. Bombesin receptor subtypes in human cancers: detection with the universal radioligand 6

23 (125)I-[D-Tyr(6), beta-ala(11), Phe(13), Nle(14)] bombesin(6-14). Clin Cancer Res 8: (2002). [17] Hoffman TJ, Gali H, Smith CJ, Sieckman GL, Hayes DL, Owen NK, Volkert WA. Novel series of 111 In-labeled bombesin analogs as potential radiopharmaceuticals for specific targeting of gastrin-releasing peptide receptors expressed on human prostate cancer cells. J Nucl Med 44: (2003). [18] La Bella R, Garcia-Garayoa E, Langer M, Blauenstein P, Beck-Sickinger AG, Schubiger A. In vitro and in vivo evaluation of a 99m Tc(1)-labeled bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl Med Biol 29: (2002). [19] Scopinaro F, Varvarigou A, Ussof W. Breast cancer takes up 99mTc bombesin: A preliminary report. Tumori 88: S25-S28 (2002). [20] De Vincentis G, Scopinaro F, Varvarigou A. Phase I trial of technetium [Leu13] bombesin as cancer seeking agent: Possible scintigraphic guide for surgery. Tumori 88:S28-S30 (2002). [21] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD. Use of bombesin in humans. J Clin Oncology 23: (2005). [22] Alves S, Correia JD, Santos I, Veerendra B, Sieckman GL, Hoffman TJ, Rold TL, Figueroa SD, Retzloff L, McCrate J, Prasanphanich A, Smith CJ. Pyrazolyl conjugates of bombesin: a new tridentate ligand framework for the stabilization of fac-[m(co)3]+ moiety. Nucl Med Biol 33: (2006). [23] Kunstler JU, Veerendra B, Figueroa SD, Sieckman GL, Rold TL, Hoffman TJ, Smith CJ, Pietzsch HJ. Organometallic (99m)Tc(III) '4 + 1' Bombesin(7-14) Conjugates: Synthesis, Radiolabeling, and in Vitro/in Vivo Studies. Bioconjug Chem. [Epub ahead of print] (2007). [24] Faintuch BL, Santos RLSR, Souza ALF, Hoffman J, Greeley M, Smith CJ. 99mTc-Hynic-bombesin (7-14)NH2: Radiochemical evaluation with coligands EDDA (EDDA=ethylenediamine-N,N`-diaetic acid), tricine and nicotinic acid. Synt React Inorg Met-Org Nano-Met Chem 16: (2005). [25] Smith CJ, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiolabeled peptide conjugates for targeting of the bombesin receptor superfamily subtypes. Nucl Med Biol 32: (2005). [26] Zhang X, Cai W, Cao F, Schreibmann E, Wu Y, Wu JC, Xing L, Chen X. 18 F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J Nucl Med 47: (2006). [27] Wickline S. A., Neubauer A. M., Winter P. M., Caruthers S. D., and Lanza G. M., Molecular Imaging and Therapy of Atherosclerosis With Targeted Nanoparticles, Magn. Reson. Imaging 25: (2007). [28] Sharma P., Brown S., Walter G., Santra S., Moudgil B., Nanoparticles for bioimaging, Advances in Colloid and Interface Science : (2006) [29] Liu Y., Shipton M. K., Ryan J., Kaufman E. D., Franzen S., and Feldheim D. L., Synthesis, Stability, and Cellular Internalization of Gold Nanoparticles Containing Mixed Peptide-Poly(ethylene glycol) Monolayers, Anal. Chem., 79: (2007). [30] O Neal, D. P.; Hirsch, L. R.; Halas, N. J.; Payne, J. D.; West, J. L., Photo-thermal tumor ablation in mice using near infrared-absorbing nanoparticles, Cancer Letters, 209(2) : (2004). [31] Lewin, M.; Carlesso, N.; Tung, C. H.; Tang, X. W.; Cory, D.; Scadden, D. T.; Weissleder, R., Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells, Nature Biotechnology, 18, (2000). [32] Tkachenko A. G., Xie H., Coleman D., Glomm W., Ryan J., Anderson M. F., Franzen S., and Feldheim D. L., Multifunctional Gold Nanoparticle-Peptide 7

24 Complexes for Nuclear Targeting, Journal of American chemical society, 125: (2003). [33] Hogemann D., Ntziachristos V., Josephson L., and Weissleder R., High Throughput Magnetic Resonance Imaging for Evaluating Targeted Nanoparticle Probes, Bioconjugate Chem., 13: (2002). [34] Paciotti GF,Myer L,Weinreich D, Goia D, Pavel N, McLaughlin RE, Tamarkin L. Colloidal Gold: A Novel Nanoparticle Vector for Tumor Directed Drug Delivery, Drug Delivery,11(3): (2004). [35] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday,,2(3):14-21 (2007). [36] Dietz GP and Bähr M. Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Mol Cell Neurosci 27:85-131(2004). [37] Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci 16: (2005). [38] Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Interactions of primary amphipathic cell penetrating peptides with model membranes: consequences on the mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr Pharm Des 11: (2005) [39] Wadia JS, Dowdy SF. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer. Adv Drug Deliv Rev 57: (2005). [40] Koch AM, Reynolds F, Kircher MF, Merkle HP, Weissleder R, Josephson L. Uptake and metabolism of a dual fluorochrome Tat-nanoparticle in HeLa cells, Bioconjugate Chem 14: (2003). [41] Jain M, Venkatraman G, Batra SK. Cell-penetrating peptides and antibodies: a new direction for optimizing Radioimmunotherapy. Eur J Nucl Med Mol Imaging 34: (2007) [42] Chen L, Harrison SD. Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets. Biochem Soc Trans 35: (2007). [43] Youngblood DS, Hatlevig SA, Hassinger JN, Iversen PL, Moulton HM. Stability of cell-penetrating peptide-morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells. Bioconjug Chem 18:50-60 (2007). [44] Hu M, Chen P, Wang J, Scollard DA, Vallis KA, Reilly RM. 123I-labeled HIV-1 Tat peptide radioimmunoconjugates are imported into the nucleus of human breast cancer cells and functionally interact in vitro and in vivo with the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21(waf-1/cip-1). Eur J Nucl Med Mol Imaging 34: (2007). [45] Zhang YM, Tung CH, He J, Liu N, Yanachkov I, Liu G, Rusckowski M, Vanderheyden JL. Construction of a novel chimera consisting of a chelatorcontaining Tat peptide conjugated to a morpholino antisense oligomer for technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl Med Biol 33: (2006). 8

25 Capítulo 2 Marco Teórico 9

26 2.1. Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo Los análogos de péptidos reguladores representan una clase de moléculas desarrolladas para marcar específicamente células de cáncer. Estos péptidos controlan y modulan la función de casi todos los órganos vitales y procesos metabólicos, incluyendo neuropéptidos que están en el cerebro, péptidos de hormonas intestinales, así como péptidos presentes en el sistema vascular (péptidos vasoactivos) y sistema endócrino [1]. Los receptores de péptidos reguladores, son proteínas que se sobreexpresan en numerosas células de cáncer humano. Estos receptores se han utilizado cómo blancos moleculares para péptidos radiomarcados con el fin de localizar tumores. Los resultados clínicos alcanzados durante la última década con imágenes de tumores neuroendócrinos que sobreexpresan somatostatina han sido útiles en el estudio de otros péptidos para detectar cáncer asociado con receptores de péptidos, como el péptido liberador de la gastrina (GRPr), colecistoquinina, ligantes de péptidos para receptores de integrina o neurotensina. La mejora en los análogos de péptidos permite obtener imágenes clínicas específicas y terapia para diferentes tipos de tumores, incluyendo, mama, próstata, pulmón, intestino, páncreas y tumores cerebrales [2, 3, 4]. La imagen molecular comprende el monitoreo no invasivo de procesos funcionales y espaciotemporales a nivel molecular y celular en humanos y otros sistemas vivos. Las técnicas de imagen, tales como la resonancia magnética (RMI), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), la tomografía por emisión de positrones (PET), y la imagen por fluorescencia óptica (OI) se han utilizado para monitorear dichos procesos (figura 1). 10

27 Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina Figura 1. Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de infrarrojo cercano o radionúclidos Análogos de la somatostatina La somatostatina es un péptido cíclico compuesto de 14 aminoácidos y juega un papel importante en la secreción de hormonas, como la del crecimiento, insulina y glucagón. Los cinco subtipos de receptores que se han encontrado reconocen a la somatostatina. El octreótido (OC) se desarrolló como un análogo de la somatostatina para la supresión de hipersecreción y para controlar los síntomas de enfermedades de origen neuroendócrino. El OC contiene 8 aminoácidos que retienen un enlace interno entre el disulfuro que restringe la geometría de los cuatro aminoácidos de reconocimiento biológico y es estable contra la degradación enzimática in vivo. Los adenomas pituitarios y 11

28 varios tumores de origen neuroendócrino sobreexpresan receptores de somatostatina como los carcinomas de páncreas, feocromocitomas, carcinoma medular de tiroides, paragangliomas, gastrinoma, neuroblastoma, meningioma y cáncer de pulmón de células pequeñas. En la imagenología de cáncer basada en somatostatina, un análogo de la somatosatina se une a un agente quelante bifuncional que puede enlazar a un elemento radiactivo como el 111 In y 99m Tc para SPECT o 18 F y 68 Ga para PET. Actualmente el Tyr 3 -OC (TOC) es utilizado en la práctica clínica como un complejo estable para detección de tumores neuroendócrinos por técnicas de medicina nuclear molecular [5-9]. El radiofármaco 99m Tc-Depreotido desarrollado como un análogo del OC en 1996 por Pearson y cols [10] ha sido aprobado recientemente para su uso en humanos en EUA y Europa por sus buenos resultados en el diagnóstico de ganglios pulmonares [11,12] Análogos del péptido liberador de la gastrina El péptido bombesina (BN, 14 aminoácidos) pertenece a un grupo grande de neuropéptidos con muchas funciones biológicas. El equivalente en el humano es el péptido liberador de la gastrina (GRP, 27 aminoácidos) y los GRPr están sobreexpresados en la membrana celular de varios tumores malignos. El GRP difiere de la BN en sólo 10 residuos carboxi-terminales y esto explica la actividad biológica similar de los dos péptidos. La unión específica que presenta la BN a los GRPr es la base para marcar a la BN con radionúclidos tales como el 68 Ga, 64 Cu, 18 F y 99m Tc para imagen nuclear [15-22]. El subtipo 2 del receptor de la BN está sobreexpresado en varios tumores humanos como el de mama, próstata, y pulmón de células pequeñas y cáncer de páncreas [21-23]. Aproximadamente 30 diferentes péptidos radiomarcados (agonistas o antagonistas) se han desarrollado en los últimos años [1, 24, 25]. La función principal de las hormonas peptídicas GRP y BN es liberar a la gastrina secretada a la sangre por el tracto gástrico. Otras funciones del GRP y BN son: actuar sobre tejidos periféricos y sistema nervioso central, estimular la liberación de hormonas gastrointestinales, aumentar las concentraciones de 12

29 gastrina plasmática, polipétido pancreático, glucagon, insulina, péptido gástricoinhibidor y mantener los ciclos circadianos [26-28]. La BN tiene la siguiente secuencia de 14 aminoácidos: pglu-gln-arg-leu-gly- Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-CONH 2. Los últimos 7 de la porción del carbono terminal representan la porción biológicamente activa [26]. Los 4 tipos de receptores de BN que se han identificado son: el GRPr, frecuentemente expresado en tumores malignos, el receptor de la neuromedina B (NMBr) y los receptores BB3 (BB3r) y el BB4 (BB4r), estos dos últimos con afinidad mayor para la BN que para el GRP. El GRPr y el NMBr determinan la acción de los péptidos semejantes a la BN en los mamíferos. Sin embargo, solamente se había estudiado la farmacología del GRPr debido a la falta de un ligante apropiado. Recientemente se ha informado que la BN marcada con 125 I, la 125 I-[D Tyr 6 -beta-ala 11 -Phe 13 -Nle 14 ]-BN(6-14) se une con gran afinidad a todos los receptores mencionados y es utilizada para estudios farmacológicos [29]. El agonista GRP/BN es introducido al interior de la célula una vez que se ha unido a sus receptores de membrana. Estos receptores son reciclados o degradados mientras que el GRP/BN permanece en el espacio perinuclear. Por lo tanto, la BN conjugada a la 2-pirrolino-doxorubicina, se ha reportado como un agente citotóxico para quimioterapia dirigida que, inyectada a ratones desnudos con tumores de próstata humana inducidos, produce resultados satisfactorios en el tratamiento de este cáncer [30]. Asimismo, la BN radiomarcada permanecerá en el tejido blanco por largos períodos dando como resultado una acumulación de la radiactividad en tejidos ricos en GRPr positivos (GRPr+), sin daño significativo a las células y tejidos circundantes. De acuerdo con Reubi y cols se encontraron GRPr con alta densidad en: 1) Carcinomas prostáticos invasivos (30/30) y en casos de lesiones proliferativas intraepiteliales prostáticas (26/26), mayormente en neoplasias 13

30 intraepiteliales prostáticas [31]. Metástasis óseas provenientes de cánceres prostáticos andrógeno-independientes (4/7). Contrariamente, los GRPr, ausentes en tejido prostático normal, fueron identificados en sólo algunas próstatas hiperplásicas, y localizados en muy poca densidad en tejido glandular y localmente en tejido estromal [31]. 2) Células de mama epiteliales neoplásicas en dos tercios de los carcinomas ductales invasivos y carcinomas ductales in situ [32]. Las metástasis de los ganglios linfáticos provenientes de carcinomas primarios que expresaban el GRPr fueron todos positivos, mientras que el tejido linforeticular adyacente fue negativo y sin embargo estos receptores estuvieron presentes en ductos y lóbulos provenientes de muestras de tejido no neoplásico, la hiperexpresión del GRPr en carcinomas mamarios, sugiere que estos tumores pueden servir como blanco para análogos del GRP y BN [32]. La tabla 1 resume la incidencia y distribución de los GRPr en carcinomas de mama primario en un estudio realizado por Gugger y Reubi [33]. Reubi y cols [34] analizaron los subtipos de los GRPr en 161 tumores cancerosos humanos por medio de una BN marcada con 125 I ( 125 I-[D-Tyr 6,beta- Ala 11,Phe 13 Nle 14 ]BN(6-14)) que identifica los 4 subtipos de receptores. Encontraron que 12/12 tumores de próstata, 41/57 tumores de mama y 5/5 gastrinomas expresaban predominantemente el GRPr; en cuanto a carcinoides: 11/24 intestinal, 1/26 bronquial y 1/1 carcinoide del timo presentaban NMBr; 9/26 carcinoides bronquiales y 4/9 tumores de cáncer pulmonar de células pequeñas expresaban de preferencia, BB3r y de ellos 3/9 también expresaban GRPr. Igualmente 6/16 carcinomas renales expresaban GRPr y 4 de ellos también expresaban BB3r. Finalmente 2/10 sarcomas de Ewing expresaban solamente BB3r. Con este primer estudio por medio de técnicas de unión específica para detectar diferentes receptores expresados en tumores Reubi y cols concluyen que estos tumores pueden ser diagnosticados y tratados con análogos de la BN radiomarcados [34]. 14

31 Tabla 1. Incidencia y distribución del GRPr en carcinomas de mama primarios [33]. GRPr Tipos Histopatológicos n Incidencia Distribución en el tejido Carcinomas Invasivos IDC ILC Carcinoma Tubular Carcinoma Mucinoide o Subtotal /46 1/4 1/1 1/1 32/52 Heterogéneo 16/29 Heterogéneo Homogéneo Heterogéneo Heterogéneo 18/32 Carcinomas in situ DCIS o Solo o Concomitante con IDC /4 9/13 Heterogéneo 2/2 Heterogéneo 6/9 LCIS concomitante 2 1/2 Homogéneo con ILC o Subtotal 19 12/19 Heterogéneo 8/12 Total de neoplasias 44/71 Heterogéneo 26/44 71 estudiadas (62%) (59%) El ligante convencional 125 I-[Tyr4]BN muestra resultados similares que con la BN no marcada, en cuanto a afinidad y al número de receptores a los que se une. Al sustituir el 125 I por radionúclidos emisores de radiaciones gamma y β positivas y negativas ( 99m Tc, 111 In, 64 Cu, 131 I, 188 Re, 177 Lu, 149 Pr, 153 Sm) se obtienen radiofármacos específicos análogos de BN utilizados en medicina nuclear para el diagnóstico y/o terapia de tumores GRPr+ [13,15,17,19,20,34-44]. El GRPr se encuentra involucrado en el crecimiento fetal de los pulmones [27] y en el desarrollo de enfermedades pulmonares [45]. Las células de distintos carcinomas de vías respiratorias producen y secretan GRP, además de 15

32 expresar receptores con alta afinidad para péptidos análogos de la BN [46]. Persinger y cols encontraron que el gen del GRPr se localiza en el cromosoma X y que en las vías respiratorias humanas se expresa de manera abundante, siendo ésta más predominante en personas fumadoras. Sus resultados sugieren que el gen del GRPr está expresado más frecuentemente en mujeres que en hombres y que la expresión de éste gen se activa más temprano en mujeres como respuesta a la exposición al tabaco. La presencia de dos copias que expresan el gen GRPr en mujeres puede ser un factor que incrementa su susceptibilidad a la inducción de cáncer por tabaco [47]. Otro estudio hecho por Fleischman y cols demuestran que el tejido uterino normal expresa al GRPr en el miometrio, glándulas secretoras endometriales y vasos sanguíneos endometriales [48]. Halmos y cols demostraron que existe una relación directa y significativa (p < 0.005) entre los GRPr y los niveles de los receptores esteroideos [49,21]. Kahan y cols encontraron que una terapia con antagonistas de la BN, redujo el tamaño de carcinomas mamarios inoculados en ratones atímicos [50]. Se han preparado diversos análogos de la BN radiomarcada para ser utilizados como radiofármacos en medicina nuclear con la finalidad de detectar tumores malignos y para estadificar cánceres mamarios y de próstata, así como para identificar ganglios linfáticos afectados [3], como: 99m Tc-diaminedithiol-[Lys 3 ]BN ( 99m Tc-DADT-[Lys 3 ]BN) [51], 99m Tc(I)-2- picolylamine-n,n-diacetic acid-5-aminovaleric acid-bn ( 99m Tc(I)-PADA-AVA- BN), 99m Tc-Cys-6-amino-n-hexanoic acid-bn [52,14,40], 99m Tc(CO) 3 -pyrazolyl- BN(7-14)NH 2, [53], 99m Tc-HYNIC-β-Ala-BN(7-14)NH 2 y 99m Tc-HYNIC-5-AVA- BN(7-14)NH 2, [41]. Muchos de los análogos de la BN marcados con 99m Tc tienden a acumularse en el hígado e intestino como resultado de su alta lipofilia y eliminación hepatobiliar. La alta acumulación de radioactividad puede interferir durante la detección de cánceres GRPr+ y sus metástasis en áreas abdominales [3]. 16

33 El análogo de la BN, Demobesin-1 que contiene un quelante N 4 - para su unión estable con el 99m Tc ha sido reportado como selectivo para el GRPr y presenta eliminación mínima hepatobiliar [54]. Recientemente se han reportado nuevos agonistas de la BN como el 99m Tc- Demobesin-3, 4 y 5 y se demostró durante los estudios in vivo una captación e internalización rápida a células tumorales PC3. La 99m Tc-Demobesin-3 y 4 se excretaron principalmente por vía renal [43]. Lin y cols reportaron otro análogo de la BN radiomarcado, [DTPA, Lys 3 ( 99m Tc- Pm-DADT), Tyr 4 ]BN, que tiene poca eliminación hepatobiliar. Los estudios in vivo con este radiofármaco mostraron gran afinidad a las células de cáncer PC3. Los estudios de biodistribución en ratones normales mostraron muy baja acumulación de radioactividad en el hígado e intestinos. Asimismo la captación en el páncreas fue significativa ya que es un órgano que expresa GRPr [44]. El análogo de la BN radiomarcado, [ 111 In-DTPA-Pro1, Tyr 4 ]BN, demostró en estudios preclínicos de medicina nuclear que se capta en tumores GRPr+. Además de mostrar una gran afinidad y rápida internalización in vitro e in vivo en células con GRPr [55]. El radiofármaco, RP527 marcado con 99m Tc se ha estudiado en humanos y mostró una captación específica en tumores de mama (4/6) y carcinomas de próstata (1/4). En todos los casos se observó una alta eliminación hepatobiliar [56-57]. El [ 188 Re(NS 3 )(L-X-BBN(7-14))] mostró afinidad por el GRPr en el rango nanomolar como se demostró por pruebas in vitro de unión competitiva al utilizar células humanas de cáncer de próstata PC3. Las pruebas de internalización y externalización in vitro indicaron que aproximadamente el 65% del conjugado [ 99m Tc(NS 3 )(L2-betaAla-BBN(7-14))] estaba unido en la superficie o internalizado en las células PC3. Las pruebas de biodistribución de 17

34 [ 99m Tc(NS 3 )(L-betaAla-BBN(7-14))] en ratones normales mostraron mínima acumulación en páncreas normal (tejido que expresa al GRPr con alta densidad en modelos murinos) y eliminación tanto hepatobiliar como renal [58]. Estudios con diferentes análogos de BN radiomarcada en más de 50 pacientes con cáncer de mama, colorectal y de próstata, se pudo detectar invasión tumoral en ganglios linfáticos pélvicos y captación en lecho prostático [38]. En un estudio de 15 pacientes con lesiones mamográficas y a quienes se les realizó biopsia y/o cirugía, el radiofármaco 99m Tc-Leu 13 -BN diagnosticó correctamente 12 de 15 cánceres de mama, mientras que 3 estudios gammagráficos fueron negativos y correspondieron a 3 lesiones benignas. Asimismo Scopirano y cols diagnosticaron 8 de 8 cánceres primarios de próstata y detectaron correctamente invasión tumoral en ganglios linfáticos pélvicos en 3 pacientes no detectados por tomografía computarizada y resonancia magnética con el radiofármaco análogo de la BN, 99m Tc[Leu13] BN que además presentó eliminación hepatobiliar y renal [38]. Ferro-Flores y cols conjugaron al quelante bifuncional HYNIC (ácido 6- hidrazinopiridina-3- carboxílico) y al coligante EDDA (ácido etilendimino-n,n diacético) a la BN para preparar 99m Tc-EDDA/HYNIC-[Lys 3 ]-BN. La utilización de HYNIC le dio al radiofármaco propiedades menos lipofílicas y consecuentemente baja eliminación hepatobiliar y principalemente excreción renal [18]. La estructura del radiofármaco, calculada por mecánica molecular y por cálculos mecánico-cuánticos, se representa en la figura 2. Además García Garayoa y cols recientemente mostraron que la introducción de un espaciador hidrofílico entre la secuencia peptídica y el complejo de unión al 99m Tc puede reducir la alta lipofilicidad y mejorar la relación tumor-tejido no blanco [59]. 18

35 Figura 2. Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN (E= 105 Kcal/mol) Después del diagnóstico, estadificación y localización del tumor se han utilizado análogos de péptidos marcados con 111 I como sustitutos para determinar la biodistribución y dosimetría de radiofármacos terapéuticos marcados con radiometales tales como 90 Y. El DTPA (ácido dietilen triamino pentaacético) y DOTA (ácido 1, 4, 7,10-tetraazaciclododecano-N, N,N, N -tetraacético) se han utilizado como sistemas quelantes acoplados a análogos de la BN para terapia [60]. Los radiofármacos como el [ 111 In-DTPA-Pro,Tyr4]BN [61, 62], se han reportado con alta afinidad a tumores GRPr+, rápida depuración de tejidos no blanco y sangre vía renal. La sustitución del quelante DTPA por DOTA en el mismo conjugado mostró efectos favorables en la afinidad por los GRPr [62]. Recientemente M. de Jong y cols sintetizaron un nuevo análogo de la BN acoplado a DTPA, [ 111 In-DTPA-ACMpip5,Tha 6,βAla 11,Tha 13,Nle 14 ]BN(5-14) (Cmp 3), con limitada estabilidad en suero humano, pero alta captación in vivo en tumores GRPr+ en estudios con animales [63]. Muchos de los estudios con nuevos análogos de la BN se enfocan en el sistema quelante-dota por sus opciones multipropósito como SPECT, PET y radioterapia con péptidos radiomarcados (PRRT) [64-71]. Por ejemplo, el DOTA-PESIN (DOTA-PEG4-BN(7-14)) demostró ser un compuesto muy prometedor. A pesar de tener afinidad moderada por los GRPr, presentó buena 19

36 captación in vivo en estudios animales [65]. La eliminación del compuesto fue vía renal, con rápida depuración de tejidos negativos a GRPr, pero muy alta acumulación en riñones, que no pudo ser reducida a través de la co-inyección de lisina (figura 3). Otro análogo de la BN utilizado como quelante al DOTA es el 177 Lu-AMBA [71]. Este radiofármaco mostró alta captación en tumores GRPr+ en estudios animales y con una razón tumor-fondo favorable. El tratamiento del tumor in vivo con éste compuesto resultó en una sobrevida prolongada del ratón y disminuyó la tasa de crecimiento del tumor comparado con los ratones control. También se excretó via renal, con alta acumulación en los riñones a pesar de la co-inyección de lisina, debido probablemente a la falta de lisinas en la secuencia peptídica. Figura 3. Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos [73]. 20

37 La aplicación de péptidos análogos de la BN radiomarcados en pacientes aún está muy limitado [56, 72, 73]. Sin embargo los desarrollos recientes en la síntesis de nuevos análogos de la BN están promoviendo su utilización en estudios clínicos Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y receptores de gastrina La colecistoquinina (CCK) y la gastrina actúan como neurotransmisores en el sistema nervioso central, como reguladores de varias funciones en el tracto gastrointestinal y como estimuladores de los factores de crecimiento en varios tumores, como el cáncer de colon y el cáncer gástrico. Estructuralmente están relacionados ya que ambos tienen los mismos cinco aminoácidos carbonoterminal (-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2), que es el sitio activo para la unión con el receptor de colecistoquinina-2 (CCK-2r). El CCK-2r se ha identificado en la membrana celular de carcinomas medulares de tiroides (92%) mientras que se encuentra ausente en cáncer de tiroides diferenciado. Específicamente la minigastrina marcada con 99m Tc ha mostrado una alta afinidad in vivo por los CCK-2r [2, 74, 75]. Aproximadamente 13 diferentes péptidos marcados con 99m Tc o 111 In se han reportado recientemente como radiofármacos dirigidos a los CCKr [22] Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores de angiogénesis tumoral La angiogénesis representa la formación de nuevos capilares por crecimiento celular a partir de microvasos ya existentes [76]. Las integrinas son receptores de adhesión celular capaces de convertir la unión de ligantes extracelulares en la activación de procesos intracelulares (señalización de fuera hacia adentro) así como de emplear procesos intracelulares para activar respuestas celulares (señalización de adentro hacia fuera). La integrina α(v)β(3) está involucrada en la angiogénesis tumoral y producción de metástasis. La unión específica a 21

38 integrinas αvβ3 de péptidos que contienen residuos de Arg-Gly-Asp (RGD) se han empleado para radiomarcar péptidos RGD útiles como agentes de imagen específicos para tumores. Varios péptidos que contienen RGD se han sintetizado y se ha encontrado que restringiendo la movilidad del RGD en un pentapéptido cíclico, se incrementa la afinidad in vitro. Estos datos sugieren que el sitio de unión en el receptor αvβ3 es limitado. El monómero c-rgdyv (ciclo-arg-gly-asp-d-tyr-val) se marcó primero en 1999 por Haubner y cols con 125 I [77]. Este compuesto relativamente lipofílico tuvo una rápida depuración tumoral y excreción hepatobiliar. La alta acumulación de actividad en el hígado e intestino limitó su aplicación. La glicosilación del péptido RGD disminuyó la lipofilicidad y consecuentemente la captación hepática [78]. El mismo glicopéptido se marcó entonces con 18 F [79-80]. Los ligantes de péptidos para receptores αvβ3 marcados con 99m Tc, 18 F o 68 Ga son el c-rgdyk y el c-rgdfk (ciclo-arg-gly-asp-d-phe-lys) en ambas formas, como monómeros o como dímeros [81-87]. En estos péptidos la cadena lateral de la lisina provee funcionalidad a la amina primaria para acoplarse con agentes quelantes bifuncionales. Para mejorar la especificidad de los sistemas multiméricos RGD se han diseñado más de 30 derivados de RGD marcados con 18 F, 64 Cu, 68 Ga o 99m Tc [24, 88-90]. Es importante mencionar que los péptidos RGD no pertenecen a la familia de péptidos reguladores, pero son importantes porque pueden marcar vasos neoangiogénicos a través de los receptores de integrinas Péptidos ligantes para receptores de neurotensina La neurotensina (NT) es un péptido lineal de 14 aminoácidos que se encuentra en altas concentraciones en el íleon e hipotálamo, e induce varios efectos fisiológicos tales como hipotensión, analgesia, contracción gástrica e 22

39 incremento en la permeabilidad vascular. Los receptores de neurotensina están expresados en el cáncer de próstata y cáncer de páncreas [2,91]. El neuropéptido-y análogo marcado con 99m Tc (NPY) también es útil en la detección de sarcomas [92,93] Péptidos de internalización Tat El diagnóstico y tratamiento de enfermedades por métodos novedosos se incrementaría con un transporte eficiente del fármaco al núcleo de las células. Los péptidos de internalización (PPs) son fármacos utilizados en la imagen molecular y están basados en dos péptidos, el VIH Tat (Tat; Arg-Lys-Lys-Arg- Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) y el péptido homeodominio antennapedia (Ant; Arg-Gln- Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys) [94]. El péptido derivado VIH Tat es un péptido pequeño básico llamado caballo de Troya porque se ha utilizado para transportar una gran variedad de moléculas al interior de las células, como, nanopartículas, proteínas, péptidos y ácidos nucleicos. El dominio de transducción o región que le da las propiedades de internalización parece estar confinado en una pequeña secuencia de aminoácidos básica Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg y es conocido como Tat(49-57) [94-97]. Los radiofármacos híbridos, como por ejemplo el 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN han demostrado que aumenta la captación en células de cáncer y consecuentemente el contraste en la imagen de tumores de cáncer de mama [98]. Los péptidos Tat no pertenecen a la familia de péptidos reguladores. Las secuencias de localización nuclear (NLS) se han utilizado para llevar al núcleo de células de cáncer a algunos anticuerpos como el anticuerpo monoclonal anti CD33 HuM195, modificado con una secuencia NLS y marcado con 111 In (emisor de electrones Auger). El 111 In-NLSHuM195 se probó en células de leucemia mieloide y mostró internalización nuclear del radiofármaco donde los electrones Auger emitidos fueron letales [99]. Otro anticuerpo monoclonal utilizado con NLS y emisores Auger fue el traztusumab marcado con 111 In sobre células de cáncer de mama HER2/neu+ y células de cáncer de 23

40 mama resistentes a traztusumab. Costantini y cols demostraron el potencial citotóxico de este agente terapéutico contra dichas células [97,100] Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen óptica La imagen nuclear está limitada por varios factores tales como el tiempo necesario en la adquisición de datos, el costo del equipo, la exposición a la radiactividad, la necesidad de contar con personal altamente capacitado [101]. La imagen óptica de fluoróforos alojados en tejido no sano, en tiempo real, no radiactiva tiene alta resolución [102]. Dentro de todas las técnicas de imagen óptica investigadas, es de particular interés la imagen basada en fluorescencia infrarroja (NIR, longitud de onda de nm) por ser no invasiva in vivo, por su absorción y dispersión relativamente bajas en tejido y por su mínima autofluorescencia de luz NIR [103]. Esto es debido a la hemoglobina (principal absorbedor de luz infrarroja), agua y lípidos (principales absorbedores de luz infrarroja) que tienen los coeficientes de absorción más bajos en la región de infrarrojo cercano [104,105]. Por lo tanto áreas de tejido más profundas son accesibles para desplegarse en una imagen tomográfica de señales ópticas (FMT) [ ] e imagen de reflectancia por fluorescencia (FRI) [ ]. Estas aplicaciones para imagen molecular in vivo emplean longitudes de onda de infrarrojo cercano. Los métodos de imagen por fluorescencia generalmente son superiores en términos de sensibilidad y facilidad en su empleo [104]. Sin embargo, la imagen por fluorescencia de infrarrrojo cercano en animales pequeños no puede ser extrapolada directamente a una imagen in vivo en pacientes debido a su limitada profundidad de penetración de la señal óptica (< 7 mm por imagen de resonancia por fluorescencia y < 20 cm por tomografía molecular por fluorescencia) [104] Fluorocromos de infrarrojo cercano Los colorantes fluorescentes orgánicos son los fluorocromos más utilizados. Los colorantes como el isotiocianato de fluoresceina (FITC) y el éster diacetatosuccinimidil de carboxifluoresceina (CFSE) se han utilizado para 24

41 varias aplicaciones biológicas como el marcado de anticuerpos con fluorescencia y moléculas que se usan para marcar células u organelos [117]. Sin embargo, pierden rápido su fluorescencia por la exposición a la luz y por lo tanto, no son útiles para observaciones de bioimagen por periodos largos de tiempo. La mayoría de los colorantes orgánicos tienen un espectro de emisión relativamente estrecho. La longitud de onda de emisión/excitación está comúnmente afectada por los cambios en el ambiente químico local (por ejemplo, el ph, la interacción de iones, etc.). La intensidad de la fluorescencia de algunos colorantes como la cianina cambia de acuerdo con la reacción específica con óxido nítrico, que es una molécula involucrada en la regulación de mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos [118]. En el caso específico de péptidos, el compuesto marcado con fluorescencia de infrarrojo cercano, RGD con afinidad a receptores de integrinas, internalización celular y otras características se están estudiando para mejorar la sensibilidad y especificidad para detectar tumores con angiogénesis. La combinación de la interacción específica del péptido RGD / integrina con la detección por fluorescencia de infrarrojo cercano puede ser aplicada en la imagen no invasiva de la expresión de integrinas y monitorear la eficacia de tratamientos antiintegrinas. Chen y cols [119] mostraron que el conjugado Cy5.5-RGD tiene afinidad por la integrina αvβ3 (IC(50) = 58.1± 5.6 nmol/l). Otros resultados demostraron que el Cy5.5- conjugado al péptido RGD monómero, dímero o tetrámero son adecuados para la imagen de la expresión de integrinas [120]. También se ha logrado observar la expresión de αvβ3 en un modelo de tumor cerebral ortotópico con un sistema de imagen óptica 3D (IVIS 200) después de la administración del monómero Cy5.5-RGD [121]. 25

42 Las imágenes de fluorescencia del pentapéptico cíclico RGD marcado con Cy5.5 [122], adquiridas vía un dispositivo de detección intensificador acoplado a una carga, concluyen que los análisis farmacocinéticos in vivo basados en la imagen óptica dinámica pueden ser potencialmente útiles en la medicina molecular. Wu y cols [123] marcaron RGD monómero, dímero y tetrámero con Cy7. El tetrámero Cy7-RGD fue el que mostró mayor afinidad por la integrina, mayor acumulación de actividad en el tumor y el mejor contraste tumor-tejido no blanco. Waldeck y cols [124] reportaron que el Cy5.5-RGD combinado con métodos de imagen óptica de infrarrojo cercano, permite una imagen específica de la expresión de integrinas αvβ3 en macrófagos adquiridos de lesiones vasculares y pude servir para estimar la actividad inflamatoria a partir de la unión de macrófagos en lesiones ateroescleróticas. En 2007 Ma y cols desarrollaron el fármaco fluorescente Alexa Fluor 680-G-G- G-BN(7-14)NH 2 y demostraron la habilidad de este nuevo conjugado de marcar específicamente células de cáncer de mama de la línea T47D en ratones por imágenes de fluorescencia [125] Quantum Dots Los quantum dots (QDs) o nanocristales son nanopartículas semiconductoras fluorescentes (2-10 nm) con muchas propiedades ópticas únicas como, mostrar fluorescencia brillante, son resistentes a la fotodecoloración y presentan un ancho de banda de emisión estrecha [ ]. Su longitud de onda de emisión de fluorescencia puede ir de 400 nm a 2000 nm al cambiar tanto el tamaño de partícula como la composición química, a temperatura ambiente. Las partículas están hechas generalmente de cientos a miles de átomos (~200-10,000 átomos) de elementos del grupo II y VI (por ejemplo CdSe y CdTe) o elementos de los grupos III y V (por ejemplo InP y InAs) [130]. Como el cadmio 26

43 es potencialmente tóxico, Gao y cols [131] desarrollaron una clase de conjugados con QDs que contienen un copolímero para protección in vivo y múltiples moléculas PEG para mejorar la biocompatibilidad y circulación (figura 1). Los QDs que son solubles en agua se pueden unir a péptidos utilizando protocolos de bioconjugación estándar, como el acoplamiento de maleimida-activada-qds a grupos tiol [132]. Los QDs también pueden actuar como sensores para detectar la presencia de biomoléculas con diseños que incorporan donadores o receptores de energía. Por ejemplo, los QDs pueden adaptarse para detectar la presencia del azúcar maltosa, al conjugar la proteína que se une a la maltosa a la superficie del nanocristal [133]. Recientemente Cai y Chen reportaron un procedimiento detallado para la preparación de QDs-RGD con PEG comercial [67]. Shah y cols [134] utilizaron QDs-RGD para marcar células madre mesenquimatosas durante la replicación y diferenciación en células osteogénicas, condrogénicas y adipogéncias. Young y Rozengurt [135] demostraron que los conjugados de QDs-BN pueden marcar receptores acoplados a proteína G en ratones, sugiriendo que la tecnología de QDs puede ser adaptada para monitorear in vivo la unión del ligante a su receptor. Los QDs conjugados al péptido VIH Tat se unen rápido a las células y se internalizan vía endocitosis. Ruan y cols utilizaron un sistema modelo de QDs- Tat para examinar la captación celular y el transporte intracelular de nanoparticulas en células vivas [136]. Dowdy y cols obtuvieron imágenes dinámicas de fluorescencia y reporaron que el fármaco QDs-Tat se internalizó por macropinositosis [137]. El QDs-Tat se unió a la superficie interna de vesículas y quedó atrapado en organelos intracelulares. Un descubrimiento importante es que los QDs unidos a las vesículas son transportados activamente a lo largo de las trayectorias de los microtubos a una región perinuclear asimétrica llamada centro de organización microtubular [138]. Además, se encontró que los QDs-Tat se unen fuertemente a membranas celulares. Este resultado no solo brinda nuevos conocimientos del mecanismo mediante el cual el péptido Tat transporta moléculas al interior de la célula, sino 27

44 que también, es un importante desarrollo de moléculas dirigidas conjugadas a nanopartículas para marcar organelos intracelulares y adquisición de imágenes Nanopartículas de oro Las nanopartículas de oro (AuNPs) son inertes y no tóxicas debido a que el Au(0) es captado por células humanas pero no causa citotoxicidad aguda [137]. Otra ventaja es que son de fácil síntesis [139]. Hay dos propiedades de las nanopartículas que son muy relevantes: la resistencia a la oxidación y un plasmón de resonancia visible [140]. El plasmón de resonancia para nanoesferas de oro ordinarias se encuentra en 520 nm, en la mitad del espectro visible, pero puede desplazarase hacia el rojo a la región de infrarrojo cercano de 800 a 1200 nm y se han unido a moléculas biológicas para lograr que interaccionen con un blanco biológico especifico. La conjugación de moléculas a una AuNP se realiza por medio de una reacción espontánea de un tiol (Cys) o una amina primaria con la superficie de la AuNP. Los tioles son las moléculas estabilizadoras más importantes para las AuNPs de cualquier tamaño. El uso de tioles conlleva a la formación de un enlace fuerte Au-S [139,141]. La fluorescencia de las AuNPs se presenta desde el plasmón de resonancia de superficie y se puede aumentar, apagar o disminuir según el tamaño de la AuNP, la naturaleza de la capa unida a la AuNP, así como el medio que rodea a la AuNp. Idealmente, la eficiencia de la energía transferida de la AuNP a la capa orgánica solo depende de la extensión de la superposición de la banda de emisión de la capa y de la banda de resonancia del plasmón de superficie de la nanopartícula, que puede ser trasladada en una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia [142]. La emisión de fluorescencia es muy importante en un estudio de AuNP conjugadas a péptidos debido a que en general los péptidos contienen residuos aromáticos que transfieren su energía a la AuNP de la siguiente manera: del nivel de fluorescencia (péptido) al nivel de fosforescencia (péptido) y al nivel de resonancia del plasmón de superficie (AuNP). La luz absorbida reemitida por lo general está en el rango del infrarrojo cercano. Si la emisión de fluorescencia 28

45 de infrarrojo cercano no se apaga o se enmascara por la luminiscencia de fondo, en particular en tejidos. Surujpaul y cols [142] prepararon un sistema multifuncional de nanoparticulas de oro conjugadas al péptido TOC y fue caracterizado por TEM, espectroscopia UV-Vis, infraroja y de fluorescencia. Los espectros de emisión de fluorescencia de AuNP y AuNP-TOC se obtuvieron ambos en solución y en tejido tumoral AR42J de ratones. Los analisis de fluorescencia en tejido revelaron el reconocimiento del conjugado AuNP-TOC por un tumor neuroendocrino. Los resultados abren la posibilidad de utilizar AuNP-TOC en bioimagen. De La Fuente y cols prepararon AuNPs conjugadas a la secuencia de aminoácidos del péptido Tat para transportar NPs al núcleo de la célula [143] y AuNP-RGD para posibles aplicaciones foto terapéuticas [144] Sistemas multifuncionales con nanopartículas de óxido de hierro conjugadas a péptidos para imagen por resonancia magnética Las NPs producen efectos multivalentes debido a las interacciones simultáneas múltiples entre la superficie de la nanopartícula y la superficie de la célula mientras que las señales en la imagen nuclear son el resultado de las propiedades biológicas de péptidos únicos radiomarcados. La técnica de imagen por resonancia magnética MRI es una modalidad no invasiva capaz de brindar imágenes anatómicas de alta resolución. Básicamente esta técnica utiliza el contraste del tejido que es generado a partir de señales de resonancia magnética nuclear (NRM) recibidas de los núcleos de hidrogeno localizados en diferentes ambientes fisiológicos de sistemas vivos. La modalidad de MRI se puede extender a través del uso de NPs magnéticas que mejoren la diferenciación entre tejido maligno y tejido sano. Las NPs de óxido de hierro tienen propiedades magnéticas y se han estudiado para aplicaciones biomédicas por su excelente biocompatibilidad y fácil síntesis [145 a 151]. El requerimiento principal de la MRI es la captación eficiente de NPs 29

46 magnéticas en las células y cuando una célula esta suficientemente cargada con material magnético la MRI puede ser utilizada para seguimiento de la célula. Recientemente se conjugaron NPs de óxido de hierro superparamagnéticas cubiertas de dextrán (CLIO) marcadas con Cy5.5 a aminoacidos carbono-13 terminal BN, mostrando que la BN-CLIO (Cy5.5) tiene la habilidad para marcar y visualizar tumores en un modelo de adenocarcinoma ductal pancreático por MRI [152]. Montet y cols [118] prepararon crgd-clio (Cy5.5)-NPs y evaluaron la expresión celular de integrinas en carcinoma de mama humano, la farmacocinetica y la vasculariación tumoral. Los resultados indicaron que las RGD-NPs magnetofluorescentes se dirigieron a las células tumorales que expresaban integrinas in vivo y fueron detectadas por imagen de reflectancia de fluorescencia, tomografía molecular de fluorescencia e imagen por resonancia magnética. Estas imágenes permitieron analizar la naturaleza de la vascularización del tumor, la vida media en sangre de las NPs (180 min) y la depuración sanguínea (lenta). La modificación de la superficie de agentes de contraste superparamagneticos unidos al péptido Tat es una técnica efectiva para marcar magnéticamente el interior de las células [153]. Las NPs de óxido de hierro superparamagneticas ultrapequeñas (USPIO) se conjugaron al péptido Tat para marcar células T CD4+. La captación en las células se determinó con espectrometría de plasma acoplada por inducción de emisión óptica para medir el contenido de hierro. En las células se detectó hierro cuando se utilizó USPIO-Tat-NPs. Además, se demostró que las células T CD4+ retuvieron su función proliferativa y regulatoria in vitro y no se observaron diferencias en su comportamiento transmigratorio. El conjugado mostró potencial como agente de contraste para MRI. Otro estudio en el mismo campo mostró la viabilidad de utilizar MRI para monitorear células T in vivo con CLIO-Tat-NPs. Los cambios en la intensidad 30

47 de la imagen del bazo causados por el compuesto se midieron por MRI [154, 155] Péptidos para imagen molecular con técnicas multimodales La imagen molecular representa el futuro de la imagen diagnóstica, ha evolucionado desde la imagen anatómica funcional, así como los avances en genética, biología molecular y celular, química y física. Diferentes técnicas de imagen son, en general, complementarias más que competitivas. Agentes de imagen dirigidos con doble marcaje permiten la validación cruzada y comparación directa, por ejemplo, entre la imagen nuclear y la imagen óptica de fluorescencia o MRI y fluorescencia, o imagen trimodal nuclear-mrifluorescencia. Por ejemplo, el SPECT y el PET brindan información funcional pero insuficiente información anatómica. La tomografía computarizada (CT) es una técnica de imagen tomográfica que utiliza una fuente de rayos x externa para producir datos anatómicos tridimensionales. Los sistemas SPECT-CT y PET-CT actualmente se utilizan en la práctica clínica, combinan una cámara gamma y un sistema de transmisión de Rx integrado, montado en el mismo gantry [156,157]. La ventaja de estos sistemas es la habilidad de adquirir una imagen anatómica con CT y una imagen funcional con SPECT o PET secuencialmente. La modalidad dual PET-NIR con péptidos fluorescentes ha sido reportada recientemente por CAI y cols [158]. La imagen PET-NIRF se ha utilizado para medir tejido fluorescente y la inmunofluorescencia se realizó con células tumorales de bioglastoma humano U87MG implantados en ratones para cuantificar la captación tumoral y en órganos principales de 64 Cu-DOTA-QD- RGD. Se obtuvo una excelente correlación lineal entre las mediciones de la imagen PET in vivo y aquellas mediciones realizadas con la imagen NIRF ex vivo y el tejido fluorescente homogeneizado [158]. Los autores concluyeron que este fármaco con función dual redujo significativamente la toxicidad y supera la 31

48 limitante de penetración en tejido de la imagen óptica, requisito para la imagen dirigida cuantitativa en tejido profundo [158]. La imagen tomográfica molecular fluorescente (FMT) puede monitorear la función molecular en animales vivos con fármacos dirigidos fluorescentes específicos. Sin embargo, los métodos de imagen macroscópicos tales como el FMT generalmente muestran pocos detalles anatómicos. Para superar esto McCann y cols [159] reportaron una técnica de imagen cuantitativa, estructural y funcional al combinar FMT y MRI. Los autores demostraron que la imagen FMT-MRI puede producir imágenes multimodales tridimensionales de cerebros de ratones vivos indispensables para monitorear la morfología tumoral y la actividad de las proteasas. La imagen tumoral FMT/MRI combinada brinda un parámetro diagnóstico in vivo, que refleja los cambios histológicos en los tumores y es alterado significativamente por la quimioterapia sistémica. La imagen FMT/MRI combinada con fármacos dirigidos moleculares fluorescentes puede ser útil para el desarrollo de fármacos para tumores cerebrales y otras aplicaciones de imágenes neurológicas y somáticas [159]. La síntesis y caracterización in vivo de 18 F-CLIO fue reportada por Devarag y cols [160]. Estas NPs pueden detectar de manera muy precisa los ganglios linfáticos. Las imágenes PET/MRI in vivo pueden identificar claramente ganglios linfáticos pequeños (1mm) junto con información anatómica precisa. La fluorescencia de infrarrojo cercano tiene el potencial de proporcionar imágenes rápidas a bajo costo y no radioactivas de cáncer de mama. Bhushan y cols [161] desarrollaron un sistema de detección de microcalcificaciones en cáncer de mama utilizando la modalidad dual SPECT/fluorescencia/NIR. 2.5 Radioterapia de blancos moleculares Los radionúclidos que emiten partículas β de alta energía, son útiles para el tratamiento de tumores voluminosos y en este caso, el rango corto de las partículas puede compensar la pobre penetración de la molécula en una masa tumoral que posiblemente muestre heterogeneidad en la expresión del receptor 32

49 blanco. Por otro lado las partículas β de alta energía no son eficientes para destruir células individuales de cáncer o micrometástasis, debido a que la mayor energía asociada al decaimiento radiactivo se deposita fuera de la célula maligna. Tomando en cuenta lo anterior los emisores de partículas β de baja energía con mayor interés para su uso en radioterapia de blancos moleculares son el 177 Lu, 161 Tb, 67 Cu, entre otros. [162, 163,164]. Debido al rango de penetración en el tejido de la radiación β, se produce un efecto cruzado, que alcanza una mayor proporción de células tumorales a pesar de la distribución heterogénea del radiofármaco (figura 4). Otra ventaja de la terapia con radiación β es la disponibilidad de varios radionúclidos que emiten radiación con energías baja media y alta (tabla 2). Estas energías tienen rangos de penetración en tejido desde 0.1 hasta 10 mm [165]. Figura 4. Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de µm y mm respectivamente [165]. 33

50 Tabla 2. Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos terapéuticos [165]. Radiación β - α Electrones Auger Energía Baja Media Alta Muy alta Muy baja Ejemplos 169 Er 131 I 90 Y 211 At 125 I 177 Lu 186 Re 188 Re 213 Bi 123 I 67 Cu 153 Sm 32 P 212 Bi 111 In 199 Au 111 Ag 89 Sr 149 Tb 55 Fe 33 P 64 Cu 67 Ga Rango promedio en tejido (mm) <0.001 Característica LET bajo y fuego cruzado LET alto LET alto Células Células Adecuado para Masas tumorales individuales y individuales y tratamiento de: agrupadas agrupadas LET = Transferencia Lineal de Energía (kev/µm) Los electrones Auger que se emiten durante la captura electrónica o decaimiento por transición isomérica, también se consideran partículas adecuadas para la inactivación de células malignas. Estas partículas, debido a su alto rendimiento por decaimiento, son en extremo radiotóxicas si en sus trayectorias chocan con el ADN. Entonces, existe una alta probabilidad de que induzcan rompimiento de varias dobles hebras e inactivación de las células [ ]. El mayor reto de utilizar electrones Auger para terapia es su rango corto que los hace eficientes solo si el decaimiento radiactivo ocurre muy cerca del ADN. Por esta razón un agente terapéutico con emisiones Auger debe de internalizarse a la célula maligna, llegar al núcleo e idealmente incorporarse al ADN. Varios radionúclidos utilizados en medicina nuclear decaen por captura electrónica y/o conversión interna ( 201 Tl, 123 I, 111 In, 67 Ga, 99m Tc, etc.) como 34

51 consecuencia de la vacante generada en los orbitales atómicos internos por estos tipos de decaimineto se emiten varios electrones Auger. Muchos de estos electrones tienen energías muy bajas ( eV) con rangos en el orden de las dimensiones subcelulares en tejido. Por lo tanto, el depósito de alta energía muy localizada ocurre alrededor del sitio de decaimiento. El radionúclido que más se ha utilizado para investigar los efectos de los electrones Auger es el 125 I, el cual emite varios electrones de baja energía. [168]. El efecto Auger es causado por una vacante en la capa electrónica interna, preferentemente en el orbital K, que perturba la estabilidad de la energía del átomo. Cuando se recupera el balance de energía, un gran número de electrones de baja energía y rayos x característicos se emiten de diferentes capas electrónicas del átomo. El término electrones Auger es un nombre conceptual para diferentes transiciones (Auger, Coster-Kronig y super Coster-Kronig). Generalmente se puede decir que las transiciones Auger ocurren entre los orbitales (L K, M L etc). Debido a que cada orbital con más de dos electrones se puede dividir en diferentes niveles de energía (la estructura fina), las transiciones entre los electrones del mismo orbital también pueden ocurrir (transiciones Coster- Kronig). La energía del electrón emitido es igual a la diferencia de energía entre los orbitales involucrados. Por lo tanto, un gran número de combinaciones se traducirá en un espectro de energía del electrón Auger compuesto de varios electrones monoenergéticos de intensidad variable. Los decaimientos por captura electrónica o conversión interna son las principales fuentes de electrones Auger. Experimentalmente es importante distinguir entre lo que puede ser un incremento normal en la dosis celular y el efecto biológico Auger. Las energías electrónicas cercanas al potencial de ionización (< 30 ev) tendrán un efecto limitado y los electrones con energías mayores a 5 kev con un rango aproximado de 1 µm no contribuirán al efecto local. La mayoría de los electrones Auger tendrán energías de 35

52 aproximadamente 20 kev, que es una energía ideal para ser totalmente depositada dentro del tamaño de una célula [169] Proceso Auger Cuando los radionúclidos decaen por captura electrónica o conversión interna, se crea una vacante en las órbitas atómicas internas del átomo residual. Posteriormente el átomo excitado experimenta una serie de transiciones hasta que alcanza el estado basal. Estas transiciones son de dos tipos: procesos radiativos y no radiativos. Las transiciones radiativas, las cuales predominan por vacantes en el orbital K, resultan en la emisión de rayos x característicos (figura 5). Hay varias transiciones no radiativas, las más comunes son de los tipos Auger, Coster-Kronig (CK) y super Coster-Kronig (super CK) (figura 5). Cada una resulta en la expulsión de un electrón orbital. Estos procesos son altamente probables cuando la vacante esta situada más allá del orbital L. En la transición Auger, la vacante inicial en el orbital principal menor se llena con un electrón proveniente del orbital principal superior y otro electrón es expulsado del orbital principal superior. Mientras que en la transición CK, la vacante originada en el orbital principal es llenada con un electrón del mismo orbital principal y el electrón expulsado será del orbital principal superior. Finalmente, en el caso de la transición super CK la vacante y los dos electrones están todos en el mismo orbital principal [168]. Figura 5. Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K. 36

53 Las transiciones radiativas mueven la vacante al orbital principal superior sin cambio en el número de vacantes, mientras que las no radiativas incrementan el número de vacantes por uno. Por lo tanto, como las vacantes más internas se filtran hacia el orbital de valencia, se desarrolla un fenómeno de cascada que corresponde a la multiplicación de la vacante y la emisión de numerosos electrones de baja energía, conocidos como electrones Auger. Generalmente varios electrones Auger son emitidos para cada vacante del orbital interior primario. Muchos de estos tienen muy bajas energías (menos de unos cientos de ev), con valores intermedios de transferencia lineal de energía (LET) (10-25 kev/µm) y rangos extremadamente cortos (varios nm) en tejido biológico. Dado que la cascada se completa dentro de s, la región de las inmediaciones del átomo es colmada de electrones Auger y como consecuencia se obtienen densidades de energía local muy altas [168]. Varios radionúclidos emiten radiación Auger pero los de mayor interés para tratamiento son el 125 I, 123 I y 201 Tl (tabla 3). El 55 Fe emite una gran cantidad de radiación en forma de electrones Auger, pero no califica para la terapia en humanos ya que tiene una vida media de 2.7 años. Para el 99m Tc la energía de radiación Auger liberada por decaimiento es menor del 1%, mientras que para el 125 I, 123 I y 201 Tl es de 3.7% a 19.9% [165]. De acuerdo con la AAPM (American Association of Physicists in Medicine) el 99m Tc emite un promedio de 4 electrones Auger y 1.1 electrones CI por decaimiento. Los electrones emitidos presentan energías de alrededor de 0.9 kev y 15.4 kev por decaimiento, respectivamente, con un cálculo de energía total por decaimiento de kev (incluyendo las contribuciones del rayo gamma). El porcentaje total de energía Auger por decaimiento es 0.6 % y de CI es 10.8 % [168]. 37

54 Tabla 3. Ejemplos de emisores de electrones Auger [165]. Energía Electrones % de energía*** Radionúclido (kev) Auger/dec CI/dec Auger/dec* CI/dec* Total/dec** Auger/dec CI/dec 55 Fe a T 1/2 67 Ga h 99m Tc h 111 In h 123 I h 125 I d 201 Tl h dec = decaimiento, *AAPM TG6, **incluidas las contribuciones de rayos x y rayos gamma ***energía Auger o CI en % del total de energía/ decaimiento Efecto Auger en la terapia de blancos moleculares La radioterapia dirigida que utiliza electrones Auger presenta múltiples ventajas y retos. Durante la última década, el 99m Tc ha sido utilizado como un agente en imagen diagnóstica y recientemente se ha analizado su potencial como agente terapéutico. Las propiedades físicas de 99m Tc junto con su gran disponibilidad a través de un generador in situ pueden representar un nuevo e importante campo en la radioterapia dirigida. Los tres requisitos principales para una radioterapia dirigida efectiva que utiliza emisores de electrones Auger, se muestran en la tabla 4. 38

55 Tabla 4. Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores de electrones Auger [165]. REQUISITO DESCRIPCIÓN Selectividad y especificidad. La alta especificidad y selectividad evitará la toxicidad de los tejidos sanos alrededor del tumor. Irradiaciones internas consecutivas La habilidad de desarrollar múltiples ciclos de tratamiento en el tiempo. A diferencia de la quimioterapia, la radioterapia usualmente no provoca una respuesta inmune. Reducir la heterogeneidad en la Que el blanco de la radiación se una a la captación tumoral. mayoría de las células de cáncer vivas. El efecto del fuego cruzado de la radiación β puede tener ventajas en tumores grandes, pero no en pequeños. Una vez localizado cerca del núcleo de las células, la efectividad terapéutica de los emisores de electrones Auger ocurre principalmente debido a la extensiva fragmentación del ADN que es difícil de reparar. Esto se puede explicar basándose en el rango de los electrones Auger (que es de orden de nm) y en la densidad de ionización de estos electrones [170]. De hecho, de acuerdo con Buchegger y cols, la dosis absorbida local dentro del tejido tumoral después de la irradiación con 125 I es veces mayor que con una fuente externa de 70 Gy, utilizada en radioterapia externa. A pesar de estas ventajas la terapia dirigida con electrones Auger muestra algunas limitaciones y retos, especialmente al considerar terapia de tumores sólidos como a) Tiempos largos de retención del trazador en el flujo sanguíneo, que conllevan a una dosis absorbida más alta en la médula ósea (uno de los tejidos más radiosensibles); b) Baja penetración en ciertas áreas tumorales que resulta en dosis absorbidas no uniformes [169]. 39

56 Debido a que los electrones Auger tienen un rango corto, presentan toxicidad baja a la medula ósea en comparación con partículas β y α. De acuerdo con Sofou, la principal restricción en la radioterapia dirigida es la limitación de la toxicidad de la dosis absorbida en el tejido, que es el resultado de la acumulación significativa de los portadores del radionúclido en órganos vitales no blanco. Esto resulta en niveles de toxicidad que prohiben la administración de dosis altas para alcanzar dosis absorbidas letales en el sitio tumoral [171]. Algunas posible soluciones incluyen a) Marcado directo en un solo paso con biomoléculas que resulten en una mejor biodistribución; b) Estrategias para detener la angiogénesis sin afectar tejido sano; c) Normalización de la vasculatura tumoral para permitir mayor penetración y reducir la captación heterogénea en el tumor Rango de las partículas y proximidad al ADN El rango de las partículas y la proximidad al ADN son dos características vitales cuando el objetivo es la radioterapia dirigida. Las partículas β emitidas por el 90 Y presentan un rango promedio de 215 células, mientras que las del 131 I irradian 40 células y el 211 As (emisor de partículas α) irradia solo 3 [172]. Los electrones Auger permiten que la radioterapia dirigida sea más eficiente con daño mínimo a tejido sano debido a su corto rango, por lo que la radiotoxicidad de los electrones Auger (cerca del 90%) se crea por mecanismos indirectos, especialmente el denominado efecto bystander. El efecto bystander es un fenómeno que ocurre cuando las células con daño radiobiológico inducen muerte celular en células no irradiadas a través de la liberación de citosinas y radicales libres [169]. Boyd demostró que el 123 I indujo la liberación de citotoxicinas bystander, lo cual sugiere el posible uso de 123 I- MIBG (metaiodobenzilguanidina) para el tratamiento de pacientes con tumores neurales. [173]. Chen mostró la ausencia de citotoxicidad en tejidos sanos próximos cuando utilizó el complejo regulador del poro nuclear para transportar 40

57 una proteína del citoplasma al núcleo. Este complejo poro nuclear permitió la penetración de moléculas con diámetro menor de 40 a 60 kda por difusión pasiva, y para moléculas con dimensiones mayores requirió transporte activo [99]. Los efectos tóxicos de emisores de electrones de baja energía se han asociado no solo con la unión covalente entre el radioisótopo y el ADN celular, sino también con la toxicidad proveniente de las moléculas unidas al emisor de electrones Auger. Estudios recientes han mostrado que algunas moléculas son capaces de penetrar al núcleo celular y no necesitan unirse covalentemente al ADN para inducir radiotoxicidad [169]. Buchegger utilizó nucleótidos radiomarcados y enfrentó algunas limitaciones, incluyendo la incorporación al ADN durante la fase S del ciclo celular [165]. Esto puede significar que no solo el rango y la proximidad al ADN son factores clave en la radioterapia dirigida, también influye la fase del ciclo celular. La incubación con tiempos suficientemente largos para cubrir de 2 a 3 ciclos celulares se utilizaron para estudios in vitro y la administración del fármaco para sincronizar todas las células a la misma fase del ciclo [165]. Los estudios en tejidos y células han mostrado que una vez que el emisor de electrones Auger está en el citoplasma se observan efectos similares a aquellos inducidos por radiaciones de LET bajo. Cuando se introducen cerca del ADN, las curvas de sobrevivencia serán similares a aquellas obtenidas con partículas α de LET alto [174]. De acuerdo con Boswell y cols, la tasa de dosis absorbida en la célula cuando se irradia con 99m Tc, 123 I, 111 In, 67 Ga y 201 Tl es de 94, 21, 18, 74 y 76 veces mayor, respectivamente, cuando la irradiación ocurre en el núcleo, que cuando ocurre en la membrana celular (figura 6) [175]. 41

58 Figura 6. Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía depositada al ADN se reduce significativamente. De acuerdo con Buchegger el depósito de energía de electrones de emisores Auger ocurre en esferas de 1 a 2 nm de diámetro y una vez incorporados al ADN, la energía depositada en la doble hebra puede ser igual o mayor de 1 MGy. Los electrones emitidos CI (aún cuando decaigan en el citoplasma celular) pueden alcanzar el núcleo y por lo tanto el ADN. Sin embargo, estos electrones presentan una eficacia radiobiológica (RBE) similar a la de partículas β y rayos x. Estos electrones depositan de cgy en un volumen de algunos nm 3 alrededor del sitio de decaimiento. Por otro lado, los electrones emitidos por captura electrónica presentan LET alto y por lo tanto mayores valores de eficacia radiobiológica [169]. La AAPM propuso valores de RBE cercanos a 10 para efectos determinísticos de electrones Auger y 20 para efectos estocásticos. Estos valores solo aplican para electrones Auger obtenidos por captura electrónica, debido a que aquellos 42

59 adquiridos por conversión interna se clasifican como radiación de LET bajo y por lo tanto presentan un factor de peso de 1 [165] Muerte celular inducida por radiación La radiación ionizante utilizada en la terapia contra el cáncer deposita su energía en el ADN del núcleo celular, produce rupturas simples y dobles en las hebras del ADN, que si no es capaz de repararse produce la muerte celular. Además, la radiación induce daño en la membrana celular, que puede activar rutas de muerte celular. En los últimos años, se ha hecho evidente que tomar en cuenta sólo la inducción de apoptosis y necrosis como efecto radioterapéutico de los agentes anticancerígenos, es insuficiente. Por lo tanto, se han considerado también, la catástrofe mitótica y la autofagia basados en los criterios morfológicos, debido a la falta de equivalencia entre las alteraciones estructurales y las características bioquímicas de la muerte celular. Además se ha incluido en esta clasificación la senescencia (vejez celular), que es un tipo de muerte celular proliferativa que puede ser inducida por radiación (tabla 5) [176]. 43

60 Apoptosis Necrosis Catástrofe mitótica Autofagia Senescencia Reducción del volumen celular y nuclear Invaginación, mantenimiento de la integridad de la membrana Condensación de la cromatina, fragmentación nuclear, fragmentación del ADN cromosomal Hinchazón citoplasmática y de organelos celulares Pérdida de la integridad de la membrana Degradación aleatoria del ADN Formación de una Célula Gigante Separación fallida de los cromosomas durante la mitosis Micronucleación, multinucleación Sin respuesta inmune Respuestas inmunes Ejecutada vía apoptosis retardada o necrosis retardada Métodos de detección: Annexina marcada Ensayos de fragmentación del ADN Ensayos de la activación de caspasa Métodos de detección: Permeabilidad temprana a colorantes vitales Microscopía eletrónica Métodos de detección: Visualización de células multinucleares y células con micronúcleos Vacuolización masiva del citoplasma (formación de autofagosomas) Los hidrolasas lisosomales digieren el contenido celular y lo reciclan para uso interno Granularidad Métodos de detección: Localización de LC3 Aplastamiento, incremento del tamaño celular Acumulación de heterocromatina foci Incremento de la actividad de la β- galactocidasa Métodos de detección: Senectud asociada a la actividad de β- galactocidasa Tabla 5. Características de las rutas de muerte celular. Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina 44

61 El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida La respuesta tumoral a la radiación de partículas depende de múltiples factores que incluyen la dosis absorbida, la tasa de dosis, la penetración tumoral del radiofármaco, la localización intracelular del radionúclido y la radiosensibilidad del tumor. Los daños al ADN estimulan diferentes rutas celulares, como el arresto del ciclo celular para reparar los daños (de la fase G 1 a la fase S y de la Fase G 2 a la mitosis) o con lleva a la muerte celular programada, conocida como apoptosis. La apoptosis es un mecanismo de muerte celular asociado con un proceso inflamatorio nulo o mínimo que ocurre durante la embriogénesis y cuando algunos agentes adversos arriesgan el futuro celular. Todas las rutas apoptóticas muestran transducción de señales proteínicas. En el caso de los daños inducidos por radiación, el gen P53 tiene un papel crucial. Además se sabe que las células linfoides son más susceptibles de entrar en apoptosis, mientras que las células epiteliales (que también sufren arresto celular), generalmente mueren debido a la reproducción fallida después de una o varias divisiones celulares. La eficacia de la radiación para inducir muerte celular depende también de la tasa de dosis y de la densidad de ionización [169]. Los procesos apoptóticos se pueden observar en diferentes tumores, especialmente dentro de áreas hipóxicas cerca de zonas necróticas. Las proteasas cisteina-acido aspártico (conocidas como caspasas) se activan durante la apoptosis, son responsables de la perturbación del citoesqueleto celular, el aglutinamiento de la cromatina, la ruptura del ADN intranucleosomal, y finalmente la desintegración celular en pequeños remanentes de membrana, que serán removidos por macrófagos [170]. Urashima y cols estudiaron la apoptosis radioinducida y observaron que el proceso apoptótico provocado por la radiación gamma después de una exposición a 125 I parece activar la caspasa 3 sin correlación con la radiosensibilidad de la célula, sin embargo una vez que el 125 I se incorpora al 45

62 ADN, la apoptosis parece ser dependiente de la dosis y se correlaciona con la radiosensibilidad celular vía la caspasa 3. Este estudio señala algunas diferencias entre la irradiación que utiliza rayos gamma y electrones Auger. Además demostró que dependiendo del lugar del sitio donde ocurra el depósito de energía se, pueden activar diferentes rutas apoptóticas [177] La necrosis en la radioterapia dirigida La necrosis es considerada generalmente como la muerte celular accidental, no regulada [178]. Cuando la necrosis es inducida, se produce rápidamente la permeabilización de la membrana plasmática, lo que conduce a la salida del contenido celular y la inducción de la inflamación. Además, la necrosis carece de marcadores bioquímicos específicos y sólo puede detectarse mediante microscopía electrónica. La necrosis es usualmente definida como un tipo de muerte celular que implica la ruptura de la membrana plasmática, sin las características de la apoptosis (picnosis, contracción de la célula y la formación de cuerpos apoptóticos) y sin riesgos de vacuolización autofágica [179]. Las principales características de la necrosis incluyen el aumento en el volumen celular (oncosis), que finalmente culmina en la ruptura de la membrana plasmática y el desmantelamiento desorganizado de organelos hinchados. La necrosis inducida por radiación se puede subdividir en necrosis temprana y necrosis tardía. La necrosis temprana es una muerte celular ultra-rápida, que es inducida dosis altas de irradiación es decir, más de 100 Gy [180]. La necrosis tardía es una muerte celular lenta y uno de los mecanismos por los cuales se ejecuta la catástrofe mitótica [181] La catástrofe mitótica inducida por radiación La catástrofe mitótica es la muerte célular que ocurre dentro de la mitosis o como resultado de la mitosis aberrante [179]. La mitosis anormal tiene diferentes rutas que inducen cambios que incluyen a la anafase, rezago del material cromosomal y mitosis multipolares (figura 7) [182, 183]. Además no se produce la separación cromosomal correcta ni división celular, lo que conlleva a 46

63 la formación de células gigantes con morfología nuclear aberrante, con múltiples núcleos o varios micronúcleos [184, 185, 186, 187, 188]. La división de estas células puede formar colonias abortivas, que viven varias horas o días pero eventualmente mueren por necrosis o apoptosis retardada. Figura 7. Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha) [184]. Las células después de irradiarlas entran prematuramente en mitosis, con ADN dañado que induce aberraciones cromosomales que culminan en la catástrofe mitótica. Esto aplica para radiaciones de diferentes densidades de ionización y tasas de dosis Cuantificación del efecto Auger En la radioterapia es común utilizar dosis absorbida como el parámetro relacionado con los efectos biológicos y los resultados terapéuticos. El uso de diferentes características de la radiación es tratado con el concepto de efectividad biológica relativa (RBE = RELATIVE BIOLOGICAL EFFECTIVENESS), donde el efecto biológico de la radiación a prueba se compara con aquella radiación de LET bajo. Los electrones individuales son principalmente radiación de LET bajo (energía < 10 kev/µm). Solo una 47

64 pequeña fracción de los electrones Auger tendrá LET entre 10 y 30 kev/µm y poco incremento de RBE. El efecto biológico Auger se explica entonces como el efecto colectivo de varios electrones de LET bajo que darán una producción más efectiva de varios rompimientos de doble hebra del ADN y por lo tanto el valor de RBE será comparado con el de la radiación de LET alto (como los emisores α). Un problema al utilizar dosis absorbida junto con el efecto Auger es que nos limitamos a confiar en los cálculos tanto de la fuente (rendimiento de electrones Auger de baja energía) y en cómo la energía es absorbida, debido a que es casi imposible medir estos parámetros en condiciones fisiológicas. El potencial de ionización de la molécula de ADN y la habilidad de los electrones Auger de ocasionar rompimientos de la doble hebra varía dependiendo de las condiciones químicas y fisiológicas [189] Metodología de cálculo de dosis absorbida de radiación En dosimetría interna la cantidad principal de interés es la dosis absorbida y la dosis equivalente. La dosis absorbida (D) está definida como D=dЄ/dm, donde dє es la energía promedio impartida por la radiación ionizante a la materia de masa dm. La unidad de D es el Gray (Gy). La dosis equivalente (H) es la dosis absorbida multiplicada por un factor de calidad (Q), y es la estimación de la efectividad de diferentes tipos de radiación de causar efectos biológicos: H = DQ. Debido a que el factor de calidad es adimensional, las unidades de esta cantidad son las mismas que la D, sin embargo la unidad especial es el Sievert (Sv) [190]. Entonces la ecuación general para la dosis absorbida en un órgano es: ~ D = ka nieiφi i m ec

65 Donde: D Es la dosis absorbida (Gy) A ~ Es la dosis acumulada (MBq s) n Es el número de radiaciones con energía E emitida por transición nuclear E Es la energía de emisión (MeV) Φ Es la fracción de energía absorbida en el blanco m Es la masa de la región del blanco (Kg) k Es la constante de proporcionalidad (kg/mbq s MeV) La aplicación terapéutica de los radionúclidos, especialmente los emisores de partículas α en medicina nuclear y la utilización reciente de haces de protones y haces de partículas cargadas en radioterapia ha destacado la necesidad de un formalismo dosimétrico bien definido y acompañado por cantidades con nombres especiales correspondientes, aplicable a efectos determinísticos. Se han propuesto varias soluciones, por ejemplo la NCRPM (National Council on Radiation Protection and Measurements) y la ICRP (International Commission on Radiological Protection) han propuesto la unidad Gray- Equivalente (Gy-Eq) para referirse a la dosis absorbida ponderada por la efectividad radiobiológica [191, 192]. En 2007 la ICRP propuso el uso Gy como la unidad de dosis absorbida ponderada por efectividad radiobiológica para efectos biológicos determinísticos. En el campo de la terapia de haces de protones, el término dosis equivalente se ha utilizado con la unidad Gy-Eq o Cobalto-Gray-Equivalente (CGE) [193,194]. En el contexto de la terapia de haces iónicos, un grupo de trabajo en conjunto con la IAEA (International Atomic Energy Agency) y la ICRU (International Commission on Radiation Units and Measurements), propusieron un formalismo para resolver la cuestión de las cantidades y unidades usadas para predecir efectos determinísticos de la radiación ionizante. Este grupo introdujo la cantidad de dosis isoefectiva (D IsoE ), que fue definida como el producto de las dosis absorbida (D) y un factor de ponderación isoefectivo (w IsoE ). Este factor de peso se definió para considerar todos los factores que pueden influir en los efectos determinísticos clínicos asociados con una dosis absorbida dada. En la terapia 49

66 con radionúclidos se podría incluir este factor pero no estaría limitado al tipo de radiación, la tasa de dosis y la distribución espacial de la dosis absorbida [195]. La condición de irradiación de referencia para determinar w IsoE fue definida para fotones que depositan 2 Gy en el tejido por fracción y 5 fracciones por semana. Se recomendó que la dosis isoefectiva se expresara en Gy [195]. A pesar de que w IsoE es similar en su concepto a la efectividad radiobiológica, este difiere en que la radiación de referencia está bien definida y tradicionalmente ha sido utilizada en la terapia con medicina nuclear como el estándar para predecir consecuencias biológicas probables de una dosis absorbida particular. De la misma manera, el comité MIRD (Medical Internal Radiation Dose) recomienda que el formalismo de dosis isoefectiva se adopte para su uso en medicina nuclear terapéutica. No obstante, el comité MIRD recomienda que para corresponder con el formalismo establecido para efectos estocásticos, la dosis isoefectiva sea expresada en una nueva unidad especial conocida como el barendsen (Bd). Se recomendó la utilización de este nombre en reconocimiento a las contribuciones hechas por Gerrit W. Barendsen a la radiobiología de radiación de LET alto [195] Sistema MIRD para cálculo de dosis interna La ecuación para la dosis absorbida en el sistema MIRD es aparentemente simple: D = A ~ S [190]. En este esquema la radiación ionizante deposita energía en un blanco, pero es independiente del tiempo. Los volúmenes blanco son modelos anatómicos de órganos humanos y cuerpo entero. La D se define como el producto de los factores dependientes del tiempo (biocinéticos) por aquellos factores independientes del tiempo (físicos). D = AS ~ ec 2.2 S = k nieiφ i m ec 2.3 i 50

67 Los factores biocinéticos corresponden a la actividad acumulada à y los factores físicos son el tipo y energía de la emisión, masa del blanco, fracción de la energía depositada en el blanco por la partícula emitida, geometría de la fuente y del blanco, distribución de la fuente etc. (S). Existen una variedad de métodos conocidos como modelos radiofarmacocinéticos que describen el comportamiento del vector que acarrea a la fuente radiactiva dentro de un organismo, mediante los cuales se puede conocer la actividad acumulada Modelos radiofarmacocinéticos Un modelo radiofarmacocinético, es la descripción matemática de la distribución biológica de algún radiofármaco en función del tiempo, desde su introducción al cuerpo hasta su eliminación biológica o física [196]. Se dividen en tres tipos: 1. Empíricos o de integración directa 2. Analíticos o análisis de regresión por mínimos cuadrados 3. Compartimentales o modelo compartimental Modelos empíricos Al utilizar la metodología de los radiotrazadores, puede obtenerse una serie de medidas de concentración del radionúclido en los diferentes tejidos y graficarlas en función del tiempo post-administración. Las curvas resultantes de actividadtiempo pueden ser caracterizadas como un modelo farmacocinético empírico, puesto que es una descripción matemática de la distribución del radionúclido incorporado cuya información derivó de la medición directa [197]. El área bajo la curva actividad vs tiempo puede ser evaluada por métodos de integración numérica simples y obtener la actividad acumulada ( ~ A ), parámetro biocinético necesario para el cálculo de la dosis absorbida. Sin embargo, la 51

68 precisión de tal integración es completamente dependiente del adecuado cálculo de la fracción (o porcentaje) de actividades acumuladas en los órganos fuente y en las muestras de excreta. Es importante tomar suficientes muestras de la distribución y la retención del radiofármaco durante el transcurso del estudio. El sistema MIRD fue desarrollado principalmente para su uso en la estimación de dosis de radiación recibida por pacientes cuando se les administra un radiofármaco Modelos analíticos Para superar la limitante de los métodos empíricos, en cuanto a extrapolar razonablemente un dato más allá del último tiempo de lectura, los datos biológicos obtenidos pueden ajustarse a una función analítica, también conocida como función de distribución. En el modelo analítico queda implícito que la curva de actividad vs tiempo puede ser ajustada a una función dependiente del tiempo antes de la primera medición y después de la última medición. Los procesos biológicos siguen una cinética de primer orden, por lo que las curvas de actividad vs tiempo pueden ajustarse a una suma de exponenciales, así: [197] q h λh( j) t ( t) Ah( j) e = ec 2.4 j Donde: q h (t) = es la función de distribución de la región fuente r h, que es la actividad corregida por decaimiento radiactivo (Bq) en la región fuente r h al tiempo t postadministración del radiofármaco; A h(j) es la actividad (Bq) para el j-ésimo componente exponencial en la región fuente r h al tiempo t=0; y λ h(j) es la constante de eliminación efectiva (h -1 ) del j-ésimo componente exponencial de la curva actividad vs tiempo en la región fuente, que es la fracción de la actividad eliminada por unidad de tiempo para el j-ésimo componente exponencial de la curva actividad vs tiempo. 52

69 Los datos de actividad vs tiempo al ser graficados en papel semilogarítmico (la actividad se grafica en la escala logarítmica de las ordenadas y el tiempo en la escala aritmética de las abscisas), producen un segmento lineal para cada componente de la función de distribución q h (t) y el número de componentes exponenciales corresponde al número de segmentos lineales identificables, de esta forma, se puede obtener, por arreglo de mínimos cuadrados, la función correspondiente [197]. Si se incorpora la función de distribución en la expresión de actividad acumulada, esta puede escribirse como: A ~ (0, ) = 0 e λt q ( t) dt h ec 2.5 Evaluando la integral resultante para el modelo biexponencial antes propuesto: ~ A h (1) Ah(2) A = + ec 2.6 λ λ h(1) h(2) Y en términos generales: A ~ (0, ) = j A h ( j) λ h( j) ec Modelos compartimentales En este modelo el sistema biológico es tratado como compartimentos interconectados como un ensamble de unidades físicas y químicas idénticas. Cada ensamble corresponde a la entidad anatómica identificable (ej. un órgano como el hígado), la entidad fisiológica identificable (ej. sistema retículo endotelial) o la entidad física identificable (ej. agua del espacio extracelular). Sin embargo, referirse a la entidad identificable o un compartimento discreto es únicamente conceptual. El modelo compartimental está caracterizado por el número de compartimentos y por las probabilidades de transición, o velocidades de intercambio, entre los compartimentos, lo cual puede ser representado matemáticamente como el grupo de ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas [197, 198]. 53

70 2.7. Dosimetría celular La biodistribución y las medidas cinéticas de radiofármacos en pacientes son difíciles de lograr. Una dosimetría de alta calidad de radiofármacos emisores de rayos gamma o positrones sigue siendo muy difícil de desarrollar en un entorno clínico estándar. Para dosimetría de radiación Auger, es esencial el conocimiento del porcentaje de células que están marcadas en los tejidos individuales. Además la irradiación Auger más importante ocurriría solo para emisores asociados al ADN. En contraste con las células marcadas, las células no blanco estarían mínimamente o no irradiadas por los decaimientos de electrones Auger [165]. Dado que la actividad acumulada en un órgano es conocida como la dosis promedio de radiación absorbida nuclear, se puede calcular, si se estima el porcentaje de radiación Auger asociado al ADN. Los valores S para dichas situaciones ya se conocen [199]. Para la estimación del riesgo de efectos estocásticos a largo plazo, un factor de calidad (w R ) de 20 se puede aplicar para radiación Auger asociada al núcleo celular. Esto puede generar el estimado del riesgo de la dosis de radiación para un paciente expuesto a un procedimiento diagnóstico de medicina nuclear con emisores de electrones Auger [91]. Para los cálculos de lo efectos citotóxicos determinísticos de la radiación Auger, el conocimiento de la dosis de radiación absorbida nuclear promedio en un órgano es insuficiente. Es esencial tener el estimado del porcentaje de células que son marcadas con radiacióm y conocer las tasa de captación del radiofármaco dentro de estas células. Asimismo, la consideración de los efectos de los emisores de radiación Auger con tiempos de vida media largo, tal como el 125 I, las células con captación insuficiente pueden evitar citotoxicidad por la división celular [200]. La división celular produce dilución de los decaimientos de radiación Auger en múltiples células hijas. Igualmente si se considera la sobrevivencia clonal, la probabilidad de sobrevivencia de al menos 54

71 una de varias células hijas será mayor que aquella de una sola célula madre expuesta al mismo número de decaimientos Auger. El manejo dosimétrico preciso de la división celular durante la radiación Auger de larga duración es por lo tanto muy compleja. Esta requiere la atención al retraso de la división celular provocado por la irradiación continua que causa rompimientos de la doble hebra en el ADN. Estos rompimientos inducen señales de detención del ciclo en diferentes puntos control que permiten la reparación. Los efectos biológicos de la radiación Auger han sido medidos con 125 I o 123 I-IdUrd. La vida media de 123 I permite que la mayoría de su emisión de radiación Auger ocurra en un día, mientras que la duplicación celular de tumores ocurre frecuentemente de uno a varios días. En contraste, debido a la vida media larga del 125 I (60 días), la liberación de energía ocurrirá durante varios días o semanas siempre que el radiofármaco permanezca asociado al ADN. Para el 125 I-IdUrd se calculó que con 120 decaimientos de radiación Auger que ocurrieron cercanos al ADN se logró esterilizar una célula [201]. Este cálculo está basado en el conocimiento del tiempo que tarda una división celular normal y el tiempo de división bajo condiciones de irradiación Auger Esquema MIRD celular El formalismo matemático mediante el cual se calcula la dosis absorbida en una célula es el mismo que se emplea en dosimetría interna (descrito arriba) entonces: ~ D = A S( r r ) ec. 2.8 h k h Donde à es la actividad acumulada y S es la dosis absorbida en la región blanco r k por unidad de actividad acumulada en la región fuente r h. Los valores S usados en el cálculo se encuentran en el MIRD celular y existen para diferentes dimensiones celulares que contienen distribuciones de radiactividad en el núcleo, citoplasma o membrana [202]. 55

72 2.8. Simulación Monte Carlo El método Monte Carlo es una forma genérica de nombrar procedimientos matemáticos o métodos numéricos cuya característica común es la utilización de números generados aleatoriamente y el muestreo de distribuciones de probabilidad. Se hace uso de variables aleatorias definidas en un espacio dimensional finito y se calcula su valor esperado [203]. La principal limitación del método Monte Carlo es la obtención de suficiente precisión en los resultados. Entre más precisión se requiere, más eventos o muestreos deben hacerse y eso, en problemas complejos, lleva a utilizar mucho tiempo de cómputo. Existen opciones para reducir esos tiempos, como los métodos de reducción de varianza, la utilización de modelos simplificados o la subdivisión del problema en partes menos complejas. La simulación Monte Carlo del transporte de radiación se basa en que la trayectoria de una partícula es vista como una secuencia aleatoria de desplazamientos libres que terminan con un evento de interacción donde la partícula cambia su dirección de movimiento, pierde energía y puede generar partículas secundarias. Todo ello se realiza al aplicar las leyes de la física, sobre las funciones de probabilidad determinadas por las secciones eficaces adecuadas, dependiendo del medio, la energía de la partícula y la disposición geométrica del sistema [204,205]. Los códigos de simulación Monte Carlo desarrollados para el transporte de radiación, contienen modelos de interacción para definir las funciones de distribución de probabilidad para las distintas variables aleatorias que intervienen en cada proceso y permiten obtener valores promedio de observables de interés como pueden ser la posición de las partículas después de cada interacción, el momento y las pérdidas de energía de las partículas primarias o las secundarias generadas en algunas interacciones [206]. 56

73 Códigos de simulación del transporte de radiación Entre los códigos o programas de simulación Monte Carlo para el transporte de partículas en medios materiales están: EGS4, EGSnrc, PENELOPE, NOREC, MCNP y GEANT. El MCNP fue desarrollado en Los Alamos, E.U. para simular solo neutrones; sin embargo, actualmente puede utilizarse para simular hasta 36 tipos de partículas en intervalos de energías de unos kev hasta el orden de cientos de MeV en materiales muy diversos [207]. El GEANT fue elaborado en el CERN (European Organization for Nuclear Research) para aplicaciones con altas energías y se puede utilizar para simular haces de diferentes tipos de partículas (muones, piones, neutrinos, etc.), desde energías de unos cuantos cientos de ev hasta cientos de TeV para algunas partículas. El NOREC es específico para aplicaciones de microdosimetría, pero su manejo es difícil y está limitado a simular en agua fotones y electrones. Con PENELOPE se pueden simular cascadas de fotones, electrones y positrones en casi cualquier medio material sólido, líquido o gaseoso, en geometrías que pueden definirse con superficies cuádricas, es decir determinadas por una ecuación de segundo grado. Este código originalmente fue desarrollado para simular electrones, lo cual se puede hacer evento por evento, si son de baja energía [208]. Una vez seleccionado el sistema a simular, se hace un modelo geométrico y se genera un archivo (o tarjetas de entrada), en el lenguaje o formato del código; se definen los materiales que rellenan los volúmenes definidos y se generan los archivos de dichos materiales de acuerdo al formato requerido. Básicamente para cada material se introducen los elementos químicos que lo forman, el porcentaje en peso atómico de cada elemento y su densidad. Se establecen las 57

74 condiciones iniciales de las fuentes como son la energía, posición, tipo de partícula, número de partículas y se declaran las energías de corte o absorción. Finalmente se estipula el grado de detalle con que debe efectuarse la simulación y dependiendo del código, se establecen los proceso de interacción necesarios e incluso alguna teoría física específica para la simulación Código de simulación Monte Carlo PENELOPE PENELOPE (acrónimo del ingles PENetretion and Energy LOss of Positrons and Electrons y fotones en la actualidad) es un código Monte Carlo de propósito general capaz de simular cascadas de fotones y electrones en el rango de unos pocos cientos de ev hasta 1 GeV en casi cualquier medio material amorfo cuya composición química sea conocida. PENELOPE destaca frente a otros códigos por su descripción del transporte de interfaces materiales y el transporte de partículas de baja energía [209]. PENELOPE es un paquete de subrutinas, controladas por un programa principal que controla la evolución de las historias de las partículas y acumula en contadores las magnitudes de interés en cada aplicación concreta. Estas subrutinas están escritas en el lenguaje de programación FORTRAN77 y son distribuidas por la Agencia de Energía Nuclear de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (Nuclear Energy Agency, NEA-OECD). Sus autores son Francesc Salvat y José M. Fernández-Varea de la Facultad de Física de la Universidad de Barcelona y Josep Sempau del Instituto de Técnicas Energéticas de la Universidad Politécnica de Cataluña [209]. La simulación de electrones y positrones con PENELOPE incluye los siguientes tipos de interacciones: Dispersión elástica fuerte (θ > θc). Dispersión inelástica fuerte (θ > θc). Emisión por Bremsstrahlung (radiación de frenado). Interacción Delta. Interacción artificial débil (θ < θc). Ionización de capas internas. 58

75 Aniquilación (sólo para positrones). Interacciones auxiliares (mecanismos adicionales de interacción que pueden ser definidos por el usuario, por ejemplo, interacciones fotonucleares). La simulación de fotones incluye los siguientes tipos de interacciones: Dispersión elástica (Rayleigh). Dispersión inelástica. Efecto fotoeléctrico. Producción de pares. Interacción Delta. Interacciones auxiliares. Cada interacción puede dar lugar a partículas secundarias, las cuales serán simuladas posteriormente. Por ejemplo, la aniquilación de un positrón dará lugar a dos fotones gamma y el efecto fotoeléctrico dará lugar a un electrón libre. Para poder emplear PENELOPE se debe construir un programa principal, el cual se encargará de ir llamar de manera adecuada a las subrutinas de PENELOPE, e irá almacenando la información sobre las trayectorias de las partículas simuladas. Este programa principal debe dar a PENELOPE unos ficheros de entrada con información sobre la geometría del sistema y de los materiales a utilizar. También debe de proporcionar a las subrutinas de PENELOPE los parámetros necesarios para su funcionamiento, como son: tipo de partícula a simular, posición y dirección de la misma. Mediante el uso adecuado de estas herramientas de simulación, el usuario puede crear el entorno de simulación que le permita realizar los estudios deseados. En este trabajo se ha empleado como programa principal el penmain, que viene incluido con PENELOPE, ligeramente modificado para poder calcular la atenuación y la energía depositada por haces de electrones de bajas energías tras atravesar un determinado espesor del material estudiado (membrana, citoplasma y núcleo celular). PENELOPE incluye la subrutina para la generación de series de números aleatorios que está basada en el algoritmo que se debe a L Ecuyer [210] y produce números reales de 32 bits uniformemente distribuidos en un intervalo abierto entre cero y uno. Su periodo 59

76 es del orden de s, lo que es infinito para efectos prácticos en simulaciones. [209]. Los ficheros fuente necesarios para realizar la simulación con PENELOPE son los siguientes [209]: Penmain.f: Es el programa principal, que se encarga de llamar a todas las subrutinas de PENELOPE y almacena la información sobre las trayectorias de las partículas simuladas. PENELOPE.f: Es el paquete básico de subrutinas que se necesita para la simulación de cascadas de fotones, electrones o positrones en cualquier medio. Pengeom.f: Paquete de subrutinas que realiza el seguimiento de las partículas a través de la geometría definida. Penvared.f: Paquete de subrutinas encargado de reducir las incertidumbres estadísticas. Timer.f: Subrutina que permite controlar el tiempo de ejecución del programa. Pengenerator.f: Subrutina encargada de generar el fichero de geometría en el formato adecuado para que lo pueda leer PENELOPE Geometría del sistema La geometría del sistema que se desea simular debe ser definida en un formato adecuado para que lo lea PENELOPE. El sistema quedará definido por cuerpos formados cada uno de un solo material, cada uno de estos se forma mediante superficies que quedan definidas mediante cuadricas; es decir, cada una de ellas debe venir dada por la siguiente ecuación: F( x, y, z) = Ixx x + Iyyy + Izzz + Izz + AI 0 = 0 ec 2.9 Por lo tanto, para definir una determinada superficie con PENELOPE se necesita dar valores de 1, -1 o 0 a los coeficientes I xx, I yy, I zz, I z y A.I 0, así como 60

77 decidir el tamaño que tendrán las superficies en las tres direcciones del espacio y siempre que sea necesario incluir un valor que traslade respecto al origen a la superficie definida. PENELOPE tiene una sencilla aplicación que permite visualizar las superficies llamada gview3d.exe. Esta permite comprobar que el archivo de la geometría está escrito de forma correcta y que corresponde al modelo que deseamos simular [209] Definición de materiales Toda la información de los materiales involucrados en la simulación debe de estar recopilada en un archivo que el usuario debe construir siguiendo normas concretas. Se incluyen tablas de propiedades físicas y de secciones eficaces. El archivo de materiales se crea mediante la aplicación llamada material.exe, tras ejecutarla se introducen los datos sobre el material como su composición química y densidad. Asimismo, PENELOPE dispone de una lista de 280 materiales para los cuales sólo se introduce su referencia y se obtiene el archivo de materiales directamente. Cuando se trata de materiales compuestos, la aplicación aproxima la sección eficaz a la suma de las secciones eficaces de cada elemento al ponderar su proporción en la molécula. De la misma manera que el archivo de geometría debe seguir las reglas de sintaxis, todos los materiales deben ir concatenados en el registro de los materiales. [209] De esta manera PENELOPE les asocia un número que es el que se debe de utilizar en el archivo de geometría, identificándose así de que material está compuesto cada cuerpo Descripción del programa principal Como se indicó anteriormente, el programa principal que se va a emplear en este trabajo es el programa penmain, ligeramente modificado para poder 61

78 calcular la atenuación y la energía depositada por haces de electrones al atravesar un determinado espesor del material estudiado. El cuerpo de nuestro programa principal y PENELOPE están conectados mediante una serie de variables globales que deben estar completamente definidas. PENELOPE va a buscar en el programa principal los valores de todas estas variables antes de empezar la simulación. Estas son [209]: KPAR: Tipo de partículas que se está simulando (1 electrón, 2 fotón, 3 positrón) E: Energía en ev que posee la partícula en ese momento. X, Y, Z: Coordenadas espaciales (en cm). U, V, W: Cosenos directores que marcaran la dirección de las partículas. WGHT: Peso útil cuando se usan las técnicas de reducción de varianza. IBODY: Cuerpo en el que se encuentra la partícula MAT: Material en el que se encuentra la partícula. ILB (5): Vector de 5 componentes que describe el origen de las partículas secundarias. También se debe incluir en el programa principal una serie de valores relacionados con el transporte de radiación que influirán directamente en la precisión y rapidez de la simulación. DSMAX (M): Proporciona la distancia máxima entre dos eventos duros. El parámetro M define esta distancia para cada material. EABS (KPAR, M): Valor de la energía para la cual podemos considerar que la partícula se absorbe localmente. PENELOPE distingue entre colisiones duras y blandas. Las colisiones duras son aquellas cuya pérdida de energía está por encima de un cierto valor mientras que las blandas son las que se encuentran por debajo. En el programa principal también se especifican estos límites para cada material mediante las siguientes variables: C1 (M): Indica el recorrido libre medio entre eventos elásticos duros para cada material. C2 (M): Determina la fracción máxima de energía que se puede perder entre dos colisiones duras consecutivas. Wcc (M): Energía de corte en ev para colisiones inelásticas. 62

79 Wcr (M): Energía de corte para emisión de Bremsstrahlung. Como ya se ha comentado anteriormente, el programa principal se apoya en una serie de funciones y subrutinas de PENELOPE, que son las siguientes: PEINIT: Subrutina que lee los archivos de los diferentes materiales y secciones eficaces que serán empleadas. GEOMIN: Lee el archivo de geometría. TIME0 y TIMER: Usados para poner el contador de tiempo a 0 y para ponerlo en marcha. LOCATE: Determina el cuerpo que contiene el punto con las coordenadas (X, Y, Z). Los valores de salida son: - IBODY: Cuerpo en el que se mueve la partícula - MAT: Material en dicho cuerpo CLEANS: Inicializa la lista de partículas secundarias. Debe de ser llamada antes de comenzar la simulación de cada partícula primaria. START: Pone en marcha la simulación de una partícula. JUMP: Calcula el recorrido libre desde el punto de salida hasta la posición del siguiente evento de interacción y la probabilidad de ocurrir de los distintos tipos de interacciones. El valor de salida es: - DS: Recorrido libre de la partícula. STEP: Esta subrutina parte de las coordenadas y dirección iniciales y haciendo uso de la distancia recorrida calcula las coordenadas finales. Además, devuelve el cuerpo y el material en que se encuentra finalmente la partícula. KNOCK: Simulación de los eventos de interacción. Los parámetros de salida son: - DE: Energía depositada por la partícula en el material - ICOL: Tipo de interacción sufrida por la partícula - (U, V, W): Nueva dirección de la partícula SECPAR: Devuelve las condiciones iniciales de la siguiente partícula secundaria y la elimina de la lista de partículas secundarias. El valor de salida es: - LEFT: Número de partículas secundarias restantes en la lista en el momento que se llama a la subrutina. 63

80 2.9. Microdosimetría En microdosimetría [211, 212] la cantidad estocástica análoga a la D en un volumen V se define como la energía específica (z), ε ε z = = ec 2.10 ρv m Donde ρ es la densidad del material que está contenido en V. El valor promedio de la dosis absorbida D en V que es igual a z que es el valor promedio de la distribución de probabilidad f (z) en V. Si hacemos incidir un electrón en un volumen infinitamente pequeño este prácticamente atravesaría ese volumen sin depositar energía. Por lo general V es una esfera y por consiguiente es necesario conocer su radio. Para grandes dosis absorbidas la forma de f (z) es una campana alrededor del valor promedio de V. Suponiendo que V es suficientemente pequeño de tal forma que la dosis absorbida sea constante independientemente del tipo de radiación, entonces, D = limz ec 2.11 m 0 A partir de f (z) se puede conocer D pero no es posible el proceso inverso por lo que se tienen que definir cantidades microdosimétricas específicas. Otra cantidad microdosimétrica muy útil es la energía lineal definida como: ε 1 y = ec 2.12 l Donde ε 1 es la energía impartida en un solo evento y l es el diámetro promedio de un volumen. En el caso donde V es una esfera, 2d l = ec La frecuencia de evento ( Φ *) es el número promedio de eventos en un sitio (de región esférica) por unidad de dosis absorbida. Es decir, Φ *, es el 64

81 recíproco de otra cantidad llamada energía absorbida específica promedio ( z F. ). Y la función de proximidad t(x) la cual se refiere a la distribución de distancias entre dos puntos donde se depositó energía en la materia irradiada. En cuanto a los aspectos espaciales de la microdosimetría, z está sujeta a tres diferentes tipos de fluctuaciones; - Variación en el número de eventos en el sitio - Variación en el número de colisiones que ocurren en esos eventos - Variaciones en la energía localmente depositada en colisiones individuales Estas variaciones aumentan conforme el tamaño de volumen blanco se reduce, ya que si el volumen es demasiado pequeño se incrementa la probabilidad de que no ocurra ningún evento en ese sitio tan pequeño [212]. 65

82 2.10. Referencias [1] Reubi, J.C.; Waser, B. Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur. J. Nucl. Med.,, 30, (2003) [2] Reubi, J.C.; Maecke, H.R. Peptide-based probes for cancer imaging. J. Nucl. Med., 49, (2008) [3] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Melendez-Alafort, L.Third generation radiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Curr. Pharm. Anal., 2, (2006) [4] de Visser, M.; Verwijnen, S.M.; de Jong, M. Update: improvement strategies for peptide receptor scintigraphy and radionuclide therapy. Cancer Biother. Radiopharm., 23, (2008). [5] Decristoforo, C.; Meléndez-Alafort, L.; Sosabowski, J.K.; Mather, S.J. 99mTc- HYNIC-[Tyr3]-Octreotide for imaging somatostatinreceptor-positive tumors: preclinical evaluation and comparison with 111In-octreotide. J. Nucl. Med., 41, (2000) [6] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Mlodkowska, E.; Kunert-Radek, J.; Michalski, A.; Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. Clinical usefulness of 99mTc- EDDA/HYNIC-TOC scintigraphy in oncological diagnostics: a preliminary communication. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 30, (2003) [7] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Michalski, A.; Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC scintigraphy in the differential diagnosis of solitary pulmonary nodules. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 31, (2004) [8] Gonzalez-Vazquez, A.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Gutierrez-Garcia, Z. Biokinetics and dosimetry in patients of 99mTc-EDDA/HYNIC-Tyr3-octreotide prepared from lyophilized kits. Appl. Radiat. Isot., 64, (2006) [9] Czepczynski, R.; Parisella, M.G.; Kosowicz, J.; Mikolajczak, R.; Ziemnicka, K.; Gryczynska, M.; Sowinski, J.; Signore, A. Somatostatin receptor scintigraphy using 99mTc-EDDA/HYNICTOC in patients with medullary thyroid carcinoma. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 34, (2007) [10] Pearson, D.A.; Lister-James, J.; McBride, W.J.; Wilson, D.; Martel, L.J.; Civitello, E.R.; Taylor, J.E.; Moyer, B.R.; Dean, R.T. Somatostatin receptor-binding peptides labelled with technetium-99m: chemistry and initial biological studies. J. Med. Chem., 39, (1996) [11] Blum, J.; Handmaker, H.; Lister-James, J.; Rinne, N. A multicenter trial with a somatostatin analogue 99mTc-depreotide in the evaluation of solitary pulmonary nodules. Chest, 117, (2000) [12] Plachcinska, A.; Mikoajczak, R.; Kozak, J.; Rzeszutek, K.; Kumierek, J. Comparative analysis of 99mTc-depreotide and 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC thorax scintigrams acquired for the purpose of differential diagnosis of solitary pulmonary nodules. Nucl. Med.Rev., 9, (2006) [13] La Bella, R.; Garcia-Garayoa, E.; Langer, M.; Bläuenstein, P.; Beck-Sickinger, A.G.; Schubiger, P.A. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc(I)-labeled bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl. Med. Biol., 29, (2002) [14] Scopinaro, F.; Varvarigou, A.D.; Ussof, W.; De Vicentis, G.; Sourlingas, T.G.; Evangelatos, G.P. Technetium labeled bombesin like peptide: preliminary report on breast cancer uptake in patients. Cancer Biother. Radiopharm., 17, (2002) 66

83 [15] Scopinaro, F.; De Vicentis, G.; Varvarigou, A.D.; Laurenti, C.; Iori, F.; Remediani, S. 99mTc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 30, (2003) [16] Chen, X.; Park, R.; Hou, Y.; Tohme, M.; Shahinian, A.H.; Bading, J.R. micropet and autoradiographic imaging of GRP receptor expression with 64Cu- DOTA-[Lys3]bombesin in human prostate adenocarcinoma xenografts. J. Nucl. Med. 45, (2004) [17] Alves, S.; Correia, J.D.; Santos, I.; Veerendra, B.; Sieckman, G.L.; Hoffman, T.J.; Rold, T.L.; Figueroa, S.D.; Retzloff, L.; McCrate, J.; Prasanphanich, A.; Smith, C.J. Pyrazolyl conjugates of bombesin: a new tridentate ligand framework for the stabilization of fac-[m(co)3]+ moiety. Nucl. Med. Biol., 33, (2006) [18] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Rodriguez-Cortes, J. Pedraza-Lopez, M.; Ramirez-Iglesias, MT. Preparation and evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC- [Lys3]-bombesin for imaging gastrin-releasing peptide receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun., 27, (2006) [19] Zhang, X; Cai, W.; Cao, F.; Schreibmann, E.; Wu, Y.; Wu, J.C.; Xing, L.; Chen, X. 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med., 47, (2006) [20] Kunstler, J.U.; Veerendra, B.; Figueroa, S.D.; Sieckman, G.L.; Rold, T.L.; Hoffman, T.J.; Smith, C.J.; Pietzsch, H.J. Organometallic (99m)Tc(III) bombesin(7 14) conjugates: synthesis, radiolabeling, and in vitro/in vivo studies. Bioconjug. Chem., 18, (2007) [21] de Visser, M.; van Weerden, W.M.; de Ridder, C-M. Androgen dependent expression of the gastrin-releasing peptide receptor in human prostate tumor xenografts. J. Nucl. Med., 48, (2007) [22] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Pichardo- Romero, P. Targeted imaging of gastrin-releasing peptide receptors with 99mTc- EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics and dosimetry in women. Nucl. Med. Commun., 29, (2008) [23] Van de Wiele, C.; Phonteyne, P.; Pauwels, P. Gastrin-releasing peptide receptor imaging in human breast carcinoma versus immunohistochemistry. J. Nucl. Med., 49, (2008) [24] Scottelius, M.; Wester, H.-J. Molecular imaging targeting peptide receptors. Methods, 48, (2009) [25] Schroeder, R.P.J.; van Weerden, W.M.; Bangma, C.; Krenning, E.P.; de Jong, M. Peptide receptor imaging of prostate cancer with radiolabelled bombesin analogues. Methods, 48, (2009) [26] Arteaga de Murphy C, Ferro-Flores G. Bombesina y bombesinas radiomarcadas: estado actual. ALASBIMN J, 30:1-7. (2005) [27] Bunnett N. Gastrin-releasing peptide. Gut peptides: Biochemistry and physiology. Ed. JH Walsh and GJ Dockray, New York, (1994) [28] Walsh JH. Gastrointestinal hormones and peptides, Physiology of the gastrointestinal tract, 3rd Ed, Ed L.R. Jhonson, Raven Press, New York, (1981) [29] Pradhan TK, Katsuno T, Taylor JE, Kim SH, Ryan RR, Mantey SA, et al. Identification of a unique ligand which has high affinity for all four bombesin receptor subtypes. Eur J Pharmacol, 343: (1998) [30] Stangelberger A, Schally AV, Letsch M, Szepeshazi K, Nagy A, Halmos G, et al. Targeted chemotherapy with cytotoxic bombesin analogue AN-215 inhibits growth of experimental human prostate cancers. Int J Cancer, resumen electrónico anterior a la publicación. (2005) [31] Markwalder R, Reubi JC, GRP receptors in the human prostate: relation to neoplastic transformatio. Cancer Res, 59: (1999) [32] Gugger M, Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in the human breast. Am J Pathol, 155: , (1999) 67

84 [33] Ell PJ, Gambhir S Nuclear Medicine in Clinical Diagnosis and Treatment. Elsevier Health Sciences, Edinburgh, UK (ISBN: ). (2004) [34] Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, Schaer JC, Gugger M. Bombesin receptor subtypes in human cancers: detection with the universal radioligand (125)I-[D-TYR(6), beta-ala(11), PHE(13), NLE(14)] bombesin(6-14). Clin Cancer Res, 8: (2002) [35] Soluri A, Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou A, Scafe R, Massa R, Schillaci O, Spanu A, David V. 99mTc [LEU13]bombesin and a new gamma camera, the imaging probe, are able to guide mammotome breast biopsy. Anticancer Res 23: (2003). [36] Hoffman TJ, Gali H, Smith CJ, Sieckman GL, Hayes DL, Owen NK, Volkert WA. Novel series of 111In-labeled bombesin analogs as potential radiopharmaceuticals for specific targeting of gastrin-releasing peptide receptors expressed on human prostate cancer cells. J Nucl Med 44: (2003). [37] Varvarigou A, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vincentis G. Synthesis, chemical, radiochemical and radiobiological evaluation of a new 99mTc-labelled bombesin-like peptide. Cancer Biother Radiopharm 17: (2002). [38] Scopinaro F, Varvarigou A, Ussof W. Breast cancer takes up 99mTc bombesin: A preliminary report. Tumori 88: S25-S28 (2002). [39] De Vincentis G, Scopinaro F, Varvarigou A. Phase I trial of technetium [Leu13] bombesin as cancer seeking agent: Possible scintigraphic guide for surgery. Tumori 88:S28-S30 (2002). [40] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD. Use of bombesin in humans. J Clin Oncology 23: (2005). [41] Faintuch BL, Santos RLSR, Souza ALF, Hoffman J, Greeley M, Smith CJ. 99mTc-Hynic-bombesin (7-14)NH2: Radiochemical evaluation with coligands EDDA (EDDA=ethylenediamine-N,N`-diaetic acid), tricine and nicotinic acid. Synt React Inorg Met-Org Nano-Met Chem 16: (2005). [42] Smith CJ, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiolabeled peptide conjugates for targeting of the bombesin receptor superfamily subtypes. Nucl Med Biol 32: (2005). [43] Nock BA, Nikolopoulou A, Galanis A, Cordopatis P, Waser B, Reubi JC, Maina T. Potent bombesin-like peptides for GRP-receptor targeting of tumors with 99mTc: a preclinical study. J Med Chem 48: (2005). [44] Lin KS, Luu A, Baidoo KE, Hashemzadeh-Gargari H, Chen MK, Brenneman K, Pili R, Pomper M, Carducci MA, Wagner HN. A new high affinity technetium-99mbombesin analogue with low abdominal accumulation. Bioconjug Chem 16:43-50 (2005). [45] Sunday ME; Kaplan LM, Motoyama E, CHin WW, Spindel ER. Gastrin releasing peptide (mammalian bombesin) gene expresión in health and disease. Lab Invest. 59:5-24. (1988) [46] Cuttitta F, Carney DN, Mulshine J, Moody TE, Fedorko J, Fischler A, Minna JD. Bombesin-like peptides can function as autocrine growth factors in human smallcell lung cancer. Nature, 316: (1985) [47] Persinger SS, Bourdeau H, Gubish C, Tirpak D, Gaither A, Luketich J, Siegfried J. Sex-specific expression of gastrin-releasing peptide receptor: relationship to smoking history and risk of lung cancer. J of the Nat Cancer Inst, 92: (2000) [48] Fleischman A, Waser B, Jan-Olaf G, Reubi JC. Gastrin releasing peptide receptors in normal and neoplastic human uterus: involvement of multiple tissue compartments. Endocrinol Metab, 90: (2005) [49] Halmos G, Wittliff J, Schally A. Characterization of bombesin/gastrin-releasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship to steroid receptor expression. Cancer Res, 55: (1995) 68

85 [50] Kahán Z, Sun B, Schally A, Arencibia J, Cai R, Groot K, Halmos G, Inhibition of growth of MDA-MB-468 estrogen-independent human breast carcinoma by bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists RC-3095 and RC-3940-II. Cancer, 88: (2000) [51] Baidoo KE, Lin KS, Zhan Y, Finley P, Scheffel U, Wagner HN. Design, synthesis, and initial evaluation of high-affinity technetium bombesin analogues. Bioconjug Chem, 9: (1998) [52] Varvarigou AD, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vicentis G. Gastrin-releasing peptide (GRP) analogues for cancer imaging. Cancer Biother Radiopharm, 17: (2002) [53] Alves S, Paulo A, Correia JDG, Gano L, Smith CJ, Santos I. Pyrazolyl derivatives as bifunctional chelators for labeling tumor-seeking peptides with the fac-[m(co)[3]][+] moiety (M = [9][9][m]Tc, Re) : Synthesis, characterization, and biological behavior. Bioconjug Chem, 16: (2005) [54] Nock B, Nikolopoulou A, Ciotellis E, Loudos G, Maintas D, Reubi JC, Maina T. [99mTc]Demobesin 1, a novel potent bombesin analogue for GRP receptortargeted tumour imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 30: (2003) [55] de Visser M, Bernard HF, Erion JL, Schmidt MA, Srinivasan A, Waser B, Reubi JC, Krenning EP, M de Jong. Novel 111 In-labelled bombesin analogues for molecular imaging of prostate tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 34: (2006) [56] Van de Wiele C, Dumont F, Vanden Broecke R, et al. Technetium-99m RP527, a GRP analogue for visualisation of GRP receptor-expressing malignancies: a feasibility study. Eur J Nucl Med, 27: (2000) [57] Van De Wiele C, Dumont F, Dierckx RA, Peers SH, Thomback JR, Slegers G, Thierens H. Biodistribution and dosimetry of (99m)Tc-RP527, a gastrin-releasing peptide (GRP) agonist for the visualization of GRP receptor-expressing malignancies. J Nucl Med, 42: (2001) [58] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday, 2(3):14-21 (2007) [59] Garcia Garayoa, E., Ruegg, D., Blauenstein, P., et al.: Chemical and biological characterization of new Re(CO)(3)/[(99 m)tc](co)(3) bombesin analogues. Nucl Med Biol 34, (2007) [60] Reubi, J. C., Macke, H. R. and Krenning, E. P.: Candidates for peptide receptor radiotherapy today and in the future. J Nucl Med 46 (Suppl 1), 67S 75S (2005) [61] Breeman, W. A., Hofland, L. J., de Jong, M., et al.: Evaluation of radiolabelled bombesin analogues for receptor-targeted scintigraphy and radiotherapy. Int J Cancer 81, (1999) [62] Breeman, W. A., de Jong, M., Erion, J. L., et al.: Preclinical comparison of (111)In-labeled DTPA- or DOTA-bombesin analogs for receptor-targeted scintigraphy and radionuclide therapy. J Nucl Med 43, (2002) [63] de Visser, M., Bernard, H. F., Erion, J. L., et al.: Novel (111)In-labelled bombesin analogues for molecular imaging of prostate tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 34(8): (2007) [64] Zhang, H., Chen, J., Waldherr, C., et al.: Synthesis and evaluation of bombesin derivatives on the basis of pan-bombesin peptides labeled with indium-111, lutetium-177, and yttrium-90 for targeting bombesin receptor-expressing tumors. Cancer Res 64, (2004) [65] Zhang, H., Schuhmacher, J., Waser, B., et al.: DOTA-PESIN, a DOTAconjugated bombesin derivative designed for the imaging and targeted radionuclide treatment of bombesin receptorpositive tumours. Eur J Nucl Med 34, (2007) 69

86 [66] Yang, Y. S., Zhang, X., Xiong, Z., et al.: Comparative in vitro and in vivo evaluation of two 64Cu-labeled bombesin analogs in a mouse model of human prostate adenocarcinoma. Nucl Med Biol 33, (2006) [67] Smith, C. J., Gali, H., Sieckman, G. L., et al.: Radiochemical investigations of (177)Lu-DOTA-8-Aoc-BBN[7-14]NH(2): an in vitro/in vivo assessment of the targeting ability of this new radiopharmaceutical for PC-3 human prostate cancer cells. Nucl Med Biol 30, (2003) [68] Rogers, B. E., Bigott, H. M., McCarthy, D. W., et al.: MicroPET imaging of a gastrin-releasing peptide receptor-positive tumor in a mouse model of human prostate cancer using a 64Culabeled bombesin analogue. Bioconjug Chem 14, (2003) [69] Johnson, C. V., Shelton, T., Smith, C. J., et al.: Evaluation of combined (177)Lu- DOTA-8-AOC-BBN (7-14)NH(2) GRP receptor-targeted radiotherapy and chemotherapy in PC-3 human prostate tumor cell xenografted SCID mice. Cancer Biother Radiopharm 21, (2006) [70] Biddlecombe, G. B., Rogers, B. E., Visser, M. D., et al.: Molecular imaging of gastrin-releasing peptide receptor-positive tumors in mice using (64)Cu- and (86)Y- DOTA-(Pro(1),Tyr(4) )-Bombesin(1-14). Bioconjug Chem 18, (2007) [71] Lantry, L. E., Cappelletti, E., Maddalena, M. E., et al.: 177Lu-AMBA: Synthesis and characterization of a selective 177Lu-labeled GRP-R agonist for systemic radiotherapy of prostate cancer. J Nucl Med 47, (2006) [72] Van de Wiele, C., Dumont, F., van Belle, S., et al.: Is there a role for agonist gastrin-releasing peptide receptor radioligands in tumour imaging? Nucl Med Commun 22, 5 15 (2001) [73] Baum, R., Prasad, V., Mutloka, N., et al.: Molecular imaging of bombesin receptors in various tumors by Ga-68 AMBA PET/CT: first results. J Nucl Med 48, 79P (2007) [74] von Guggenberg, E.; Behe, M.; Behr, T.M.; Saurer, M.; Seppi, T.; Decristoforo, C. 99mTc-labeling and in vitro and in vivo evaluation of HYNIC- and (Nalpha- His)acetic acid-modified [D-Glu1]-minigastrin. Bioconjug. Chem., 15, (2007) [75] Nock, B.A.; Maina, T.; Behe, M.; Nikolopoulou, A.; Gotthardt, M.; Schmitt, J.S.; Behr, T.M.; Macke, H.R. CCK-2/Gastrin receptor targeted tumor imaging with 99mTc-labeled minigastrin analogs. J. Nucl. Med., 46, (2005) [76] Bhattacharya, R.; Mukherjee, P. Biological properties of naked metal nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev., 60, (2008) [77] Haubner, R.; Wester, H.J.; Reuning, U. Radiolabelled αvβ3 integrin antagonists: a new class of tracers for tumor targeting. J. Nucl. Med., 40, (1999) [78] Haubner, R.; Wester, H.J.; Burkhart, F. Glycosylated RGDcontaining peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. J. Nucl. Med., 42, (2001) [79] Haubner. R.; Kuhnast, B.; Mang, C. [18F]Galacto-RGD: synthesis, radiolabeling, metabolic stability, and radiation dose estimates. Bioconjug. Chem., 15, (2004) [80] Haubner, R.; Wester, H.J.; Weber, W.A. Non-invasive imaging of v 3 integrin expression using 18F-labelled RGD-containing glycopeptide and positron emission tomography. Cancer Res., 61, (2001) [81] Morrison, M.S.; Ricketts, S.A.; Barnett, J.; Cuthbertson, A.; Tessier, J.; Wedge, S.R. Use of a Novel Arg-Gly-Asp Radioligand, 18F-AH111585, to determine changes in tumor vascularity after antitumor therapy. J. Nucl. Med., 50, (2009) [82] Yoshimoto, M.; Ogawa, K.; Washiyama, K.; Shikano, N.; Mori, H.; Amano, R.; Kawai, K. αvβ3 integrin-targeting radionuclide therapy and imaging with monomeric RGD peptide. Int. J. Cancer, 123, (2008) 70

87 [83] Jeong, J.M.; Hong, M.K.; Chang, Y.S.; Lee, Y.S.; Kim, Y.J.; Cheon, G.J.; Lee, D.S.; Chung, J.K.; Lee, M.C. Preparation of a promising angiogenesis PET imaging agent: 68Galabeled c(rgdyk) isothiocyanatobenzyl-1,4,7-triazacyclononane- 1,4,7-triacetic acid and feasibility studies in mice. J. Nucl. Med., 49, (2008) [84] Li, Z.B.; Chen, K.; Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for micropet imaging of integrin v 3 expression. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 35, (2008) [85] Kenny, L.M.; Coombes, R.C.; Oulie, I.; Contractor, K.B.; Miller, M.; Spinks, T.J.; McParland, B.; Cohen, P.S.; Hui, A.M.; Palmieri, C.; Osman, S.; Glaser, M.; Turton, D.; Al-Nahhas, A.; Aboagye, E.O. Phase I Trial of the positron-emitting arg-gly-asp (RGD) peptide radioligand 18F-AH in breast cancer patients. J. Nucl. Med., 49, (2008) [86] Liu, Z.; Yan, Y.; Chin, F.T.; Wang, F.; Chen, X. Dual integrin and gastrinreleasing peptide receptor targeted tumor imaging using 18Flabeled PEGylated RGD-bombesin heterodimer 18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN. J. Med. Chem., 52, (2009) [87] Liu, Z.; Niu, G.; Wang, F.; Chen, X. (68)Ga-labeled NOTA-RGDBBN peptide for dual integrin and GRPR-targeted tumor imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 36, (2009) [88] Haubner, R.; Decristoforo, C. Radiolabelled RGD peptides and peptidomimetics for tumour targeting. Front. Biosci., 14, (2009) [89] Mitrasinovic, P.M. Advances in αvβ3 integrin-targeting cancer therapy and imaging with radiolabeled RGD peptides. Curr. Radiopharm., 2, (2009) [90] Zaccaro, L.; Del Gatto, A.; Pedone, C.; Saviano, M. Peptides for tumour therapy and diagnosis: Current status and future directions. Curr. Med. Chem., 16, (2009) [91] Buchegger, F.; Bonvin, F.; Kosinski, M.; Schaffland, A.O.; Prior, J.; Reubi, J.C.; Blauenstein, P.; Tourwe, P.; García-Garayoa, E.; Bischof A. Radiolabelled neurotensin analog, 99mTc-NT-XI, evaluated in ductal pancreatic adenocarcinoma patients. J. Nucl. Med., 44, (2003) [92] Korner, M.; Waser, B.; Reubi, J.C. High expression of neuropeptide Y1 receptors in Ewing sarcoma tumors. Clin. Canc. Res., 14, (2008) [93] Zwanziger, D.; Khan, I.U.; Neundorf, I. Novel chemically modified analogues of neuropeptide Y for tumor targeting. Bioconjug. Chem., 19, (2008) [94] Kersemans, V.; Kersemans, K.; Cornelissen, B. Cell penetrating peptides for in vivo molecular imaging applications. Curr. Pharm. Des., 14, (2008) [95] Deshayes, S.; Morris, M.C.; Divita, G.; Heitz, F. Interactions of primary amphipathic cell penetrating peptides with model membranes: consequences on the mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr. Pharm. Des., 11, (2005) [96] Cornelissen, B.; McLarty, K.; Kersemans, V.; Scollard, D.; Reilly, R. Properties of [111In]-labeled HIV-1 tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearing mice following intravenous or intratumoral injection. Nucl. Med. Biol., 35, (2008) [97] Costantini, D.L.; Hu, M.; Reilly, R. Peptide motifs for insertion of radiolabeled biomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging or radiotherapeutic applications. Cancer Biother. Radiopharm., 23, (2008) [98] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.A.; Ramírez, F. de M.; Luna-Gutiérrez, M.A.; Pedraza-López, M.; García-Becerra, R.; Ordaz- Rosado, D. Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of 99mTc-N2S2- Tat(49 57)-bombesin: a target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int. J. Pharm., 375, (2009) [99] Chen P, Wang J, Hope K, Jin L, Dick J, Cameron R, Brandwein J, Minden M, Reilly RM., Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and 71

88 enhance the radiotoxicity of the anti-cd33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells., J Nucl Med. May;47(5): (2006) [100] Costantini DL, Chan C, Cai Z, Vallis KA, Reilly RM., (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer., J Nucl Med., 48(8): (2007) [101] Weissleder, R.; Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology, 219, (2001) [102] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Weissleder, R. Fluorescence imaging with nearinfrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur. Radiol., 13, (2003) [103] Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, [54] Sharma, P.; Brown, S.; Walte, G.; Santra, S.; Moudgil, B. Nanoparticles for bioimaging. Adv. Colloid Interface Sci., 123, (2006) [104] Sharma, P.; Brown, S.; Walte, G.; Santra, S.; Moudgil, B. Nanoparticles for bioimaging. Adv. Colloid Interface Sci., 123, (2006) [105] Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat. Biotechnol., 19, (2001) [106] Ntziachristos, V.; Schellenberger, E.A.; Ripoll, J.; Yessayan, D.; Graves, E.; Bogdanov, A. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V Cy5.5 conjugate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, (2004) [107] Graves, E.E.; Culver, J.P.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Singularvalue analysis and optimization of experimental parameters in fluorescence molecular tomography. J. Opt. Soc. Am. A., 21, (2004) [108] Graves, E.E.; Yessayan, D.; Turner, G.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J. Biomed. Opt., 10, (doi: / ). (2005) [109] Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. submillimeter resolution fluorescence molecular imaging system for small animal imaging. Med. Phys., 30, (2003) [110] Graves, E.E.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr. Mol. Med., 4, (2004) [111] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Tung, C.; Weissleder, R. Imaging cathepsin B upregulation in HT-1080 tumor models using fluorescence-mediated molecular tomography (FMT). Acad. Radiol., 9, S (2002) [112] Ntziachristos, V.; Weissleder, R. Charge-coupled-device based scanner for tomography of fluorescent near-infrared probes in turbid media. Med. Phys, 29, (2002) [113] Gao, M.; Lewis, G.; Turner, G.M.; Soubret, A.; Ntziachristos, V. Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography. Appl. Opt., 44, (2005) [114] Gremlich, H.U.; Martinez, V.; Kneuer, R.; Kinzy, W.; Weber, E.; Pfannkuche, H.J. Non-invasive assessment of gastric emptying by near-infrared fluorescence reflectance imaging in mice: pharmacological validation with tegaserod, cisapride, and clonidine. Mol. Imaging, 3, (2004) [115] Tung, C.H.; Quinti, L.; Jaffer, F.A.; Weissleder, R. A branched fluorescent peptide probe for imaging of activated platelets. Mol. Pharm., 2, (2005) [116] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol. Imaging, 1, (2002) [117] Lyons, A.B.; Parish, C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods, 171, (1994) 72

89 [118] Kojima, H. Development of near-infrared fluorescent probes for in vivo imaging. Yakugaku Zasshi, 128, (2008) [119] Chen, X.; Conti, P.S.; Moats, R.A. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin αvβ3 in brain tumor xenografts. Cancer Res., 64, (2004) [120] Cheng, Z.; Wu, Y.; Xiong, Z.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Nearinfrared fluorescent RGD peptides for optical imaging of integrin αvβ3 expression in living mice. Bioconjug. Chem., 16, (2005) [121] Hsu, A.R.; Hou, L.C.; Veeravagu, A.; Greve, J.M.; Vogel, H.; Tse, V.; Chen, X. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin αvβ3 in an orthotopic glioblastoma model. Mol. Imaging Biol., 8, 315. (2006) [122] Wang, W.; Ke, S.; Wu, Q.; Charnsangavej, C.; Gurfinkel, M.; Gelovani, J.G.; Abbruzzese, J.L.; Sevick-Muraca, E.M.; Li, C. Near-infrared optical imaging of integrin αvβ3 in human tumor xenografts. Mol. Imaging, 3, (2004) [123] Wu, Y.; Cai, W.; Chen, X. Near-infrared fluorescence imaging of tumor integrin αvβ3 expression with Cy7-labeled RGD multimers. Mol. Imaging Biol., 8, (2006) [124] Waldeck, J.; Häger, F.; Höltke, C.; Lanckohr, C.; Wallbrunn, A.; Torsello, G.; Heindel, W.; Theilmeier, G.; Schäfers, M.; Bremer, C.Fluorescence reflectance imaging of macrophage-rich atherosclerotic plaques using an αvβ3 integrin targeted fluorochrome. J. Nucl. Med., 9, (2008) [125] Ma. L.; Yu, P.; Veerendra, B.; Rold, T.L.; Retzloff, L.; Prasanphanich, A.; Sieckman, G.; Hoffman, T.J.; Volkert, W.A.; Smith, C.J. In vitro and in vivo evaluation of alexa fluor 680-Bombesin[7-14]NH2 peptide conjugate, a high-affinity fluorescent probe with high selectivity for the gastrin-releasing peptide receptor. Mol. Imaging, 6, (2007) [126] Chan, W.C.W.; Maxwell, D.J.; Gao, X.H.; Bailey, R.E.; Han, M.Y.; Nie, S.M. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol., 13, (2002) [127] Han, M.Y.; Gao, X.H.; Su, J.Z.; Nie, S.M. Quantum dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nat. Biotechnol., 19, (2001) [128] Gao, X.H.; Nie, S.M. Doping mesoporous materials with multicolor quantum. J. Phys. Chem. B, 107, (2003) [129] Gao, X.H.; Nie, S.M. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: rapid readout using flow cytometry. Anal. Chem., 76, (2004) [130] Gao, X.H.; Yang, L.; Petros, J.A.; Marshall, F.M.; Simons, J.W.; Nie1, S. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Curr. Opin. Biotechnol., 16, (2005) [131] Gao, X.H.; Cui, Y.Y.; Levenson, R.M.; Chung, L.W.K.; Nie, S.M.In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol., 22, (2004) [132] Smith, A.; Duan, H.; Mohs, A.M.; Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev., 60, (2008) [133] Medintz, I.L.; Clapp, A.R.; Mattoussi, H.; Goldman, E.R.; Fisher, B.; Mauro, J.M. Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors. Nat. Mater., 2, (2003) [134] Shah, B.S.; Clark, P.A.; Moioli, E.K.; Stroscio, M.A.; Mao, J.J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett., 7, (2007) [135] Young, S.H.; Rozengurt, E. Qdot nanocrystal conjugated to bombesin or ANG II label the cognate G protein-coupled receptor in living cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 290, C (2006) [136] Ruan, G.; Agrawal, A.; Marcus, A.I.; Nie, S.M. Imaging and tracking of Tat peptide-conjugated quantum dots in living cells: new insights into nanoparticle 73

90 uptake, intracellular transport, and vesicle shedding. J. Am. Chem. Soc., 129, (2007) [137] Wadia, J.S.; Dowdy, S.F. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer. Adv. Drug Deliv. Rev., 57, (2005) [138] Gonczy, P.; Pichler, S.; Kirkham, M.; Hyman, A.A. Cytoplasmic dynein is required for distinct aspects of Mtoc positioning, including centrosome separation, in the one cell stage caenorhabditis elegans embryo. J. Cell Biol., 147, (1999) [139] Brust, M.; Fink, J.; Bethell, D.; Schiffrin, D.J.; Kiely, C. Synthesis and reactions of functionalised gold nanoparticles. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 16, (1995) [140] Pissuwan, D.; Valenzuela, S.M.; Cortie, M.B. Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles. Trends Biothecnol., 24, (2006) [141] Chompoosor, A.; Han, G.; Rotello, V.R. Charge dependence of ligand release and monolayer stability of gold nanoparticles by biogenic thiols. Bioconjug. Chem., 19, (2007) [142] Surujpaul, P.P.; Gutierrez-Wing, C.; Ocampo-Garcia, B.; Ramirez, F. de M.; Arteaga de Murphy, C.; Pedraza-Lopez, M.; Camacho-Lopez, M.A.; Ferro-Flores, G. Gold nanoparticles conjugated to [Tyr3]octreotide peptide. Biophys. Chem., 138, (2008) [143] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C. Tat Peptide as an efficient molecule to translocate gold nanoparticles into the cell nucleus. Bioconjug. Chem., 16, (2005) [144] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C.; Riehle, M.O.; Curtis, S.G. NPs targeting at cells. Langmuir, 22, (2006) [145] Sun, S.H.; Zeng, H.; Robinson, D.B.; Raoux, S.; Rice, P.M.; Wang, S.X.; Li, G.X. Monodisperse MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 126, (2004) [146] Lee, J.H.; Huh, Y.M.; Jun, Y.W.; Seo, J.W.; Jang, J.T.; Song, H.T.; Kim, S.; Cho, E.J.; Yoon, H.G.; Suh, J.S.; Cheon, J. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nat. Med., 13, (2007) [147] Xu, C.J.; Sun, S.H. Monodisperse magnetic nanoparticles for biomedical applications. Polym. Int., 56, (2007) [148] Baldi, G.; Bonacchi, D.; Franchini, M.C.; Gentili, D.; Lorenzi, G.; Ricci, A.; Ravagli, C. Synthesis and coating of cobalt ferrite nanoparticles: a first step toward the obtainment of new magnetic nanocarriers. Langmuir, 23, (2007) [149] Peng, S.; Wang, C.; Xie, J.; Sun, S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 128, (2006) [150] Qiang, Y.; Antony, J.; Sharma, A.; Nutting, J.; Sikes, D.; Meyer, D. Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications. J. Nanopart. Res., 8, (2006,) [151] Sun, S.H. Recent advances in chemical synthesis, self-assembly, and applications of FePt nanoparticles. Adv. Mater., 18, (2006) [152] Montet, X.; Weissleder, R.; Josephson, L. Imaging pancreatic cancer with a peptide-nanoparticle conjugate targeted to normal pancreas. Bioconjug. Chem., 17, (2006) [153] Zhao, M.; Kircher, M.F.; Josephson, L.; Weissleder, R. Differential Conjugation of Tat Peptide to Superparamagnetic Nanoparticles and Its Effect on Cellular Uptake. Bioconjug. Chem., 13, (2002) [154] Josephson, L.; Tung, C.H.; Moore, A.; Weissleder, R. Highefficiency intracellular magnetic labelling with novel superparamagnetic Tat peptide conjugates. Bioconjug. Chem., 10, (1999) 74

91 [155] Dodd, C.H., Hsu, H.C.; Chu, W.J. Normal T cell response and in vivo magnetic resonance imaging of T cells loaded with HIV transactivator-peptide-derived superparamagnetic NPs. J. Immunol. Methods, 256, (2001) [156] O Connor, M.K.; Kemp, B.J. Single-photon emission computed tomography/ computed tomography: basic instrumentation and innovations. Semin. Nucl. Med., 36, (2006) [157] Delbeke, D.; Coleman, R.E.; Guiberteau, M.J.; Brown, M.L.; Royal, H.D.; Siegel, B.A. Procedure guideline for SPECT/CT Imaging. J. Nucl. Med., 47, (2006) [158] Cai, W.; Chen, K.; Li, Z.B.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Dual-Function Probe for PET and Near-Infrared Fluorescence Imaging of Tumor Vasculature. J. Nucl. Med., 48, (2007) [159] McCann, C.M.; Waterman, P.; Figueiredo, J.L.; Aikawa, E.; Weissleder, R.; Chen, J.W. Combined magnetic resonance and fluorescence imaging of the living mouse brain reveals glioma response to chemotherapy. Neuroimage, 45, (2009) [160] Devaraj, N.K.; Keliher, E.J.; Thurber, G.M.; Nahrendorf, M.; Weissleder, R. F Labeled nanoparticles for in vivo PET-CT imaging. Bioconjug. Chem., 20, (2009) [161] Bhushan, K.R.; Misra, P.; Liu, F.; Mathur, S.; Lenkinski, R.E.; Frangioni, J.V. Detection of breast cancer microcalcifications using a dual-modality SPECT/NIR fluorescent probe. J. Am. Chem. Soc., 130, (2008,) [162] Srivastava S, Dadachova E Recent advances in radionuclide therapy. Semin Nucl Med 31: (2001) [163] Milenic DE, Brady ED, Brechbiel MW Antibody-targeted radiation cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 3: (2004) [164] Zweit J Radionuclides and carrier molecules for therapy. Phys Med Biol 41: ] (1996) [165] Buchegger F, Perillo-Adamer F, Dupertuis YM, Delaloye AB. Auger radiation targeted into DNA: a therapy perspective., Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33(11): (2006) [166] O Donoghue JA, Wheldon TE Targeted radiotherapy using Auger electron emitters. Phys Med Biol 41: (1996) [167] Adelstein SJ, Kassis AI, Bodei L, Mariani G Radiotoxicity of iodine-125 and other auger-electron-emitting radionuclides: background to therapy. Cancer Biother Radiopharm 18: (2003) [168] Howell RW. Radiation spectra for Auger-electron emitting radionuclides: report No. 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No. 6., Med Phys. 19(6): (1992) [169] Tavares AA, Tavares JM. (99m)Tc Auger electrons for targeted tumour therapy: a review., Int J Radiat Biol.;86(4): (2010) [170] Britz-Cunningham S, Adelstein S. Molecular Targeting with Radionuclides: State of the Science. Journal of Nuclear Medicine 44: (2003) [171] Sofou S.. Radionuclide carriers for targeting of cancer. International Journal of Nanomedicine 3: (2008) [172] Unak P. Targeted Tumor Radiotherapy. Brazilian Archives of Biology and Technology 45: (2002) [173] Boyd M, Ross S, Dorrens J, Fullerton N, Tan K, Zalutsky M, Mairs R. Radiation- Induced Biologic Bystander Effect Elicited In Vitro by Targeted Radiopharmaceuticals Labeled with α-, β-, and Auger Electron-Emitting Radionuclides. Journal of Nuclear Medicine 47: (2006) [174] Sastry K.. Biological Effects of the Auger Emiter Iodine-125: A Review. Report No.1 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6. Medical Physics 19: (1992) 75

92 [175] Boswell C, Brechbiel M. Auger Electrons: Lethal, Low Energy, and Coming Soon to a Tumor Cell Nucleus Near You. Journal of Nuclear Medicine 46: (2005) [176] Eriksson D, Riklund K, Johansson L, and Stigbrand T, Radiation Induced Cell Deaths, Targeted Radionuclide Tumor Therapy Biological Aspects, Ed. Springer ISBN (2008) [177] Urashima T, Nagasawa H, Wang K, Adelstein S, Little J, Kassis A. Induction of Apoptosis in Human Tumor Cells After Exposure to Auger Electrons: Comparation with Gamma-Ray Exposure. Nuclear Medicine and Biology 33: (2006) [178] Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annual Review of Physiology, 60: (1998) [179] Galluzzi L, Maiuri MC, Vitale I, Zischka H, Castedo M, Zitvogel L, Kroemer G. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death and Differentiation; 14(7): (2007) [180] Akagi Y, Ito K, Sawada S. Radiation-induced apoptosis and necrosis in Molt-4 cells: a study of dose-effect relationships and their modification. International Journal of Radiation Biology; 64(1): (1993) [181] Roninson IB, Broude EV, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatmentinduced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resistance Updates; 4(5): (2001) [182] Harms-Ringdahl M, Nicotera P, Radford IR. Radiation induced apoptosis. Mutation Research; 366(2): (1996) [183] Gisselsson D. Mitotic instability in cancer: is there method in the madness? Cell Cycle (Georgetown, TX); 4(8): (2005) [184] Eriksson D, Lofroth PO, Johansson L, Riklund KA, Stigbrand T. Cell cycle disturbances and mitotic catastrophes in HeLa Hep2 cells following 2.5 to 10 Gy of ionizing radiation. Clinical Cancer Research; 13(18 Pt 2):5501s 8s. (2007) [185] Eriksson D, Joniani HM, Sheikholvaezin A, Lofroth PO, Johansson L, Riklund Ahlstrom K, Stigbrand T. Combined low dose radio- and radioimmunotherapy of experimental HeLa Hep2 tumours. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging; 30(6): (2003) [186] Roninson IB, Broude EV, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatmentinduced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resistance Updates; 4(5): (2001) [187] Castedo M, Kroemer G. [Mitotic catastrophe: a special case of apoptosis]. Journal de la Societe de biologie; 198(2): (2004) [188] Erenpreisa J, Kalejs M, Lanzini F, et al. Segregation of genomes in polyploid tumour cells following mitotic catastrophe. Cell Biology International; 29(12): (2005) [189] Lundqvist H, Stenerlöw Bo, and Gedda L, The Auger Effect in Molecular Targeting Therapy, Targeted Radionuclide Tumor Therapy Biological Aspects, Ed. Springer ISBN (2008) [190] [69] Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: the second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med 46: (2005) [191] International Commission on Radiological Protection. ICRP Publication 92: Relative Biological Effectiveness (RBE), Quality Factor (Q), and Radiation Weighting Factor (WR). Stockholm, Sweden: International Commission on Radiological Protection; (2003) [192] National Council on Radiation Protection and Measurements. Radiation Protection Guidance for Activities in Low-Earth Orbit. Bethesda, MD: National Council on Radiation Protection and Measurements;. Report Number 132. (2000) 76

93 [193] Fitzek MM, Thornton AF, Rabinov JD, et al. Accelerated fractionated proton/photon irradiation to 90 cobalt gray equivalent for glioblastoma multiforme: results of a phase II prospective trial. J Neurosurg.;91: (1999) [194] Trofimov A, Nguyen PL, Coen JJ, et al. Radiotherapy treatment of early-stage prostate cancer with IMRT and protons: a treatment planning comparison. Int J Radiat Oncol Biol Phys.;69: (2007) [195] Sgouros G, Howell RW, Bolch WE, Fisher DR., MIRD commentary: proposed name for a dosimetry unit applicable to deterministic biological effects--the barendsen (Bd)., J Nucl Med.; 50(3): (2009) [196] Strand SE, Znzonico P, Jonson TK. Pharmacokinetic modeling. Med Phys, (20): (1993) [197] Makoid Michael, Vucherich Philip, Basic Pharmacokinetics,. ( ) [198] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday, 2(3):14-21 (2007) [199] Goddu SM, Howell RW, Rao DV. Calculation of equivalent dose for Auger electron emitting radionuclides distributed in human organs. Acta Oncol;35: (1996) [200] O Donoghue J, Wheldon T. Targeted radiotherapy using Auger electrons emitters. Physics in Medicine and Biology 41: (1996) [201] Kassis AI, Fayad F, Kinsey BM, Sastry KS, Taube RA, Adelstein SJ. Radiotoxicity of 125I in mammalian cells. Radiat Res;111: (1987) [202] Goddu S M, Howell R W, Bouchet L G, Bolch W E, Rao D V., MIRD Cellular S Values, Society of Nuclear Medicine [203] Carrasco R, Fernández de Córdoba, García Raffi L. Sanchís J. Métodos de Simulación Monte Carlo y sus aplicaciones, Valencia España, Universidad Politécnica de Valencia, (2000) [204] Morin R L., Monte Carlo Simulation in the Radiological Sciences. United Kingdom CRC Press, (1988) [205] Reuven R. Simulation and the Monte Carlo Method. New York USA, John Wiley and Sons (1981) [206] Rojas Calderón E L. Aplicaciones de la simulación Monte Carlo en dosimetría y problemas de física médica, Contribuciones del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares al Avance de la Ciencia y la Tecnología en México Ed Conmemorativa (2010) [207] Denise B. Pelowitz, editor. MCNPXTM Users Manual La-CP , Versión Los Alamos USA, (2005) [208] Salvat F., Fernández Varea, Sempau J. PENELOPE a code system for Monte Carlo simulation of electron and poton transport. Workshop Proceedings, Issyles.Molineaux, France, (2001) [209] Sempau J, Fern.ndez-Varea J M, Acosta E and Salvat F 2003 Experimental benchmarks of the Monte Carlo ode PENELOPE, Nucl. Inst. Meth. In Phy. Res. B , (2003) [210] P. L'Ecuyer, Efficient and portable combined random number generators. In: ACM, (New York: ACM) pp742-51, (1988) [211] Rossi H, Zaider M, Microdosimetry and its applications, Springer (1996) [212] Microdosimetry, ICRU Report 36 (1983) 77

94 Capítulo 3 Marco Metodológico 78

95 3.1. Obtención de los radiofármacos [ 99m Tc]EDDA/HYNIC-Lys 3 -BN ( 99m Tc-BN), [ 99m Tc]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 99m Tc-Tat-BN) y [ 188 Re]N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 188 Re-Tat-BN) Síntesis de HYNIC-Lys 3 -BN Síntesis de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN El ácido hidrazinonicotínico (HYNIC) se conjugó, en medio acuoso y a ph 9.0, al grupo ε-amino del residuo de Lys 3 en la región N-terminal de la BN utilizando como precursor al succinimidil-n-boc-hynic. Alternativamente se utilizó la reacción en medio no acuoso con dimetilformamida (DMF) utilizando el precursor N-Boc-HYNIC y como activador del grupo carbonilo al hexafluorofosfato O-(7-azabenzotriazolil)-1,1,3,3 tetrametiluronium (HATU). El proceso de purificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y extracción en fase sólida (SepPack cartridge C-18) [27]. El péptido HYNIC-BN (Pyr-Gln-Lys (HYNIC)-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH 2, peso molecular: g/mol) fue sintetizado por PiChem (Graz, Austria) con una pureza > 98 % analizada por HPLC en fase reversa y espectrometría de masas. El péptido Tat(49-57) se conjugó a la secuencia de amino ácidos Gly- Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-NH 2 para producir un péptido del tipo Tat(49-57)- espaciador-n 2 S 2 (El N 2 S 2 es el sitio de quelación del péptido para unirse al 99m Tc). Por otro lado, la Lys 3 -BN se conjugó al reactivo maleimidopropil (MPA) y el sitio Lys-MPA se utilizó como posición de unión para formar un tioéter con la Cys del péptido Tat(49-57)-espaciador-N 2 S 2. Los análisis por HPLC, espectrometría de masas y análisis de aminoácidos se realizaron. En esta parte del proyecto se contó con el apoyo de una compañía farmacéutica (Bachem, CA, USA). Se obtuvo un certificado que indica que tiene una pureza química >90% y un peso molecular de g/mol, pero la propuesta y el diseño de la estructura del péptido híbrido es de este grupo de trabajo. 79

96 Modelado Molecular La estructura de la molécula del péptido N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN se construyó tomando en cuenta la valencia, el tipo de unión, carga e hibridación. Las energías mínimas (cálculos utilizando campos de fuerza de Mecánica Molecular 3, MM3 aumentados) y el confórmero con menor energía (formalismo CONFLEX) asociado a la geometría óptima de esta estructura se calcularon utilizando el programa de cómputo para Windows CAChe Pro 5.02 y/o 5.04 (Fujitsu Ltd., ). De la aplicación secuencial de los métodos MM3 aumentado/conflex se obtuvieron los confórmeros más estables para las estructuras de los complejos N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN, Tc(O)N 2 S 2 -Tat(49-57)- Lys 3 -BN y Re(O)N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys 3 -BN con 99m Tc La formulación liofilizada [1] se preparó disolviendo 1 mg de HYNIC-Lys 3 -BN en 1 ml de etanol al 10%, y se agregó a una solución de EDDA (ác. etiléndiaminodiacético)-tricina-manitol. El cloruro estanoso (1.6 ml) se adicionó bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se esterilizó por filtración en membrana (Millipore, 0.22 µm) y se colocó 1 ml en 80 viales preesterilizados y se liofilizaron por 24 h. A los estuches se les hicieron pruebas de esterilidad y apirogenicidad. El procedimiento de radiomarcado se realizó adicionando 1 ml de buffer de fosfatos 0.2 M y ph 7 a la formulación liofilizada e inmediatamente MBq (1 ml) de pertecneciato de sodio, obtenido de un generador GETEC de 99 Mo/ 99m Tc (ININ, México). La solución se dejó reaccionar en un baño seco a 92 C por 15 min. Todos los reactivos f ueron adquiridos en Sigma- Aldrich Chemical Co. y utilizados como se recibieron. 80

97 3.1.5 Procedimiento de radiomarcado de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN con 99m Tc La desprotección de los grupos acetamidometil (Acm) y el proceso de radiomarcado del N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN, se realizaron en un solo paso por reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso en presencia de acetato de amonio y tartrato de sodio a temperatura ambiente. Fue necesario tener un ph de 9.5 para desacetilar las cadenas laterales Cys 14 (Acm) y Cys 16 (Acm) del péptido Tat(49-57)-espaciador-N 2 S 2 que es necesario para la unión del tecnecio [2-4]. El N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN (1 mg) se disolvió en 200 µl de agua inyectable (Pisa, México), se agregaron 10 µl de esta solución a 25 µl de 99m Tc-pertecneciato de sodio (185 MBq), se adicionaron 7 µl de una mezcla de desprotección (50 mg/ml de tartrato de sodio en 0.1 M NH 4 OH/NH 4 CH 3 COOH, ph 9.5) y 3 µl de solución reductora (0.5 mg de SnCL 2 /ml en 0.05 M HCl), la mezcla final se incubó por 20 min a temperatura ambiente. El 99m Tc-pertecneciato de sodio se obtuvo de un generador GETEC 99 Mo/ 99m Tc (ININ-México). El resto de los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. y se utilizaron tal como se recibieron Procedimiento de radiomarcado de N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN con 188 Re El 188 Re es ligeramente más rico en electrones respecto al 99m Tc, por ello el potencial de oxidación es mayor y tiende a ser inestable con diferentes agentes quelantes. Sin embargo, complejos del tipo [Re=O]N 2 S 2 son altamente estables cuando se conjugan a diversas biomoléculas. La desprotección de los grupos Acm y el proceso de radiomarcado del N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN, se realizó en un solo paso por reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso a ph ácido (2-4) y en presencia de tartrato de sodio [5,6]. 81

98 El 188 Re-perrenato de sodio se obtuvo de un generador de 188 W/ 188 Re (Polatom). Los demás reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. y se utilizaron como fueron recibidos. El N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN (1 mg) se disolvió en 200 µl de agua inyectable (Pisa, Mexico). El ácido ascórbico (2 o 0 mg, utilizado como antioxidante) se disolvió junto con el tartrato de sodio (816 mg) en 5 ml de solución de cloruro estanoso (SnCl 2 en 0.06 M HCl). La solución de 188 Re-perrenato de sodio (100 µl, 40 MBq) se ajustó a ph de 1, se agregó a la solución del péptido junto con 300 µl de la solución de cloruro estanoso-tartrato de sodio. El ph de la mezcla de reacción se midió y se dejó reaccionar por 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ó 24 h a temperatura ambiente ó 92 C. El diseño factorial del experimento se muestra en la tabla 6 [5,6]. Tabla 6. Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con 188 Re*. Clase Niveles Valores [Tat-BN] (mg/ml) , 0.29, 0.54 [Ácido ascórbico] (mg/ml) 2 0, 4.35 Temperatura ( C) 2 18, 92 Tiempo de incubación (h) 7 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 24 * Variable dependiente: pureza radioquímica Evaluación de la pureza radioquímica de 188 Re-Tat-BN 99m Tc-Tat-BN y Los análisis de pureza radioquímica se realizaron por cromatografía instantánea de capa fina en gel de sílica (ITLC-SG, Gelman Sciences), extracción en fase sólida (cartuchos Sep-Pack C-18) y por HPLC de fase reversa. 82

99 Los análisis de ITLC-SG se efectuaron utilizando dos diferentes fases moviles: 2-butanona para determinar la cantidad de 99m TcO - 4 libre (Rf = 1, Rf = relación de frentes o factor de retención y es la distancia recorrida por el soluto entre la distancia recorrida por el solvente) y citrato de sodio 0.1 M con ph 5 para establecer el porcentaje de 99m Tc-tartrato y 99m TcO - 4 (Rf = 1). El valor de Rf del péptido radiomarcado en cada sistema fue de 0.0. Los cartuchos Sep-Pak se preacondicionaron con 5 ml de etanol seguidos de 5 ml de HCl 1 mm de aire. Una alícuota de 0.1 ml del péptido radiomarcado se cargó en el cartucho previamente acondicionado, seguido de 5 ml de HCl 1 mm para eluir el 99m - TcO 4 libre y el 99m Tc-tartrato. El péptido radiomarcado se eluyó con 3 ml de etanol:solución salina (1:1 v/v) mientras que el 99m Tc reducido y el coloide formado quedaron en el cartucho. Los análisis por HPLC se llevaron a cabo con el sistema Waters usando el software Millenium con dos detectores, el de radiactividad y el de UV arreglados en línea y la columna YMC ODS-AQ S5 (5 µm, 4.6 mm x 250 mm). El gradiente se corrió a la tasa de flujo de 1 ml/min con las condiciones siguientes: ácido trifluoroacético (TFA) 1% en agua (fase A) y TFA 1 % en acetonitrilo (fase B). El gradiente utilizado se muestra en la tabla 7. Tabla 7. Gradiente de concentración de la fase móvil Tiempo Flujo % % (min) (ml/min) Fase A Fase B

100 En este sistema los tiempos de retención para 99m TcO 4 - libre, 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN fueron 3-4 min y min (para ambos radiofármacos) respectivamente Estabilidad en suero humano Para estimar la estabilidad en suero humano de 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN se utilizó el análisis por HPLC de exclusión molecular y el de ITLC-SG. Una solución de 50 µl de péptido radiomarcado (0.5 µl/50 µg) se incubó a 37 C con 1 ml de suero humano fresco. La estabilidad radioquímica se determinó a partir de muestras para análisis de 10 µl tomadas a diferentes tiempos desde 20 min hasta 24 h. Un cambio en el perfil de radiactividad del HPLC hacia pesos moleculares altos indica unión a proteínas, mientras que picos de bajo peso molecular muestra catabolitos marcados o unión a cisteina del suero Desafío a la cisteina La estabilidad de los radiofármacos 99m Tc-Tat-BN y 188 Re-Tat-BN se probó a través de su unión a la cisteina. Una solución fresca de cisteina se preparó (10 mg/ml en PBS 0.1 M, ph 7.0) y se diluyó para tener diferentes concentraciones. Posteriormente, 10 µl de cada solución se mezcló con 90 µl del péptido radiomarcado (20 µm). Las relaciones molares de cisteina:péptido fueron 5:1, 50:1 y 500:1. Los tubos de prueba se incubaron a 37 C por 1 h y se analizó la pureza radioquímica por ITLC-SG Pruebas in vitro Líneas celulares Células de cancer de próstata PC3 y células de carcinoma mamario MCF7 y MDA-MB231 se obtuvieron originalmente de ATCC (USA). Las células se cultivaron a 37 C, con atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad de 100 % en medio RPMI (medio Roswell Park Memorial Institute ) suplementado con 10% de suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina, 100 µg/ml). 84

101 Prueba de internalización y unión no específica Las células PC3, MCF7 o MDA-MB231 suministradas en medio fresco se diluyeron para tener 1x10 6 células/tubo y se incubaron con aproximadamente 200,000 cpm de 99m Tc-BN (péptido total 0.3 nmol), 99m Tc-Tat-BN ó 188 Re-Tat-BN (BN total 0.3 nmol) por triplicado a 37 C durante 0.083, 2, 4, 6 y 24 h. Los tubos de ensayo se centrifugaron (3 min, 500 g), se lavaron dos veces con buffer de fosfato salino (PBS), y se determinó la actividad en el botón celular en un detector de centelleo tipo pozo. La radiactividad en el botón celular representó tanto el péptido externalizado (unido a la superficie celular) como el péptido internalizado. Se tomó una alícuota con la actividad inicial que significó el 100% y entonces se calculó la actividad captada en las células. La actividad del péptido externalizado se removió con 1 ml de solución de ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M que se utilizó para resuspender el botón. Los tubos de ensayo se centrifugaron, lavaron con PBS, volvieron a centrifugar y la actividad en el botón se consideró como la internalización. El botón celular se resuspendió con NaOH 1 M para lisar las células, se centrifugó y lavó con PBS. La actividad del sobrenadante constituyó la captación en el citoplasma. La unión no específica se determinó en paralelo pero en presencia de Lys 3 -BN 10 µm (Bachem USA) para bloquear a los GRPr en la membrana celular Internalización nuclear de 99m Tc-Tat-BN La distribución de 99m Tc-Tat-BN en citoplasma y núcleo se estudió en las células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Las células se incubaron con el radiofármaco durante 0.5, 1, 2, 4, 6 o 24 h, posteriormente, se separó el citoplasma y el núcleo usando un estuche de extracción nuclear (Chemicon International Inc., CA, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se lavaron con 1 ml de ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M. Los tubos de ensaye se centrifugaron (250 x g), se lavaron con PBS, se volvieron a 85

102 centrifugar y la actividad del botón se midió en un detector de centelleo de tipo pozo (contador gamma) y se consideró como el 100 % de la actividad internalizada. El botón celular se resuspendió con la solución de lisis citoplasmático. Para obtener la suspensión de células lisadas, la suspensión de células se aspiró y se expulsó utilizando una jeringa con una aguja de calibre 27 y se centrifugó a 8000 x g durante 20 min a 4 C. El sobrenadante que contenía la porción citosólica de las células lisadas se midió en un contador gamma. El botón con la fracción nuclear del lisado de células se resuspendió en la solución de extracción nuclear y después de lisar los núcleos la suspensión se centrifugó a 1600 x g durante 5 min a 4 C. el extracto nuclear fue el sobrenadante y en el botón permanecieron las membranas. La radiactividad en la fracción con el extracto nuclear y el botón se midieron en un contador gamma y se calcularon los porcentajes de actividad en cada compartimento subcelular a diferentes tiempos Modelo Biocinético Los porcentajes de actividad obtenidos a diferentes tiempos de los radiofármacos en la membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer se usaron para elaborar las curvas de actividad-tiempo de 99m Tc. La biocinética subcelular de 188 Re-Tat-BN se calculó a partir del comportamiento biológico de 99m Tc-Tat-BN (q(t) vs t), considerando el tiempo de vida media físico del 188 Re (e -λt, donde λ= ln2/17h). Los datos de la cinética de los radiofármacos se ajustaron a una función exponencial utilizando el código OLINDA/EXM [7]. Al integrar sobre el tiempo la actividad, como el número de desintegraciones por unidad de tiempo, se obtiene el número total de desintegraciones (N = Bq s) en la membrana, citoplasma o núcleo expresado por unidad de actividad inicial internalizada en las células de cáncer (ec 3.1). t λt N = A0 e ( t) dt 0 ec

103 Análisis estadístico Las diferencias entre los datos de los experimentos in vitro se evaluaron por la prueba de t de Student. Dicha prueba se refiere al análisis estadístico de la comparación de dos medias, es decir, se comparan dos grupos (normalmente dos tratamientos) con relación a una variable de eficacia cuantitativa Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de cáncer por inmunocitoquímica Las células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (1x10 5 /pozo) se cultivaron a 37 C, una atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad al 100 % en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina 100 µg/ml) en portaobjetos de vidrio tipo pozo. Las células se incubaron con 5 ml de Tat- BN diluido en 1 ml de medio RPMI por 1 h. Posterior al tratamiento las células fueron enjuagadas con PBS frío, se fijaron con formaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 25% y se lavaron con PBS. Después de incubarlas a temperatura ambiente durante 30 min con BSA (albúmina de suero bovino) al 1% en PBS, las células se incubaron por 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo primario VIH Tat (1:500) (Abcam Inc., UK) y luego con el anticuerpo secundario (1:700) conjugado con fluoróforos (Anticuerpo secundario de oveja IgG H&L (FITC); Abcam Inc., UK). Después del marcado con los anticuerpos primario y secundario, las células se enjuagaron con PBS previo al montaje en los portaobjetos (ProLong Gold; Molecular Probes). Los controles negativos incluyeron células sin tratamiento con Tat-BN y/o sin anticuerpo primario. Las imágenes del Tat-BN internalizado en las tres líneas de células de cáncer marcadas por inmunofluorescencia se realizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM510 META, con un objetivo 40x/0.75Ph2 Plan-Neofluar, y un filtro BP IR y una longitud de onda 488 nm, 20 %. 87

104 Efecto del 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular El efecto antiproliferativo del 99m Tc-Tat-BN en las células de cáncer PC3, MCF7 o MDA-MB231 se evaluó utilizando un estuche de ensayos de proliferación celular CyQuant (Molecular Probes, Invitrogen). El estuche utiliza un colorante verde fluorescente patentado que muestra un aumento en la fluorescencia cuando se une a los ácidos nucleares celulares. Una curva estándar de referencia se creó para convertir los valores de fluorescencia a cantidad de ADN utilizando un ADN bacteriófago-λ y siguiendo el protocolo del fabricante. Aproximadamente 1x10 3 células de las líneas PC3, MCF7 o MDA-MB231 se sembraron por pozo en microplacas de cultivo de 96 pozos. Las células se cultivaron por 24 h y el medio de crecimiento se remplazó por medio fresco conteniendo dos concentraciones diferentes de los fármacos Tat-BN (1.3 y 2 µm) o 99m Tc-Tat-BN (14 MBq/nmol, 1.3 µm (3.6 MBq) y 2.0 µm (5.5 MBq)) (n=6). Para los controles positivos y negativos se utilizaron células incubadas con medio sin estímulo (células sin tratamiento como control negativo) o con astemizol 2.5 µm como agente antiproliferativo (control positivo) (n=6) [8]. Las células se cultivaron durante 6 días a 37 C y el me dio se remplazó al día 3 utilizando una segunda dosis de estímulo de Tat-BN (1.3 y 2.0 µm) o 99m Tc-Tat- BN (7 MBq/nmol, 1.3 µm (1.8 MBq) y 2 µm (2.8 MBq). En el día 6, las células fueron congeladas durante 30 min (-70 C), descongel adas y lisadas al agregar la solución de CyQuant con el marcador verde fluorescente. La fluorescencia se midió directamente a una excitación/emisión máxima de 480/520 nm. La absorbancia de los pozos se midió en un lector de microplacas (Bio-Tek, Sinergy HT). Finalmente, las absorbancias de los pozos se correlacionaron con las concentraciones de ADN (ng/ml) utilizando la curva estándar. 88

105 3.3. Pruebas in vivo Estudios de Biodistribución Los estudios de biodistribución y captación tumoral en ratones se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Norma Oficial Mexicana 062-ZOO Ratones sanos BALB/c de 6 semanas de edad se utilizaron para los estudios de biodistribución. En la vena de la cola se les inyectó 1.11 MBq (30 µci) en 0.04 ml de 99m Tc-Tat-BN. Los ratones (n=3) se sacrificaron a las 0.25, 0.5, 2, 4, y 24 h posteriores a la inyección. Muestras de corazón, pulmón, hígado, bazo, páncreas, riñones, intestinos, músculo, hueso y sangre se tomaron, colocaron en tubos de plástico previamente pesados. La actividad se determinó en un detector centelleador tipo pozo (Canberra) junto con 6 alícuotas de 0.5 ml del estándar diluido que representó el 100% de la actividad inyectada. El promedio de las actividades se utilizó para obtener el porcentaje de actividad inyectada por gramo de tejido (%AI/g) Inducción de tumores en ratones atímicos Los ratones atímicos machos (20-22 g) que se utilizaron se mantuvieron en jaulas estériles con camas de aserrín, temperatura y humedad constante y periodos de luz/obscuridad 12/12 h. Se les proporcionó a los ratones acceso ad libitum a alimentos y agua (standard PMI 5001 feed). Los tumores de próstata se indujeron en la parte trasera superior de 4 ratones atímicos de 6-7 semanas de edad vía una inyección subcutánea de células PC3 (1x10 6 ) suspendidas en 0.2 ml de PBS. Los sitios de inyección se observaron a intervalos regulares para verificar la formación y progresión tumoral. 89

106 Imágenes Los ratones atímicos con tumores implantados se sacrificaron 2 h posteriores a la administración en la vena de la cola de los radiofármacos 99m Tc-Tat-BN o 99m Tc-BN (3 MBq en 0.04 ml). Las imágenes se tomaron con una gamma cámara utilizando un colimador tipo pinhole. Finalmente, se llevó a cabo la disección completa de los órganos para determinar el porcentaje de actividad inyectada por gramo de tejido (%AI/g) como se describe anteriormente Dosimetría subcelular La dosis absorbida de radiación depositada en el núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de 99m Tc-Tat-BN o 188 Re-Tat-BN se estimó por el método Monte Carlo utilizando el programa Penmain del código PENELOPE La geometría y tamaño de las células y núcleo se construyó a partir de las imágenes de inmunofluorescencia (n=50) y las dimensiones promedio se determinaron utilizando el Software Zeiss LSM Image Examiner (Carl Zeiss AG). Los volúmenes de los compartimentos subcelulares se calcularon (tabla 8) y la composición elemental de la membrana, citoplasma y núcleo se obtuvo de la literatura (tabla 9) [9,10]. 90

107 Tabla 8. Geometría y volumen del citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Línea celular Volumen (µm 3 ) Citoplasma Núcleo Geometría PC3 (Longitud promedio 80 x 33 µm, profundidad 20 µm: núcleo 23 x 17 µm)* MCF7 (Longitud promedio 56 x 22 x 49 µm, profundidad 14 µm: núcleo 16 x 11 µm)* MDA-MB231 (Longitud promedio 66 x 32 µm, profundidad 17 µm: núcleo 18 x 14 µm)* *Zeiss LSM Image Examiner Software (Carl Zeiss AG) Tabla 9. Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo [9,10]. Elementos H C N O P S Otros (Porcentaje en peso) Núcleo celular Citoplasma y Membrana Ca(1.5), k(0.35), Na(0.15), Mg(0.05), Cu, Zn, Se, Mo, F, Cl, I, Mn, Co, Fe (todos 0.70) Li, Sr, Al, Si, Pb, V, As, Br (todos 0.001) 91

108 La simulación de la fuente se realizó utilizando todas las emisiones de electrones de CI y Auger (incluidos los Coster-Kroning y Super-Coster-Kroning) del espectro de 99m Tc reportado por la AAPM (tabla 10) [11]. La fuente de 188 Re se simuló utilizando las emisiones β con mayor probabilidad de ocurrencia, electrones CI de más alta probabilidad de emisión y los electrones Auger del espectro reportado por el Laboratorio Nacional Henri Bequerel de Francia (tabla 11) [12]. Tabla 10. Espectro de radiación promedio del 99m Tc utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo. Emisión Energía promedio (MeV) Yield/decaimiento IC 1 M,N 1.82E E-01 IC 2 K 1.19E E-02 IC 2 L 1.37E E-02 IC 2 M;N 1.40E E-03 IC 3 K 1.22E E-03 IC 3 L 1.40E E-03 Auger KLL 1.53E E-02 Auger KLX 1.78E E-03 CK LLX 4.29E E-02 Auger LMM 2.05E E-02 Auger LMX 2.32E E-02 Auger LXY 2.66E E-03 CK MMX 1.16E E-01 Auger MXY 2.26E E+00 CK NNX 3.34E E+00 92

109 Tabla 11. Espectro de radiación promedio del 188 Re utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo. Emisión Energía promedio (MeV) Yield/decamiento β E E-03 β E E-03 β E E-02 β E E-01 β E E-01 Auger L 6.88E E-02 Auger K E E-03 CE K 81.17E E-02 CE L E E-02 CE M E E-02 La energía depositada (MeV) por desintegración por gramo del núcleo celular se convirtió a Gy (J/Kg)/desintegración (Bq s) y la D en el núcleo producida por 99m Tc-Tat-BN o 188 Re-Tat-BN se calculó multiplicando los Gy/Bq s por el número total de desintegraciones (N) que ocurrieron en el núcleo por unidad de radiactividad (Bq) internalizada, basado en los resultados de la biocinética experimental. Las contribuciones a la D en el núcleo provenientes de la captación de los radiofármacos en la membrana y citoplasma también se calcularon para obtener la D total al núcleo por cada Bq internalizado en las células de cáncer PC3, MCF7 o MDA-MB231 (Gy/Bq). Los porcentajes de absorción de cada emisión (espectro, electrones Auger y CI) en cada región subcelular se calcularon de la siguiente manera: Energía absorbida en la célula % Absorción = * 100 ec 3.2. Energía emitida por decaimiento 93

110 Energía absorbida en la región subcelular % Subabsorci ón = * 100 ec 3.3. Energía absorbida en la célula 3.5. Referencias [1] Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Rodriguez-Cortes, J., Pedraza-Lopez, M., Ramirez-Iglesias, M.T., Preparation and evaluation of 99m Tc- EDDA/HYNIC-[Lys3]- bombesin for imaging of GRP receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun. 27, [2] Bogdanov, A., Tung, C.-H., Bredow, S.,Weissleder, DNA binding chelates for nonviral gene delivery imaging. Gene Ther. 8, R., [3] Zhang, X., Cai,W., Cao, F., Schreibmann, E.,Wu, Y.,Wu, J.C., Xing, L., Chen, X., 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med. 47, [4] Zhang, Y.-M., Tung, C.H., He, J., Liu, N., Yanachkov, I., Liu, G., Rusckowski, M., Vanderheyden, J.L., Construction of a novel chimera consisting of achelatorcontaining Tat peptide conjugated to amorpholino antisense oligomerfor technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl. Med. Biol.33, [5] L.Meléndez Alanfort, G. Ferro Flores, C. Arteaga de Murphy, M. Pedraza-López, M.A. González Zavala, J.I. Tendilla, L. García Salinas Labeling peptides with rhenium-188., Int. J. Pharm [6] Ferro-Flores G, Torres-Garcia E, Garcia-Pedroza L, Arteaga de Murphy C, Pedraza-Lopez M, Garnica-Garza H. An efficient, reproducible and fast preparation of 188 Re-anti-CD20 for the treatment of non-hodgkin's lymphoma. Nucl Med Commun 26: [7] Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: The second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med.; 46:1023-7, [8] Garcia-Ferreiro RE, Kerschensteiner D, Major F, Monje F, Stumer W, Pardo LA. Mechanism of block of heag1 K+ channels by imipramine and astemizole. J Gen Physiol.;124:301-17, [9] ICRU 44, Tissue substitutes in radiation dosimetry and measurement. ICRU Report 44- International Commission on Radiation Units and Measurements., Rodwell V. [10] Organic Chemistry: The Elemental Basis of Life. John Wiley & Sons Inc. USA, [11] Howell R. Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No. 6. Med Phys. 19: [12] Decay Data Evaluation Project BNM-CEA/LNHB-Table de Radionucléides-CEA ISBN Re, LBNL /E. Browne

111 Capítulo 4 RESULTADOS 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-BN 95

112 4.1 Diseño y preparación HYNIC-Lys 3 -BN En la figura 8 se observa el diseño de la molécula, con el sitio de reconocimiento biológico de la BN y la zona de quelación con el 99m Tc a través del quelante bifuncional HYNIC. Figura 8. Estructura de la molécula HYNIC-Lys 3 -BN. 96

113 4.1.2 N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN En la figura 9 se observa el diseño del N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN. Por un lado tiene la secuencia de aminoácidos de la Lys 3 -BN, que contiene el sitio de reconocimiento específico para su unión con los GRPr, por otro lado, tiene al péptido Tat(49-57) que le permite a la molécula internalizarse al citoplasma y llegar hasta el núcleo celular y finalmente el sitio de quelación con el 99m Tc. Figura 9. Estructura de la molécula N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN. 97

114 4.2 Modelaje Molecular: Diseño de (Acm) 2 S 2 N 2 -Tat-Lys 3 -BN, Tc(O)S 2 N 2 - Tat-Lys 3 -BN por cálulos semiempíricos Un buen modelaje molecular genera estructuras que son similares a aquellas que se obtienen experimentalmente. Sin embargo, este parecido puede verse afectado por el tamaño, la carga y la movilidad de las moléculas, por ejemplo, péptidos grandes y cargados. Teniendo en cuenta estas características, el péptido híbrido N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN (figura 10) se diseñó con cálculos semiempíricos para estudiar la posibilidad de su formación. Las energías mínimas de la estructura y confórmero más estables fueron 271 y 233 kcal/mol, respectivamente. El complejo oxo-tc que se formó con el péptido híbrido se modeló considerando dos factores de este tipo de sitio quelante: a) Los dos tioles terminales S 2 (Acm) 2 se pueden ionizar si se remueve el acetamindometil de los grupos protectores [13, 14]. b) Los grupos amina pueden fácilmente disminuir la pérdida de protones [14]. Entonces se espera que el sitio de quelación forme un complejo coordinado - [N 2 S 2 ] 4 alrededor del núcleo de [Tc(O)] + 3, formando de esta manera un complejo con carga negativa cinco-coordinado. Con base en esto se calculó la molécula del complejo peptídico [TcO(N 2 S 2 )] -1 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN (figura 10) utilizando el confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido. La energía mínima de la estructura optimizada fue 300 kcal/mol y la del confórmero más estable igual a 262 kcal/mol. En la tabla 12 se dan algunos parámetros geométricos de este complejo. 98

115 Tabla 12. Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N 2 S 2 -Tat- Lys 3 -BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex. Compuesto Geometría Distancias de Radio del enlace enlace (Å) [ 99m Tc(O)-(N 2 S 2 )] -1 -Tat-Lys 3 -BN Pirámide cuadrada Tc-N1: R N = distorcionada Tc-N2: R S = Tc-S1: TcN2/TcO =1.04 Tc-S2: TcS1/TcO = 1.19 Tc=O:

116 Figura 10. (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N 2 S 2 - Tat(49-57)-Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Tc(O): [Tc(O)N 2 S 2 ]. 100

117 4.3 Evaluación de la pureza radioquímica de 99m Tc-N 2 S 2 -Tat(49-57)-Lys 3 -BN ( 99m Tc-Tat-BN) Los resultados de la pureza radioquímica de 99m Tc-Tat-BN obtenidos por ITLC, Sep-Pak y HPLC (figura 11) mostraron una pureza radioquímica promedio de 92 ± 2 % (n>30) y permaneció estable hasta las 24 h sin purificación posterior al radiomarcado (figura 12). La actividad específica promedio fue de 14 MBq/nmol. Figura 11. (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma- UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99m Tc-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado. 101

118 Figura 12. Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99m Tc-Tat-BN recién marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente). 4.4 Estabilidad en suero humano de 99m Tc-Tat-BN La pureza radioquímica del 99m Tc-Tat-BN después de la incubación en suero humano por 1 h fue > 90%, después de 3 y 24 h disminuyó a 82 % y 65 % respectivamente. La unión a proteínas fue 36.4 ± 2.7 a las 2 h sin trasquelación del 99m Tc a la cisteina (figura 13). 4.5 Desafío a la cisteina Después de incubar el radiofármaco con cisteina a 37 C con relaciones molares 5:1, 50:1 y 500:1 de cisteina:péptido, los análisis por ITLC mostraron que la radiactividad disociada de 99m Tc-Tat-BN, 7, 16 y 41% respectivamente indicando una estabilidad radiofarmacéutica adecuada. 102

119 Figura 13. HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 99m Tc-Tat-BN después de incubarlo en suero humano a 37 C durante 2 h. 4.6 Pruebas in vitro Captación in vitro de 99m Tc-Tat-BN Los resultados de la prueba in vitro mostraron captación en las tres líneas celulares, PC3, MCF7 y MDA-MB231, cuya especificidad se comprobó al inhibir la captación con la incubación previa con BN fría (tabla 13). En general la unión en las células bloqueadas fue menor al 3% del total de actividad para 99m Tc-BN y menor al 9% para el 99m Tc-Tat-BN en todos los tiempos. Esto comprueba la especificidad in vitro de ambos radiofármacos por los GRPr que se localizan en la membrana de las tres líneas celulares, debido a que ambos compuestos tienen BN. 103

120 Sin embargo, se observa una mayor captación del radiofármaco 99m Tc-Tat-BN, ya que es un híbrido que contiene BN, que se une específicamente a los GRPr de la membrana, pero además, aumenta la captación e internalización debido al péptido Tat que tiene la capacidad de internalizar la molécula al citoplasma celular e incluso llegar hasta el núcleo. Tabla 13. Captación celular de 99m Tc-Tat-BN y 99m Tc-BN en diferentes líneas de cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)). Tiempo PC3 MCF7 MDA-MB231 (h) Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Internalización celular de 99m Tc-Tat-BN El aumento en la internalización del radiofármaco 99m Tc-Tat-BN, comparado con el 99m Tc-BN, se muestra en las gráficas de internalización de las tres líneas celulares (figura 14). El máximo de internalización en las células PC3 (figura 14 (A)) y MCF7 (figura 14 (B)) se alcanza entre las 2 y 4 horas de incubación, pero en las células MDA-MB231 (figura 14 (C)) tiene un comportamiento distinto ya que disminuye la internalización celular al paso del tiempo y muestra un máximo de internalización en los primeros minutos de incubación. Estos resultados comprueban que éste péptido híbrido, tiene la capacidad de penetrar la membrana celular. 104

121 Figura 14. Internalización dependiente del tiempo de 99m Tc-Tat-BN y 99m Tc-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C). 105

122 4.6.3 Biodistribución subcelular de 99m Tc-Tat-BN Los porcentajes de actividad internalizada de 99m Tc-Tat-BN en cada compartimento subcelular a diferentes tiempos, se observan en la figura 15 para células PC3, MCF7 y MDA-MB231. La mayor captación del radiofármaco se produce en el núcleo de las tres líneas celulares, seguido por el citoplasma y finalmente la membrana. Estos resultados comprueban que además de la especificidad del radiofármaco (debido a la BN) hacia las células que sobre expresan el GRPr (PC3, MCF7 y MDA-MB231), las características que le da el péptido Tat al radiofármaco híbrido, evidencian la internalización del 99m Tc-Tat-BN al citoplasma. Asimismo, la NLS con la que cuenta el mismo péptido permite que la molécula se mueva hasta el núcleo a través de los poros perinucleares [12]. Algunas diferencias en la captación e internalización pueden deberse al origen clonal de las células, al número de pases que hayan tenido al momento de la realización del experimento, así como a la diferencia en el número de receptores que expresa cada línea celular. 106

123 Figura 15. Biocinética del 99m Tc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C). 107

124 4.6.4 Modelos biocinéticos subcelulares de 99m Tc-Tat-BN En la tablas 14, 15 y 16 se muestran los modelos biocinéticos del 99m Tc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente. Así como el número total de desintegraciones (N = Bq s) por cada Bq de 99m Tc captado en la célula, que ocurrieron en cada compartimento subcelular a tiempo infinito al integrar sobre el tiempo, cada modelo biocinético. Tabla 14. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer PC3. Región celular Membrana A( t) = 41.4e R 2 = t Modelo Biocinético A(t) [Bq] e 0.85t e t (N) Número total de desintegraciones [Bq s] 3229 Citoplasma A( t) = 45.5e R 2 = t e 0.137t e 0.295t 8766 Núcleo A( t) = 91.8e R 2 = t e 0.123t e 0.321t

125 Tabla 15. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer MCF7. Región celular Membrana A( t) = 63.8e R 2 = t Modelo Biocinético A(t) [Bq] e 0.075t e t (N) Número total de desintegraciones [Bq s] 5338 Citoplasma A( t) = 60e R 2 = t e t e 0.285t 6826 Núcleo A( t) = 103e R 2 = t e 0.103t e 0.327t Tabla 16. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99m Tc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231. Región celular Membrana A( t) = 19.8e R 2 = 1 Modelo Biocinético A(t) [Bq] 2.31t e t e 0.277t (N) Número total de desintegraciones [Bq s] 4810 Citoplasma A( t) = 1.82e R 2 = t e t e t Núcleo A( t) = 188e R 2 = t e 0.183t e t

126 Como se observa en las tablas anteriores la mayoría de los modelos biocinéticos muestran que el mayor número de desintegraciones del 99m Tc ocurren en el núcleo de las tres líneas celulares de cáncer. El mayor número de desintegraciones que ocurren en el citoplasma de las células MDA-MB231 con respecto a las del citoplasma de las células MCF7 (tablas 15 y 16) puede estar asociado con una mayor actividad lisosomal en las MDA-MB231, porque el proceso de internalización del complejo BN/GRPr involucra atrapamiento por parte de los lisosomas [15] Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de cáncer por inmunocitoquímica Las imágenes obtenidas por microscopía confocal de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 se observan en las figuras 16, 17 y 18. Estas imágenes demuestran que el Tat-BN se internalizó en el núcleo de las tres líneas celulares de cáncer utilizadas en este estudio. En las imágenes control (A) (sin Tat-BN), el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se internalizó al citoplasma, pero no al núcleo. Cuando las células fueron estimuladas con el péptido Tat-BN e incubadas con el anticuerpo primario Anti-Tat y el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, se observó la fluorescencia en el núcleo (B) demostrando la internalización nuclear del Tat-BN. 110

127 Figura 16. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. 111

128 Figura 17. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. 112

129 Figura 18. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas. 113

130 4.6.6 Efecto del 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular El efecto del 99m Tc-Tat-BN en la proliferación celular a diferentes concentraciones (5.4 o 8.1 MBq) se estudió en células de cáncer (figura 19). Como se muestra en la figura 19, el 99m Tc-Tat-BN (5.4 MBq) inhibió significativamente la proliferación de células MDA-MB231 (35.80 %), MCF7 (45.71 %) y PC3 (52.98 %) con respecto a las células no tratadas (p < 0.05). Sin embargo, en presencia de 1.3 y 2.0 µm de Tat-BN se observó incremento en la proliferación celular debido a la actividad mitogénica del Tat [16] y esta puede ser la razón por la cual aparentemente 8.1 MBq (2.0 µm de Tat) de 99m Tc no es más efectivo que 5.4 MBq (1.3 µm de Tat) para reducir la concentración de ADN. No obstante, se puede deducir que en el caso del radiofármaco 99m Tc- Tat-BN el efecto antiproliferativo del 99m Tc (por electrones CI y Auger) prevalece sobre el efecto mitogénico del Tat (figura 19). La actividad mitogénica del Tat puede explicar también la baja concentración de ADN que se obtiene con astemizol (inhibidor del proceso de proliferación celular) comparado con el del 99m Tc-Tat-BN en las células PC3 y MDA-MB231. Sin embargo, la proliferación en células MCF7 fue similar con 99m Tc-Tat-BN que con el tratamiento con astemizol. Estos datos se correlacionan bien con los resultados de la biocinética (Tablas 14, 15 y 16) del radiofármaco. 114

131 Figura 19. Efecto del Tat-BN y 99m Tc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN (ng/ml). 115

132 4.7 Pruebas in vivo Estudios de Biodistribución in vivo de 99m Tc-Tat-BN La biodistribución del 99m Tc-Tat-BN se muestra en la tabla 17. Se observa excreción renal predominantemente pero también se presenta eliminación hepatobiliar. Los pulmones presentaron captación del radiofármaco debido a que los GRPr están expresados de manera natural en dicho órgano [17]. Sin embargo, el páncreas mostró mayor captación que otros órganos no excretores como el bazo, músculo, e incluso pulmones debido a la presencia de los GRPr, indicando que la BN actúa como el sitio de reconocimiento biológico específico. Tabla 17. Biodistribución del 99m Tc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo). Órgano % AI/g (promedio ± DS) 0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h Sangre 7.81± ± ± ± ±0.02 Corazón 2.43± ± ± ± ±0.10 Pulmones 2.68± ± ± ± ±0.03 Hígado 4.91± ± ± ± ±0.17 Bazo 1.28± ± ± ± ±0.07 Páncreas 2.89± ± ± ± ±0.04 Riñones 16.87± ± ± ± ±0.81 Intestino 3.70± ± ± ± ±0.08 Músculo 1.47± ± ± ± ±0.02 Hueso 2.44± ± ± ± ±

133 4.7.2 Imágenes de ratónes atímicos con tumores inducidos PC3 La tabla 18 muestra la biodistribución en ratones atímicos con tumores inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Las razones tumor/sangre, tumor/músculo y páncreas/sangre para el 99m Tc-BN fueron de 4.4, 7 y 8.2 respectivamente y 3.2, 8 y 1.4 para el 99m Tc-Tat-BN respectivamente. Las imágenes in vivo muestran captación en el tumor. La disección completa de los órganos remarcó la captación del 99m Tc-Tat-BN (figura 20 (A)) y 99m Tc-BN (figura 20 (B)) en el tumor de células PC3. La razón tumor/músculo obtenida a partir de las cuentas por pixel de la imagen correspondientes a 99m Tc-BN fue de 7 y de 8.5 para 99m Tc-Tat-BN, demostrando que diferencia entre los dos radiofármacos utilizados no es estadísticamente significativa. Tabla 18. Biodistribución de 99m Tc-BN y 99m Tc-Tat-BN en ratones atímicos con tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos (n=3). Órgano % AI/g (Promedio ± DS) 99m Tc-BN 99m Tc-Tat-BN Sangre 0.40± ±0.16 Corazón 0.25± ±0.08 Pulmón 0.50± ±0.07 Hígado 0.85± ±0.05 Bazo 0.40± ±0.04 Páncreas 3.29± ±0.12 Riñones 23.5± ±2.18 Intestino 0.85± ±0.23 Músculo 0.25± ±0.05 Tumor 1.75± ±

134 Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina Figura 20. Captación de (A) 99m Tc-Tat-BN y (B) 99m Tc-BN en tumores inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos (la disección de los órganos remarcó la captación en los tumores). 118