11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12P 19/ Inventor/es: Hasler, Thomas y Fürer, Emil. 74 Agente: Isern Jara, Jorge

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12P 19/04 A61K 39/02 A61K 39/38 A61K 47/36 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Procedimiento nuevo para el aislamiento de polisacáridos. Prioridad: EP Titular/es: Berna Biotech AG. Rehhagstrasse Bern, CH 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Hasler, Thomas y Fürer, Emil 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Isern Jara, Jorge ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Procedimiento nuevo para el aislamiento de polisacáridos La presente invención hace referencia a un procedimiento para el aislamiento de polisacáridos, en especial para la separación de endotoxinas de los polisacáridos en cápsula de bacterias gram-negativas. La descripción de la invención explica que los polisacáridos aislados según el método conforme a la invención pueden emplearse preferiblemente para la fabricación de vacunas de polisacáridos. La descripción de la invención aclara además que vacunas contienen polisacáridos aislados con el método conforme a la invención. Para la fabricación de vacunas, en particular de vacunas de polisacáridos a base de polisacáridos bacterianos, la separación de las endotoxinas es un paso crítico y decisivo en el proceso de limpieza de los polisacáridos. El método empleado más frecuentemente en la actualidad para la separación de las endotoxinas de los polisacáridos bacterianos se basa en una extracción en fenol, que debe repetirse si fuera preciso varias veces, hasta que el contenido en endotoxinas corresponda a los requisitos establecidos por las autoridades sanitarias. Este método es costoso y requiere tiempo. Además, es desagradable trabajar con fenol y produce un residuo tóxico inesperado. El rendimiento en polisacáridos que se obtiene con este método tan conocido en la actualidad es frecuentemente poco satisfactorio. Otros procedimientos de la tecnología actual para el aislamiento de polisacáridos bacterianos se basan en el uso de columnas de afinidad. Estas son frecuentemente peligrosas para la salud (por ejemplo, el uso de material de la columna que contiene polimixina B). Además, muchos materiales de la columna tienen solamente capacidades limitadas; lo que para la obtención de rendimientos en polisacáridos evaluables técnicamente requiere unas columnas relativamente grandes y por tanto caras (compárese por ejemplo, US-A.04.46, US-A y US-A ). Además, en la actualidad se conocen métodos para el aislamiento de polisacáridos bacterianos, que engloban etapas parciales complejas. La comunicación de la patente europea EP-A (Rienstra y cols.) describe un procedimiento complejo, donde una fracción de polisacáridos, que se obtiene mediante el cultivo correspondiente de las bacterias gram-negativas y el posterior tratamiento del cultivo, se somete inicialmente a una costosa extracción en fenol. Las sustancias de elevado peso molecular precipitan con alcohol y cloruro cálcico, a la solución se añade más cloruro cálcico y se separa la endotoxina mediante el fraccionamiento selectivo en alcohol y la posterior adición de un material soporte, un detergente y un formador de un quelato del polisacárido. El material soporte se separa de la solución, el filtrado se libera del detergente del formador del quelato a través de la membrana de fibra hueca, el residuo es sustituido por cloruro cálcico y el polisacárido precipita definitivamente con alcohol de la solución. La EP-A expone ciertamente la separación de los lipopolisacáridos mediante el fraccionamiento selectivo en alcohol, en general solamente en combinación con la extracción a través de un material soporte. La EP-A describe por tanto un método, en el cual la fracción de polisacáridos bacteriana es sometida a otras etapas del proceso esenciales, que facilitan la limpieza de los polisacáridos. Además, el método de la EP-A únicamente puede llevarse a cabo mediante el uso de unas etapas de extracción con disolventes tóxicos. La invención tenía por tanto el cometido de preparar un método simple, significativo desde el punto de vista económico y de escaso riesgo para la salud para el aislamiento de polisacáridos. La solución de este cometido se consigue mediante las formas de ejecución que se caracterizan en las reivindicaciones. La invención se refiere por tanto a un método para el aislamiento de polisacáridos, donde se llevan a cabo los pasos siguientes: (a) Mezcla de una fracción bacteriana de polisacáridos con una solución de detergente; (b) Adición de alcohol hasta una concentración final, que es inferior a la concentración a la que precipita el polisacárido; (c) Mezcla de la solución; (d) Filtrado de la solución; 6 (e) Separación del polisacárido del detergente y del alcohol. Las fracciones de polisacáridos bacterianas, que pueden emplearse en el método conforme a la invención se fabrican según el método que se conoce en la tecnología actual; compárese, por ejemplo, Gotschlich y cols., J. Exp. Med. 129(1969), así como Schneerson y cols., J. Exp. Med. 12 (1980) La concentración en alcohol, a la que precipita el polisacárido en presencia de la solución de detergente puede ser determinada por el técnico de un modo convencional. Por ejemplo, esta concentración puede averiguarse mediante simples tiras de ensayo. La reacción de la solución, es decir, la precipitación de la endotoxina de la solución de polisacáridos se realiza habitualmente durante 1 minuto hasta 1 hora, pero puede durar varias horas. El método conforme a la invención es simple, rápido, barato y deja un residuo tóxico muy inferior si se compara con el método de la técnica actual. Además, los rendimientos en polisacáridos son claramente superiores. El método conforme a la invención se basa en una precipitación selectiva en alcohol en presencia de cómo mínimo un detergente, que neutraliza o anula las interacciones covalentes entre polisacáridos, lipopolisacáridos y proteínas. 2

3 En una forma de ejecución preferida del método conforme a la invención el alcohol que se añade es el etanol En otra forma preferida de ejecución, el método conforme a la invención lleva a cabo la separación del polisacárido del detergente y del alcohol, mediante la precipitación del polisacárido al añadir más alcohol. Esta forma de ejecución del método es especialmente preferida ya que la precipitación del polisacárido y por tanto la separación de los detergentes y del alcohol puede realizarse mediante otra adición simple de alcohol. En otra forma de ejecución puede conseguirse la precipitación del polisacárido incluso mediante la adición de un alcohol, que se distinga del empleado en la etapa (b). Otra forma de ejecución preferida de la invención corresponde a un método, donde los polisacáridos proceden de bacterias gram-negativas. En otra forma de ejecución especialmente preferida, las bacterias gram-negativas son las bacterias de la especie Haemophilus, Neisseria, Klebsiella o Escherichia y en particular del tipo Haemophilus influenzae (tipo b), Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae o Escherichia coli. Los polisacáridos que aquí son objeto de discusión son los polisacáridos en cápsula. El aislamiento de polisacáridos de las bacterias de estas especies o tipos es por tanto especialmente preferida ya que estos polisacáridos son apropiados para la vacunación contra las siguientes enfermedades: Meningitis, epiglotitis, otitis media, neumonía, artritis, sepsis, infecciones nosocomiales, infecciones de las vías urinarias y gastroenteritis. En otra forma de ejecución preferida del método conforme a la invención el detergente es un tensoactivo aniónico. Se prefiere especialmente un método, donde el tensoactivo aniónico sea un sulfato de alquilo, por ejemplo, el dodecilsulfato sódico (SDS). La ventaja del empleo del SDS en el método conforme a la invención reside, entre otras cosas, en que el SDS puede obtenerse de una multitud de fabricantes y además tiene un precio de compra favorable. En otra forma de ejecución especialmente preferida del método conforme a la invención, la concentración de tensoactivo en la solución añadida a la fracción de polisacárido en la etapa (a) anteriormente mencionada es como máximo del % (peso /peso). Como ya se ha mencionado, el tensoactivo es preferiblemente un sulfato de alquilo y por ejemplo el SDS. Se prefiere especialmente según la invención un método, donde la concentración de tensoactivo en la solución de polisacáridos, por ejemplo, la concentración de SDS, sea del 0,1% hasta del 4% (concentración final, peso /peso). En otra forma de ejecución preferida del método conforme a la invención se añade alcohol a la solución en la etapa (b) hasta una concentración final, que equivale a un % inferior a la concentración a la que precipita el polisacárido. Mediante una serie de pruebas empíricas se ha constatado que la adición de alcohol en la etapa (b) a esta concentración final es especialmente preferida, porque la pérdida en polisacárido a esta concentración es escasa y sin embargo la endotoxina precipita. En otra forma de ejecución preferida del método conforme a la invención, la concentración de salida de los polisacáridos en la fracción de polisacárido es mayor a mg/ml. Mientras que el método conforme a la invención puede llevarse a cabo incluso con concentraciones bajas de salida en polisacáridos en la fracción del polisacárido, la concentración anteriormente mencionada debería emplearse en el método conforme a la invención como la concentración mínima, en particular desde un punto de vista económico. Otra forma de ejecución preferida de la invención equivale a un método, donde la filtración se realiza a través de un filtro de polímeros. En otra forma de ejecución preferida del método conforme a la invención se emplea para la filtración un filtro de profundidad. El término filtro de profundidad equivale, en relación con la presente invención, a un filtro, que en contraposición a un filtro de membrana (bidimensional) posee una estructura (profundidad) tridimensional. Esta estructura tiene como consecuencia que un filtro de profundidad posea una capacidad de retención de partículas elevada y por consiguiente no se atasque tan rápidamente. Se ha garantizado pues el empleo de filtros poliméricos o de profundidad. Se ha de tener en cuenta que un filtro polimérico puede ser también un filtro de profundidad y a la inversa un filtro de profundidad puede ser un filtro polimérico, no obstante esta condición no es obligatoria. El aislamiento de polisacáridos según el método conforme a la invención resulta ser especialmente eficaz cuando se emplean filtros de profundidad para la filtración. 3

4 En otra forma de ejecución especialmente preferida del método conforme a la invención, el filtro polimérico y /o el filtro de profundidad es un filtro de polipropileno. 1 2 La descripción de la invención informa además sobre una vacuna de polisacárido que se caracteriza por que contiene un polisacárido, que se aísla según el procedimiento conforme a la invención. Esta vacuna de polisacárido contiene también un soporte tolerable desde el punto de vista farmacéutico. Ejemplos de este tipo de soportes son el toxoide tetánico, el toxoide diftérico, las pseudomonas exotoxina A y coleratoxina. La vacuna de polisacárido puede obtenerse tal como se ha descrito y se fabrica de forma fácil y simple. Su fabricación es inofensiva para el personal del laboratorio desde el punto de vista sanitario. Un ejemplo de la vacuna es una vacuna basada en polisacárido de meningococos. Estos ejemplos de vacunas así como los mencionados a continuación se administran por vía parenteral, donde la administración se realiza una hasta varias veces y preferiblemente (si no se indica lo contrario) varias veces. Generalmente, la administración tiene lugar por vía intramuscular o subcutánea, donde por dosis pueden emplearse de 1 a 0 µg de polisacárido. La vacuna de polisacárido es especialmente apropiada para la vacunación contra la meningitis, epiglotitis, otitis media, neumonía, artritis, sepsis, infecciones nosocomiales, infecciones de las vías urinarias o gastroenteritis. Además, la vacuna de polisacárido puede emplearse para la vacunación contra otras enfermedades, provocadas por bacterias gram-negativas que llevan polisacáridos en cápsula. Además, la descripción de la invención informa sobre un conjugado que consta de un polisacárido aislado según un método conforme a la invención y una proteína unida al mismo, tolerable desde el punto de vista farmacéutico. Ejemplos de este tipo de proteínas son el toxoide tetánico, toxoide diftérico, las pseudomonas exotoxina A y coleratoxina. Se registran dosis de 1- µg por conjugado. Además, la descripción de la invención informa sobre una vacuna de conjugado, que contiene un polisacárido aislado según un método conforme a la invención y una proteína tolerable desde el punto de vista farmacéutico unida al mismo por reacción química. La vacuna de conjugado se emplea preferiblemente para la inmunización o profilaxis contra las enfermedades anteriormente mencionadas. Se garantiza especialmente que la inmunización se lleve a cabo en los niños pequeños Además, la descripción de la invención informa sobre una vacuna de combinación, que contiene un polisacárido aislado según el método conforme a la invención o bien un conjugado, así como otro componente inmunógeno, donde el componente inmunógeno adicional induce preferiblemente una respuesta inmunológica contra un patógeno, que es otro patógeno distinto del que procede el polisacárido. Ejemplo, para una vacuna de combinación es una vacuna de Haemophilus influenzae, en la cual el polisacárido correspondiente se conjuga con el toxoide tetánico. Adicionalmente, pueden formularse en esta vacuna, por ejemplo, componentes de pertussis, difteria, tétanos y hepatitis B. Las dosis equivalen a 1- µg de polisacárido en una vacuna de combinación, en particular 1- µg, por ejemplo, en la vacuna de combinación de Haemophilus influenzae anteriormente descrita un polisacárido de haemophilis influenzae. Las dosis para los componentes de la difteria son en esta vacuna de 1-2 Lf (Límite de floculación), para los componentes del tétanos de - Lf y para los componentes de pertussis superiores a 4 IE (unidades internacionales). El especialista puede determinar dosis/concentraciones de otros componentes en una vacuna de combinación según un método estándar/prescripciones estándar. La vacuna de combinación se administra únicamente una vez. La descripción informa de que los demás componentes inmunógenos son antígenos de difteria, tétanos, pertussis, hepatitis B o poliomielitis. Seguidamente la descripción de la invención explica el empleo de un polisacárido, que se ha aislado según el método conforme a la invención, como producto intermedio para la fabricación de una vacuna de conjugado o de combinación. El producto intermedio se une a una proteína, tolerable desde el punto de vista farmacéutico, según una reacción química para dar el conjugado. De acuerdo con ello, la descripción de la invención informa de una aplicación en la que la vacuna del conjugado o de la combinación contiene un conjugado como componente activo, que consta de un polisacárido aislado según un método conforme a la invención y una proteína tolerable farmacéuticamente unida al mismo por reacción química. Los ejemplos aclaran la invención. Ejemplo 1 Aislamiento de un polisacárido en cápsula de una Haemophilus influenzae tipo b 6 Una fracción de polisacárido en cápsula tratada según un procedimiento convencional (PRP, fosfato de poliribosilribitol) de Haemophilus influenzae tipo b se mezcla en una concentración > mg/ml con una solución de SDS al 4%. Luego se añade etanol hasta una concentración final, que se sitúa un % por debajo de la concentración a la que empieza a precipitar el polisacárido. La solución se mezcla durante unos minutos, donde los periodos de tiempo de 4

5 1 minuto hasta de varias horas parecen adecuados, para ajustar una ligera turbulencia. Seguidamente, se filtra a través de un filtro de profundidad de polipropileno. Las endotoxinas se separan mediante esta etapa de filtración y se quedan en el filtro. Probablemente son responsables tanto de los efectos de filtración como de adsorción para la separación de las endotoxinas. El polisacárido filtrado precipita seguidamente al añadir de nuevo etanol, quedando el SDS en solución. El polisacárido precipitado puede separarse de las impurezas de SDS restantes mediante otras adiciones de etanol. Otro tratamiento del polisacárido así como su confección como vacuna, donde el polisacárido se unirá a una proteína soporte adecuada preferiblemente mediante una reacción química, se lleva a cabo mediante un procedimiento convencional conocido en la tecnología actual. En la forma de ejecución preferida mencionada, el polisacárido es también un producto intermedio para una vacuna de conjugado. Ejemplo 2 Aislamiento de los polisacáridos de cápsula de la Neisseria meningitidis tipo (A) y (C) 1 2 Los polisacáridos de cápsula de la Neisseria meningitidis tipo (A) y (C) se sometían a las mismas etapas del proceso que las descritas en el ejemplo 1. Los rendimientos en los polisacáridos obtenidos con el método descrito en los ejemplos 1 y 2 se representan en las tablas I y II. Se demuestra que el rendimiento en el polisacárido de cápsula de la Haemophilus influenzae tipo (b), que se obtiene con el método conforme a la invención, es básicamente superior al del polisacárido que puede obtenerse con el método conocido en la tecnología actual (extracción en fenol). TABLA I Aislamiento del polisacárido en cápsula de la H. Influenza tipo b (PRP) En los números de lote se trata de números internos del solicitante, CH-suero. Los lotes se han preparado conforme a un método convencional TABLA II Aislamiento del polisacárido en cápsula de la N. meningiditis grupo C (GCMP) 0 6

6 REIVINDICACIONES 1. Método para el aislamiento de polisacáridos, donde se llevan a cabo los pasos siguientes: a) Mezcla de una fracción bacteriana de polisacárido con una solución de detergente; b) Adición de alcohol hasta una concentración final, que es inferior a la concentración a la que precipita el polisacárido; c) Mezcla de la solución; d) Filtrado de la solución a través de un filtro de profundidad; 1 e) Separación del polisacárido del detergente y del alcohol. 2. Método conforme a la reivindicación 1, donde el alcohol es el etanol. 3. Método conforme a la reivindicación 1 ó 2, donde la separación del polisacárido se realiza mediante la precipitación del polisacárido añadiendo de nuevo alcohol. 4. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 3, donde los polisacáridos proceden de bacterias gramnegativas Método conforme a la reivindicación 4, donde las bacterias gram-negativas son bacterias de la especie Haemophilus, Neisseria, Klebsiella ó Escherichia y en particular del tipo Haemophilus influenzae (tipo b), Klebsiella pneumoniae, Neisseria meningitidis o Escherichia coli. 6. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta, donde el detergente es un tensoactivo aniónico. 7. Método conforme a la reivindicación 6, donde el tensoactivo aniónico es un sulfato de alquilo, por ejemplo, el dodecilsulfato sódico (SDS). 8. Método conforme a la reivindicación 6 ó 7, donde la concentración de tensoactivo en solución que se añade a la fracción de polisacárido en la etapa (a) es como máximo del % (peso/peso). 9. Método conforme a la reivindicación 8, donde la concentración de tensoactivo en la solución de polisacárido oscila entre el 0,1% y el 4% (concentración final, peso/peso). 4. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 9, donde el alcohol se añade a la solución en la etapa (b) hasta una concentración final, que es aproximadamente un % inferior a la concentración a la que precipita el polisacárido. 11. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta, donde la concentración de salida de los polisacáridos en la fracción de polisacárido es mayor a mg/ml. 12. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11, donde la filtración se realiza a través de un filtro polimérico Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 12, donde el filtro polimérico y/o el filtro de profundidad es un filtro de polipropileno. 6 6