Degradación de pared celular en frutillas. Análisis de sus componentes, evolución de la actividad enzimática y expresión de genes asociados

Transcripción

1 Universidd Ncionl de Generl Sn Mrtín Tesis pr optr por el Título de Doctor en Biologí Moleculr y Biotecnologí de l Universidd Ncionl de Generl Sn Mrtín Degrdción de pred celulr en frutills. Análisis de sus componentes, evolución de l ctividd enzimátic y expresión de genes socidos Hernán Guillermo Rosli Director: Dr. Gustvo Adolfo Mrtínez Co-director: Dr. Pedro Mrcos Civello IIB-INTECH (Chscomús) Diciemre de 2007

2 ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN Histori Generliddes Mdurción de frutos Actividd respirtori Pigmentos Azúcres y ácidos simples Compuestos volátiles Regulción de l mdurción Pred celulr Componentes de l pred celulr Celulos Hemiceluloss Pectins Proteíns estructurles Disposición espcil de los componentes de l pred celulr Intercciones entre los distintos componentes de l pred celulr Cmios en l pred celulr durnte l mdurción Depolimerizción de poliurónidos Pérdid de glctnos y rinnos Demetilción de pectins Soluilizción de pectins Depolimerizción de hemiceluloss Depolimerizción de celulos Síntesis de componentes de pred Proteíns de modificción de l pred celulr Poliglcturonss Pectin metilesterss Pectto liss Xiloglucno endotrnsglicosilss Expnsins Endo-1,4-β-D-glucnss β-d-glctosidss... 29

3 ÍNDICE 6.8. α-l-rinofurnosidss Endo-β-1,4-D-xilnss o 1,4-β-xilno endohidrolss β-d-xilosidss Otrs enzims II. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS...33 III. MATERIALES Y MÉTODOS Mteril vegetl Medid de l firmez Aislmiento de poliscáridos de l pred celulr Extrcción y cuntificción de pectins Extrcción y cuntificción de hemiceluloss y celulos Cromtogrfí de exclusión moleculr Pectins Hemiceluloss Preprción de extrctos y medid de ctividd de enzims de modificción de pred celulr Pectin metilesters (PME) Poliglcturons (PG) Endo-β-1,4-glucns (EGs) Xilns (Xns) β-xilosids (β-xil) β-glctosids (β-gl) α-l-rinofurnosids (α-l-r) Cromtogrfí de exclusión moleculr de proteíns con ctividd α-l-r Clondo del ADNc de α-l-rinofurnosids Aislmiento de ARN totl y nálisis de expresión de α-l-r medinte Northern-lot RT-PCR semicuntittiv Análisis de secuencis y filogeni Análisis estdístico... 47

4 ÍNDICE IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48 SECCIÓN A. COMPONENTES DE LA PARED CELULAR Firmez de los frutos Residuo insolule en lcohol (RIA) Pectins Pectins totles Pectins solules en gu (PSA) Pectins solules en EDTA (PSE) Pectins solules en HCl (PSH) Hemiceluloss Celulos Ms moleculr de frcciones de l pred celulr Ms moleculr de pectins Ms moleculr de hemiceluloss Discusión SECCIÓN B. ENZIMAS DE DEGRADACIÓN DE LA PARED CELULAR Pectin metilesters Poliglcturons Endoglucns Xilns β-d-xilosids β-glctosids α-l-rinofurnosids Discusión SECCIÓN C. α-l-arabinofuranosidasa: GENES Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Ms moleculr de proteíns con ctividd α-l-r Clondo de un frgmento de α-l-r Expresión de FArs en diferentes tejidos y estdios Actividd α-l-r Clondo y nálisis de l secuenci de FArs Análisis de expresión por RT-PCR Discusión... 96

5 ÍNDICE V. CONSIDERACIONES FINALES 99 VI. BIBLIOGRAFÍA VII. PUBLICACIONES..118

6 INTRODUCCIÓN

7 INTRODUCCIÓN 1. Histori Uno de los primeros registros que se tienen respecto del cultivo de frutills dt del 1300 cundo en Frnci se hicieron los primeros trnsplntes de los osques los jrdines. Se trt de l frutill silvestre denomind Frgri vesc. L plnt er precid fundmentlmente como ornmentl, deido que poseí flores trctivs, más que por l utilizción de su fruto con fines gstronómicos. Un de ls más ntigus ilustrciones otánics dt del 1485, y fue pulicd en Minz Herrius por un empledo de Gutenerg. Hci el 1500 ls referencis de su cultivo fueron más frecuentes y se le triuín l plnt propieddes medicinles. Asimismo, se descriín otrs vrieddes grupds dentro de ls frutills silvestres: Frgri moscht y Frgri viridis. Un crcterístic distintiv de ls frutills europes de es époc er que poseín frutos de tmño pequeño. Alrededor del 1600 se introdujo en Europ l especie Frgri virginin proveniente del este de los Estdos Unidos, que serí precursor de l ctul frutill comercil. Aunque dich especie cont con un myor tmño que ls cultivds en Europ hst entonces, Frgri vesc continuó siendo l más cultivd durnte muchos ños. A principios del 1700, el ingeniero Amédée Frnçois Frézier, perteneciente un expedición en nomre del rey Luis XIV de Frnci trnsportó, entre otrs coss, especímenes de frutill cultivdos por los indígens de l zon (Mpuche y Huilliche). Est especie, denomind Frgri chiloensis, crece en l cost centro y sur de Chile y se intern en l Cordiller de los Andes. Tmién se l puede hllr en el este de l Argentin, en ls provincis de Neuquén, Chuut y Río Negro. F. chiloensis posee un fruto de myor tmño que el de l frutill europe, hecho que despertó el interés de los otánicos de l époc. Sólo cinco plnts de F. chiloensis rriron Frnci, tods ests femenins, por lo que sólo eventulmente se otuvieron frutos en los jrdines otánicos. Duchesne en 1766, pudo resolver el prolem, poniendo en contcto ests plnts femenins de F. chiloensis con otros individuos hermfrodits de F. virginin. Hciendo cruzs entre F. virginin y F. chiloensis, Duchesne generó el hírido Frgri x nnss, que trvés de sucesivos ensyos drí origen l ctul frutill comercil. Por l roustez de l plnt, sí como por ls soreslientes crcterístics de los frutos, este hírido no trdó en imponerse por sore ls otrs especies. Si ien ls primers vrieddes de F. x nnss se originron en Frnci, entre fines del 1700 y 1800 se generron vrieddes en Inglterr que fueron posteriormente doptds en el resto de Europ y Améric. Este trjo relizdo en Inglterr es l se de ls cientos de vrieddes que disfrutmos ctulmente (Drrow, 1999). 2

8 INTRODUCCIÓN 2. Generliddes L frutill pertenece l Fmili Rosáses, Sufmili Rosoides y género Frgri. Dentro de este género se hn descrito más de 150 especies, ls cules se encuentrn mplimente distriuids en el mundo. Cd especie posee frutos con tmño, color, firmez, rom y form crcterísticos. A su vez, ests especies difieren en l ploidí. Tnto F. vesc como F. viridis son diploides, F. moscht es hexploide, mientrs que F. chiloensis y F. virginin son octploides. El tllo en un plnt de frutill, l que se denomin coron, es de tmño reducido. De éste se genern tnto ls hojs, como ls inflorescencis y los estolones. Estos últimos son rotes delgdos, lrgos y rstreros que se desrrolln en grn número, dependiendo de ls condiciones mientles. El extremo de cd estolón, en el que se hll un roset de hojs, emite ríces l entrr en contcto con l tierr, con lo que se origin un nuev plnt de crcteres idénticos los de l plnt mdre. Si ien l plnt de frutill puede permnecer vile y fructificr durnte vrios ños, deido que con ls sucesivs tempords se oserv un merm en l producción, en cultivos con fines económicos se emplen plnts de hst dos ños de edd. Desde el punto de vist otánico, un fruto verddero se define como el órgno que result de l trnsformción del tejido ovárico de un flor, que contiene en su interior l semill proveniente del desrrollo del óvulo. En este sentido, l frutill (Frgri x nnss, Duch.) se consider un flso fruto por provenir del desrrollo del receptáculo y no de ls predes del ovrio. En rigor los frutos verdderos son los quenios, los cules se encuentrn en l superficie del receptáculo y están ligdos l mismo trvés de conexiones vsculres. Un fruto medino puede contener entre 150 y 200 quenios, pudiendo llegr poseer hst 400, en cso de un fruto de grn tmño. L frutill pertenece un grupo denomindo frutos lndos o erries, junto con frmuess, grosells, mors, rándnos, etc. (Green, 1971). Este grupo está integrdo por frutos de distints especies que comprten crcterístics comunes, tles como pequeño tmño, textur delicd, colorción intens y un vid útil postcosech cotd. Los frutos frescos son muy precidos por los consumidores, sin emrgo su rápido deterioro postcosech determin que un prte importnte de l producción se destind l procesmiento pr l otención de jles, yogures, slss, etc. Los frutos lndos de myor importnci económic nivel mundil son ls frutills, junto con ls frmuess, los rándnos y grosells. Sin emrgo, l producción mundil de frutill super mplimente l producción del resto de los erries tomdos en conjunto (Fig. 1). Al nlizr l producción 3

9 INTRODUCCIÓN mundil en l últim décd, se puede precir que l de frutill umentó un 47%, mientrs que l de los otros erries en conjunto umentó en menor proporción (35%). Producción mundil (miles de Ton) Frutill Otros frutos lndos Año Figur 1: Producción mundil de frutills, y de otros frutos lndos en conjunto en los últimos 10 ños (dptdo de FAOSTAT, 2007). Se muestr l producción mundil (expresd en miles de Ton) de frutill y otros frutos lndos, que incluyen frmues, rándnos, grosells y otros erries de menor importnci comercil. Cundo se nlizn los niveles de producción de frutills en Ltinoméric durnte los últimos ños, se puede precir que l producción en conjunto si ien umentó, se mntuvo entre un 6 y 7% de los niveles mundiles (Tl I). El myor productor de Ltinoméric es Méjico y lo siguen Chile, Colomi y Perú. Por su prte, Argentin se encuentr con niveles de producción medios dentro de este grupo de píses y con un tendenci de leve umento ño trs ño. Los frutos de tipo crnoso, como l frutill, poseen un conjunto de propieddes y crcterístics que hcen que los mismos sen trctivos pr el consumo por prte del homre. Ests crcterístics son dquirids por el fruto durnte el proceso de mdurción, durnte el cul se producen notles cmios fisiológicos y ioquímicos. En ls siguientes secciones se discutirán en detlle los distintos eventos que ocurren durnte l mdurción de frutos crnosos. 4

10 INTRODUCCIÓN Tl I: Producción de frutills (en Ton) de los principles píses productores de Ltinoméric durnte los últimos ños (Adptdo de FAOSTAT, 2007). Se muestr demás, l producción totl en Ltinoméric (L.A.) y l producción mundil. Pís Argentin Bolivi Brsil Chile Colomi Guteml Méjico Prguy Perú Venezuel Totl L.A Totl mundil Mdurción de frutos Un vez que se hn producido l polinizción y fertilizción de l flor, comienz un etp denomind desrrollo, crcterizd por un crecimiento y lrgmiento del fruto, l cul es seguid por un fse de mdurción. En frutill, hst psd un semn desde l cíd de los pétlos, el incremento en el tmño del fruto se dee principlmente un umento rupto en l cntidd de céluls. A continución y hst el finl de l mdurción, el número de céluls se mntiene reltivmente constnte, pero se oserv un umento en el tmño de ls misms (Knee y col., 1977). El fruto de frutill crece rápidmente, lcnzndo su tmño máximo y mdurción complet lrededor de 30 dís luego de l cíd de los pétlos, dependiendo de ls condiciones mientles (luz, tempertur, contenido de nutrientes, etc.). En generl, el umento del tmño de un fruto en función del tiempo puede doptr l form de un: ) curv sigmoide simple como en mnzn, plt, melón y nrnj; ) curv sigmoide dole como es el cso de dmscos, higos, uvs y ciruels. En frutills, l tendenci del umento del tmño depende del cultivr nlizdo, siendo en lgunos csos simple y en otros dole sigmoide (Mnning, 1993). 5

11 INTRODUCCIÓN Como se mencionó, un vez completdo el desrrollo, se inici el proceso de mdurción. Ést se define como el conjunto de cmios fisicoquímicos, crcterísticos de cd fruto, que ocurre desde l finlizción de l etp de desrrollo hst el inicio de l senescenci. Los cmios que se oservn incluyen: modificción de los prámetros socidos l ctividd respirtori, cmio de color por degrdción de pigmentos existentes y síntesis de nuevos pigmentos, cmios en l textur que determinn el lndmiento del fruto, y l producción de sor y rom distintivos que fectn l pltilidd del producto (Mnning, 1993). En frutos como el tomte, l delimitción entre ls etps del desrrollo y l mdurción está determind por el cese del crecimiento en tmño del fruto (estdio verde mduro). En frutill, en cmio, existe un superposición entre el desrrollo y l mdurción deido que el crecimiento del fruto continú ún cundo l degrdción de clorofils está muy vnzd y l síntesis de ntocinins y h comenzdo. Deido este solpmiento entre el desrrollo y l mdurción en frutill, es hitul l inclusión de estdios finles del desrrollo en el estudio glol de l mdurción. Un crcterístic importnte de l plnt de frutill es que en el período de fructificción coexisten en un mism plnt frutos con distinto grdo de mdurción. Es decir que en un cultivo se pueden hllr simultánemente frutos en diversos estdios de mdurción. Bsándose en el tmño y color superficil, los frutos pueden ser clsificdos en: verdes (pequeños o grndes), lncos y, de cuerdo l porcentje de rojo superficil, en 25, 50, 75 y 100% rojo (Fig. 2). Vp Vg B 25%R 50%R 75%R 100%R Figur 2: Clsificción en distintos estdios de mdurez, de cuerdo con el tmño y color superficil de los frutos. Vp, verde pequeño; Vg, verde grnde; B, lnco; 25%R 100%R, % rojo superficil, respectivmente Actividd respirtori Los frutos son definidos fisiológicmente en se l presenci (climtéricos) o usenci (no climtéricos) de un umento en l respirción y en l síntesis de l hormon gseos etileno l comienzo de l mdurción (Lelievre y col., 1997). Dentro de los frutos climtéricos se destcn el tomte, l mnzn y l nn, entre otros. L frutill, l uv y 6

12 INTRODUCCIÓN los cítricos son cpces de mdurr en usenci de un umento en l producción de etileno, por lo que se grupn dentro de los frutos no climtéricos. Los principles sustrtos respirtorios durnte l mdurción son zúcres y ácidos orgánicos, siendo los primeros los predominntes. Amos sustrtos se encuentrn secuestrdos dentro de l vcuol, y contriuyen significtivmente l sor que se percie del fruto como un todo. En frutill y frmues, los zúcres más undntes son scros, glucos y fructos, y componen el 99% del totl de los zúcres en el fruto mduro. El ácido orgánico más undnte en frutill es el cítrico (Fmini y col., 2005), unque el ácido málico es el que está myormente involucrdo en l respirción (Tucker, 1993). L frutill h sido considerd clásicmente como un exponente de fruto no climtérico, ddo que l respirción decrece pultinmente lo lrgo de l mdurción, sin presentr un pico en l ctividd respirtori (Leshem, 1986; Aeles y Tked, 1990). Sin emrgo, trjos más recientes ponen en dud l pertenenci de l frutill l grupo de los frutos no climtéricos (Trinotti, 2005; Innett y col., 2006). En l sección 4 se descrie más detlldmente el potencil rol del etileno en l mdurción de frutill Pigmentos El cmio de colorción es uno de los rsgos más crcterísticos de l mdurción de los frutos. El mismo puede estr ocsiondo por l degrdción de clorofils y un consecuente mnifestción del color de otros pigmentos que se hlln en el fruto pero que estn enmscrdos (fundmentlmente β-crotenos). Sin emrgo, en l myorí de los frutos l degrdción de clorofils v compñd de un incremento en l concentrción de otros pigmentos, en generl ntocinins o crotenoides. Los crotenoides, loclizdos en cloroplstos o cromoplstos, son los responsles de colores rojos, nrnjs y mrillos de grn prte de los frutos. Son compuestos terpenoides liposolules, entre los que se destcn el β-croteno y el licopeno. Pueden formr prte del sistem fotosintético y ser desenmscrdos l degrdrse ls clorofils, como es el cso de nns y pers. Alterntivmente puede existir un importnte síntesis de novo durnte l trnsformción del cloroplsto en cromoplsto, como ocurre en durzno, tomte y pimiento. Ls ntocinins son compuestos flvonoides responsles del color crcterístico de los frutos lndos, mnzns, cerezs y ciruels. Pueden conferir colores que vn del rojo l zul, el cul su vez está determindo por el ph del medio y por l presenci de metles con los que tienen l cpcidd de formr complejos. A diferenci de los crotenoides, son hidrosolules, se loclizn en l vcuol (Timerlke, 1981) e incluyen un grupo de 7

13 INTRODUCCIÓN moléculs más diverso. En frutill se hn detectdo l menos 25 ntocinins distints (d Silv y col., 2007), unque l más undnte es pelrgonidin-3-glucósido (Vn Buren, 1970). Ls ntocinins son sintetizds trvés de l rut de los fenilpropnoides, cuyo precursor es l fenillnin. L primer enzim en ctur en est rut sore dicho precursor es l fenillnin monio-lis (PAL). En frutills, l ctividd PAL ument considerlemente conforme el fruto mdur (Given y col., 1988; Jkol y col., 2002) y dicho incremento se correlcion con un umento en el contenido de ntocinins. Asimismo, durnte l mdurción de este fruto el umento en los niveles de ntocinins v compñdo de un descenso de clorofils y de crotenoides (Woodwrd, 1972; Given y col., 1988) Azúcres y ácidos simples Los zúcres son los principles componentes solules presentes en los frutos lndos. Estos compuestos, demás de contriuir en distints ruts metólics centrles, cumplen un rol importnte en l determinción del sor del fruto (Mnning, 1993). Los zúcres myoritrios encontrdos en distints vrieddes de frutills mdurs son glucos (1,4 3,1%), fructos (1,7 3,5%) y scros (0,2 2,5%). El contenido de zúcres solules totles expresdos como miligrmos de zúcr por fruto, ument l progresr l mdurción (Woodwrd, 1972). Al igul que los zúcres, los ácidos orgánicos contriuyen l sor del fruto. L relción entre el contenido de zúcres y el contenido de ácidos es frecuentemente utilizd como índice de ceptilidd y clidd de los frutos. Se h descrito un umento en el contenido de ácidos orgánicos por fruto durnte el desrrollo y l mdurción de frutill (Woodwrd, 1972). Los ácidos orgánicos más undntes en este fruto son: cítrico ( mg %), málico ( mg %) y scórico ( mg %). El contenido de este último ácido, de conocid importnci nutricionl, ument conforme el fruto mdur. Se h demostrdo que el precursor de l síntesis del ácido L-scórico en frutill es el ácido D- glcturónico (componente myoritrio de ls pectins) y que l expresión de l enzim D- glcturónico reducts correlcion con los niveles de este ácido en el fruto (Agius y col., 2003) Compuestos volátiles Cd fruto posee un huell dctilr de compuestos volátiles, cuy cominción le confiere su rom crcterístico. Es tn prticulr este ptrón de undncis reltivs de moléculs volátiles, que se hn encontrdo diferencis un comprndo distintos cultivres 8

14 INTRODUCCIÓN de frutill (Dirinck y col., 1981). En el cso de frutill se hn descrito l menos 360 moléculs que contriuyen l rom de l mism (Menger y col., 2004). Si ien se hn detectdo tnto ésteres como lcoholes y cronilos (Dirinck y col., 1981), los primeros son los predominntes en frutill (Menger y col., 2004). Deido que poseen umrles de percepción jos y que sus concentrciones son lts en vrios cultivres nlizdos, el furneol (2,5-dimetil-4-hidroxi-3(2H)-furnon) y el mesifurno (2,5-dimetil-4-metoxi-3(2H)- furnon) son considerdos como los principles contriuyentes l rom de frutill (Menger y col., 2004). 4. Regulción de l mdurción Como se mencionó nteriormente, los frutos pueden ser clsificdos en climtéricos y no climtéricos según su ptrón de producción de l hormon gseos etileno y el cmio en l ts respirtori durnte l mdurción. En este sentido, l frutill h sido clsificd dentro del grupo de los frutos no climtéricos, deido l j producción de etileno y l usenci de un pico de consumo de oxígeno o producción de CO 2 provenientes de l respirción. Es por ello que se hn propuesto otros reguldores como responsles principles del control del desrrollo y l mdurción, tles como ls uxins, el ácido scísico, ls gierelins y ls citoquinins. En el cso de frutill, el principl sitio de producción de moléculs reguldors del crecimiento es el quenio (Nitsch, 1950; Kno y Tdshi, 1979). Deido que los quenios se disponen superficilmente, éstos pueden ser removidos con reltiv fcilidd con el ojeto de discontinur el suministro de reguldores hci el receptáculo, por lo cul se dispone de un herrmient sencill y útil pr el estudio de l regulción hormonl del desrrollo y l mdurción de frutill. Ls uxins son un grupo de moléculs reguldors del crecimiento que fueron primermente involucrds en el crecimiento de céluls presentes en rotes y el consecuente lrgmiento de los mismos en l dirección del eje longitudinl (Thimnn, 1969). L uxin más undnte es el ácido 3-indol-cético (AIA) y es sintetizdo tnto por plnts como por cteris, hongos y lgs (Moore, 1979). Aunque pueden coexistir en un tejido distintos derivdos conjugdos del AIA, l form lire serí l que tendrí myor ctividd como reguldor del crecimiento. En los frutos los niveles de uxins son elevdos durnte el desrrollo, reflejndo su intervención en l estimulción del crecimiento. En frutill, l presenci de uxins (producids por los quenios) es esencil pr l expnsión del receptáculo durnte el desrrollo del fruto (Nitsch, 1950). Al remover los quenios de frutos entre 4 y 21 dís luego de l polinizción se logr disminuir l expnsión del 9

15 INTRODUCCIÓN receptáculo, fenómeno que puede ser revertido por l dición de uxins sintétics (Nitsch, 1955). Ls uxins producids en los quenios tmién fectn l mdurción. Si se retirn los quenios de un mitd del fruto en un estdio verde grnde, se puede oservr un celerción de l mdurción (medid como producción de ntocinins, pérdid de firmez y disminución del contenido de clorofil) en l mitd dequend respecto l mitd intct (Given y col., 1988). Si ien los niveles de ls uxins son elevdos durnte el desrrollo, l comenzr y vnzr l mdurción los vlores descienden, lo que está de cuerdo con l hipótesis de que ésts reprimen l mdurción. En prticulr, el contenido de AIA lire en el receptáculo es elevdo durnte un período corto del desrrollo y luego desciende mrcdmente l vnzr l mdurción (Archold y Dennis, 1984). El ácido scísico (ABA), cuy estructur se semej l porción terminl de ciertos crotenoides, es sintetizdo en cloroplstos y otros plástidos. Se h registrdo un umento en el contenido de ABA durnte l mdurción tnto de frutos climtéricos (pers, plts, tomtes y durznos) como de frutos no-climtéricos (cítricos, uvs y frutills) (Leshem y col., 1986). En frutill, el ABA se cumul en los quenios durnte l mdurción, sin umentr sustncilmente en el receptáculo (Archold y Dennis, 1984). Al cultivr receptáculos in vitro en un medio suplementdo con ABA, se pudo oservr un disminución en el tiempo requerido pr l mdurción complet (Kno y Ashir, 1981). En un trjo más reciente, el trtmiento de frutos enteros con ABA provocó un incremento de prámetros socidos l mdurción, tles como: desrrollo de color por incremento en el contenido de ntocinins, umento en l ctividd PAL y descenso de l firmez del fruto (Jing y Joyce, 2003). Es de destcr que el trtmiento con ABA en este cso, indujo su vez un umento en l producción de etileno que podrí contriuir los cmios oservdos. De este modo, es prole que l estimulción de l mdurción por l plicción exógen de ABA esté solpd con l cción del etileno generdo como consecuenci del trtmiento. Ls gierelins y citoquinins contriuyen prolemente l regulción de l mdurción en frutill, unque se encuentrn en menor concentrción que ls uxins y el ABA (Perkins-Vezie, 1995). Ls gierelins están constituíds por un fmili de ácidos diterpeno (se hn descrito l menos 100 compuestos relciondos) cuy síntesis es llevd co en diferentes plástidos y en el citosol. Se ls h socido l control del crecimiento de tllos, l inicición florl en lguns plnts y l promoción del estlecimiento de frutos y de l germinción. L plicción exógen de ácido gierélico (GA 3 ) en frutills cosechds provoc un disminución de l ctividd respirtori, menor cumulción de ntocinins y menor degrdción de clorofils, que en conjunto indicn un retrso en l mdurción 10

16 INTRODUCCIÓN (Mrtínez y col., 1996). Ls citoquinins, moléculs derivds de ses nitrogends, hn sido socids l inducción de mitosis en cllos en presenci de uxins, l promoción de l formción de ríces o tllos dependiendo de su relción molr con uxins, l retrso en l senescenci de hojs y l expnsión de cotiledones (Clelnd, 1996). Este grupo de moléculs h sido poco estudido en relción l desrrollo y l mdurción de frutos. Se cree que ls citoquinins interccionrín con otr clse de hormons vegetles en l estimulción y coordinción del desrrollo del fruto (Ozg y Reinecke, 2003). En el cso de frutill, se registró un umento en l ctividd de citoquinins y de gierelins durnte el inicio del desrrollo, con un máximo luego de 7 dís postntesis (Lis y col., 1978). Si ien l frutill h sido clásicmente grupd dentro de los frutos no climtéricos, existe controversi respecto de su inclusión dentro de este grupo, ddo que lo lrgo del tiempo ls experiencis pr determinr el rol del etileno hn rrojdo resultdos contrdictorios. El nivel de producción de etileno en este fruto es de veces menor que los encontrdos en frutos típicmente climtéricos (Innett y col., 2006). Al dministrr inhiidores de l síntesis o de l cción del etileno trvés del pedúnculo de frutos en estdio verde grnde, no se oservron diferencis en el contenido de ntocinins ni de ctividd PAL, entre frutos trtdos y controles (Given y col., 1988). Sin emrgo, l plicción de diversos inhiidores de l cción del etileno, como permngnto de potsio (Kim y Willis, 1998) y 1-metilciclopropeno (1-MCP) (Ku y col., 1999) h demostrdo ser efectiv pr extender l vid poscosech de frutos cosechdos con mdurez comercil (Innett y col., 2006). A su vez, se h hlldo l menos un miemro (FPE1) de un fmili de genes involucrdos en l modificción de l pred celulr (pectin metilesterss, PME) que posee un dominio de respuest l etileno (Cstillejo y col., 2004). Más recientemente se hn clondo genes que codificn pr enzims de iosíntesis (FACO1 y FACO2) y proteíns involucrds en l percepción (FEtr1, FEtr2 y FErs1) de etileno, cuys expresiones hn sido detectds tnto en tejidos vegettivos como durnte el desrrollo y l mdurción del fruto (Trinotti, 2005). Finlmente, en un estudio reciente relizdo con frutos ún en l plnt se hlló que en el estdio rojo mduro l producción de etileno estuvo crcterizd por un cumulción cíclic no-diurn que coincidirí con un climterio respirtorio (Innett y col., 2006). El nálisis conjunto de estos resultdos sugiere que l mquinri de síntesis y de percepción de etileno en frutill serí funcionl, y que existen genes socidos l mdurción cuy expresión es influencid por est hormon. Sin emrgo, l influenci del etileno en l regulción de l mdurción serí menor que l ejercid por ls uxins, el ABA y los demás reguldores hormonles. 11

17 INTRODUCCIÓN 5. Pred celulr Ls predes celulres que roden ls céluls vegetles son estructurs complejs y dinámics, compuests principlmente por poliscáridos de lto peso moleculr, proteíns ltmente glicosilds y eventulmente, lignin (Somerville y col., 2004). Poseen l cpcidd de determinr l form celulr, otorgr estilidd mecánic, mntener unids ls céluls en un tejido, modulr el crecimiento celulr y constituir un rrer nte el tque de ptógenos. Tnto l estructur como l composición y ls propieddes de l pred celulr cmin lo lrgo de l vid de l célul. Ls nuevs predes celulres, denominds primris, son generds durnte l división celulr y rápidmente umentn su áre superficil cundo ocurre l expnsión celulr. Seprndo céluls contigus se encuentr l denomind lámin medi cuy composición es crcterístic y constituye l interfse entre ls predes celulres de dichs céluls. Durnte su diferencición, cierto tipo de céluls (como ls que se hlln en el tejido xilemático o en tejidos de sostén como el esclerénquim) genern por dejo de l pred primri, un pred secundri. Est clse de predes está socid l especilizción que sufren ls céluls, por lo que l composición de ests predes secundris es vrile según el tipo de célul. Por ejemplo, ls firs de lgodón están constituids por 98% de celulos, mientrs que en otro tipo de céluls pueden existir moléculs no celulósics tles como diferentes clses de poliscáridos, proteíns y moléculs con residuos romáticos (fundmentlmente lignin) (Crpit y McCnn, 2000). L pred celulr primri (PCP), que es l que se hll frutos, posee un escso o nulo contenido de compuestos romáticos y, diferenci de ls predes secundris, está ltmente hidrtd (65% de gu). Dicho componente cuoso contiene solutos y proteíns solules, que incluyen enzims (Brummell, 2006). Los componentes que formn prte de l PCP son: celulos, hemiceluloss, pectins y proteíns estructurles. A continución se descrien en detlle cd uno de estos componentes: 5.1. Componentes de l pred celulr Celulos: Se encuentr formd por cdens lineles de β-1,4-glucnos, ls cules se disponen conformndo microfirills, de lrededor de 3 nm de diámetro y que generlmente consisten de 36 de ests cdens lineles uicds prlelmente (Somerville, 2006). Se h descrito l existenci de complejos enzimáticos de celulos-sints unidos l memrn plsmátic, responsles de l síntesis y el ensmlje de ls microfirills. Estos complejos 12

18 INTRODUCCIÓN pueden ser visulizdos como rosets hexmérics de nm de diámetro (Lerouxel y col., 2006). A prtir de cd suunidd de est roset, se postul que son extrudids múltiples cdens de β-1,4-glucnos que se unen conformndo microfirills por fuer de l memrn plsmátic, como consecuenci de l intercción por puentes de hidrógeno entre dichs cdens de glucnos (Somerville y col., 2004). L zon intern de ls microfirillls posee un estructur cristlin que excluye ls moléculs de gu, mientrs que ls cps más externs son más morfs y permitirín el entrecruzmiento con otros componentes de l pred celulr (Puly y col., 1999). Es de destcr que l deposición de ls microfirills en l pred celulr está crcterizd por un orientción controld. En ls predes primris, su orientción es generlmente perpendiculr l eje de elongción celulr (Lerouxel y col., 2006), restringiendo el hinchmiento lterl y permitiendo l expnsión longitudinl (Somerville y col., 2004) Hemiceluloss: Este grupo de moléculs está compuesto por poliscáridos que se socin con ls microfirills de celulos pr formr un mtriz entrecruzd. Son neutrs o levemente ácids, están formds por zúcres neutros y no poseen ácido glcturónico. L síntesis de est clse de moléculs está mucho menos estudid que l de l celulos; serín sintetizds en el Golgi y depositds en l pred celulr ví vesículs secretoris. Ls clses principles de hemiceluloss hllds en l PCP son: ) xiloglucnos (XG): Son cdens de β-1,4-glucnos con sustituciones de residuos de D-xilos, lguns de ls cules están sustituids su vez por β-d-glctos y eventulmente α-l-fucos (Fig. 3). Gl Gl -β(1 2)- -β(1 2)- Xil Xil Xil Xil Xil -α(1 6)- -α(1 6)- -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- Glc -β(1 4)- -α(1 6)- -α(1 6)- -α(1 6)- Glu D-glucos Xil D-xilos Gl D-glctos Figur 3: Representción esquemátic del xiloglucno. Adptdo de Somerville y col.,

19 INTRODUCCIÓN ) glucomnnos: Son moléculs con regiones lternntes de β-1,4-glucnos y β- 1,4-mnnos, con ocsionles residuos de α-d-glctos como cdens lterles. c) xilnos: Son polímeros compuestos por un cden principl de residuos xilosilo unidos por enlces β-1,4, sustituidos con residuos de ácido α-d-glucurónico y de α- L-rinos (Fig. 4). AGl Ar -α(1 2)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- Xil -β(1 4)- -α(1 2)- Xil -β(1 4)- AGl Ácido D-glucurónico Xil D-xilos Ar L-rinos Figur 4: Representción esquemátic del xilno. Adptdo de Somerville y col., Pectins: Es un conjunto heterogéneo de polímeros ltmente hidrtdos, ricos en ácido α-d-glcturónico (AG) (Crpit y McCnn, 2000). Este grupo está compuesto por 17 monoscáridos distintos y su síntesis involucrrí l menos 53 glicosil trnsferss diferentes loclizds en el prto de Golgi (Ridley y col., 2001). En generl, ls pectins son el grupo de componentes myoritrios en l pred celulr de los frutos y pueden llegr conformr l mitd del contenido polimérico de l pred (Brummell, 2006). Se hn isldo tres tipos de poliscáridos pécticos prtir de ls PCP: ) homoglcturonnos (HG): Cden linel de ácido α-1,4-glcturónico. Puede presentr metil-esterificción en C-6 y eventulmente grupos cetilo en C-2 o C-3 (Fig. 5). Serín sintetizdos con un lto porcentje de grupos croxilos esterificdos con residuos metilos (lo cul disminuye l repulsión entre polímeros) (Crpit y McCnn, 2000) y un vez uicdos en l pred celulr, por cción de esterss quedrí lire el grupo croxilo (ver Sección 6.2.). Estos poliscáridos 14

20 INTRODUCCIÓN están presentes en tod l pred primri, y son el componente myoritrio de l lámin medi (Jrvis y col., 2003). -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG Ácido D-glcturónico, lgunos se muestrn metil esterificdos ( ) Figur 5: Representción esquemátic del homoglcturonno (HG). Adptdo de Somerville y col., ) rmnoglcturonnos tipo I (RG I): Polímeros que contienen repeticiones del discárido [ 2)-α-L-rhmnos-(1 4)-α-L-ácido glcturónico-(1 ] n, donde n puede lcnzr vlores cercnos 100 (McNeil y col., 1980). Entre 20 y 80% de los residuos de rmnos pueden estr sustituidos en el C-4. Est sustitución puede consistir de un único residuo de β-d-glctos, o de un cden poliméric de rinoglctnos I o rinnos (Fig. 6). -α(1 2)- Rh -α(1 4)- AG -α(1 2)- Rh -α(1 4)- AG -α(1 2)- Rh -α(1 4)- AG -α(1 2)- Rh -α(1 4)- AG -α(1 2)- Ar -α(1 3)- Ar -α(1 3)- -α(1 5)- -α(1 5)- -α(1 5)- -α(1 4)- Ar Ar Ar rinno Gl Ar -α(1 3)- Gl rinoglctno Ar Ar -α(1 3)- -α(1 5)- -β(1 4)- -β(1 4)- -β(1 4)- -β(1 4)- Gl Gl Gl -β(1 4)- -β(1 4)- Rh L-rmnos AG Ácido D-glcturónico Gl D-glctos Ar L-rinos Figur 6: Representción esquemátic del rmnoglcturonno tipo I (RG I). Adptdo de Somerville y col.,

21 INTRODUCCIÓN Los rinoglctnos I están compuestos por un cden principl de D-glctos unid por enlces β-1,4 y pueden existir eventules sustituciones de L-rinos medinte uniones α-1,3 (Ridley y col., 2001). Los rinnos está compuestos exclusivmente por L-rinos, con un cden principl con uniones α-1,5 que puede estr sustituid con α-l-rinos-(1 2)-α-L-rinos-(1 3) y/o α-lrinos-(1 3)-α-L-rinos-(1 3) (Ridley y col., 2001). Existen zons de los RG I con undntes rinoglctnos y rinnos, conformndo regiones muy rmificds ( hiry ) de ls pectins (Vincken y col., 2003). c) glcturonnos sustituidos: Lo componen un grupo diverso de poliscáridos que contienen un cden principl linel de residuos de ácido α-d-glcturónico unidos por enlces α-1,4. Los rmnoglcturonnos de tipo II (RG II) pertenecen este grupo de glcturonnos y están mplimente distriuidos en ls predes celulres primris de plnts superiores (O'Neill y col., 2004). A pesr de sus nomres similres, los RG I y RG II, difieren mrcdmente en su estructur. Los RG II poseen un cden principl de l menos 7 residuos de ácido glcturónico unidos por enlces α-1,4 y tienen un crcterístic estructur ltmente rmificd. Ls cdens lterles encontrds pueden ser de non, oct o discáridos, e incluyen residuos de D-pios, L-fucos, L-rmnos, ácido 3-deoxo-D-lyxo-heptulósico, entre otros (Somerville y col., 2004). Asimismo, pertenecen este grupo de glcturonnos sustituidos los xiloglcturonnos, que contienen residuos de β-dxilos unidos l C-3 de l cden principl (Ridley y col., 2001). Xil Xil Xil Xil -β(1 3)- -β(1 3)- -β(1 3)- -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- AG -α(1 4)- -β(1 3)- AG -α(1 4)- AG Ácido D-glcturónico Xil D-xilos Figur 7: Representción esquemátic del xiloglcturonno. Adptdo de Somerville y col.,

22 INTRODUCCIÓN Proteíns estructurles: Son los componentes de l pred celulr menos undntes y su vez menos estudidos. Se crcterizn por ser glicoproteíns rics en ciertos minoácidos, lo cul permite su clsificción en: HPGP (glicoproteíns rics en hidroxiprolin), PGP (glicoproteíns rics en prolin) y GGP (glicoproteíns rics en glicin) (Crpit y McCnn, 2000) Disposición espcil de los componentes de l pred celulr Si ien l composición químic de los polímeros que componen l pred celulr h sido descrit en detlle, no existe un modelo definitivo cerc de l disposición tridimensionl de estos componentes. El modelo más ceptdo, propone que ls microfirills de celulos estrín entrecruzds por xiloglucnos y que ls pectins estrín ocupndo los espcios lires (Cosgrove, 2001). En l figur 8, se esquemtiz dicho modelo. Se oserv por sore l PCP l lámin medi, que es un zon ric en pectins entre ls predes primris de dos céluls y que proporcion conexiones intercelulres (Jrvis y col., 2003). Lámin medi Pectins Pred celulr primri Memrn plsmátic Celulos Hemiceluloss Figur 8: Modelo ceptdo de l pred celulr, dptdo de Smith, Se precin ls hemiceluloss (línes de color rojo) entrecruzndo microfirills de celulos (cilindros de color celeste). Ls pectins (línes irregulres de color negro) se disponen ocupndo los espcios entre l red celulos-hemicelulos. Por sore l PCP se oserv l lámin medi. 17

23 INTRODUCCIÓN 5.3. Intercciones entre los componentes de l pred celulr: Es importnte tener en cuent el tipo de intercciones que existen entre los polímeros que componen l pred pr comprender más profundmente l estructur y propieddes de l mism y el porte que puede hcer cd grupo de moléculs. Asimismo, el conocimiento de dichs intercciones permite el desrrollo de metodologís decuds pr l extrcción de frcciones enriquecids en determindo tipo de polímeros pr su posterior nálisis. Ls microfirills de celulos interccionrín con el resto de los componentes de l pred celulr medinte puentes de hidrógeno. Estudios recientes demostrron que, en lguns plnts, sólo un pequeñ frcción (lrededor del 8%) de l superficie de ls microfirills estrí en contcto directo con los xiloglucnos (Bootten y col., 2004). Se h podido demostrr l intercción entre ls cdens lterles de pectins y celulos in vitro (Zykwinsk y col., 2005). En prticulr, l myor intercción encontrd fue entre los rinnos no rmificdos y l celulos, lcnzndo un finidd de dsorción comprle con l del xiloglucno. A su vez se hllron clrs evidencis de l existenci de intercciones covlentes entre xiloglucnos (hemiceluloss) y pectins (Thompson y Fry, 2000; Popper y Fry, 2005) en vris especies. Se propuso demás l existenci de intercciones covlentes entre componentes pécticos (Ridley y col., 2001; Vincken y col., 2003). Los RG II tienen l potencilidd de interccionr de pres trvés de uniones covlentes orto-diéster (Fig. 9). Este enlce se form entre OH-2 y OH-3 de los residuos de D-pios de cd suunidd monoméric de RG II (Ridley y col., 2001). L formción de dímeros de RG II es un proceso que se d in vitro en usenci de ctlizdores proteicos. RG II Cden lterl Cden lterl RG II Figur 9: Los RG II pueden interccionr trvés de enlces orto diéster. Se oserv el átomo de B centrl y los residuos de D-pios, presentes en ls cdens lterles de los RG II. (Adptdo de Vincken y col., 2003). 18

24 INTRODUCCIÓN Otro tipo de intercciones existentes entre componentes de l pred celulr son ls intercciones iónics. L cpcidd de formr este enlce iónico es un crcterístic de los polímeros pécticos. Ls moléculs de homoglcturonnos pueden interccionr entre sí trvés de puentes iónicos de C +2 (Fig. 10). Este tipo de intercción requiere que el C-6 de los residuos de ácido glcturónico se encuentre no esterificdo. Es más, se requerirín l menos 10 residuos no esterificdos contiguos pr que se dier un entrecruzmiento estle entre cdens (Liners y col., 1992). Figur 10: Intercción trvés de puentes de C +2 entre grupos croxilos no esterificdos de dos cdens de homoglcturonnos (Adptdo de Vincken y col., 2003). Los iones C 2+ se representn como esfers. En l figur 11 se resumen los tipos de intercciones que existirín entre los distintos componentes de l pred. Es de destcr que ls pectins pueden interccionr trvés de un myor diversidd de enlces que los restntes polímeros presentes en l pred celulr. Más ún, ls pectins son los componentes con myor proilidd de formción de fuertes enlces covlentes. Celulos Pte. de H Hemiceluloss Pte. de H Pte. de H Covlentes Pectins Pte. de H Iónics Covlentes Figur 11: Esquem de los componentes de l pred celulr y ls posiles intercciones entre los mismos. Pte de H, represent intercciones tipo puente de hidrógeno. 19

25 INTRODUCCIÓN Un práctic hitul utilizd pr el estudio de los componentes de pred es el islmiento de l mism y l posterior extrcción secuencil de distints frcciones sándose en su soluilidd diferencil (Brummell, 2006). Primermente, pr islr ls predes celulres de cierto tejido, se somete éste un eullición en etnol soluto y posteriormente se reliz un filtrción (Fig. 12). Deido que los polímeros permnecen insolules en este lcohol, el sólido resultnte está compuesto fundmentlmente por ls predes celulres que se hlln en el tejido trtdo. Suele denominrse este residuo, residuo insolule en lcohol (RIA). A continución es posile relizr l extrcción del RIA con gu pr soluilizr ls pectins con intercciones más déiles (pectins solules en gu, PSA), seguid de un extrcción con gentes quelntes pr secuestrr los iones y soluilizr ls pectins con intercción trvés de puentes de C 2+ (pectins solules en EDTA, PSE). Luego, puede relizrse un extrcción con N 2 CO 3 o HCl en cliente pr hidrolizr los enlces covlentes y lierr ls pectins ligds medinte dicho tipo de unión (pectins solules en N 2 CO 3 o HCl, PSH en este último cso). Tejido vegetl Eull. etnol RIA Extrcción gu Extrcción EDTA Extrcción HCl Extrcción NOH Cel: Frcción enriquecid en celulos PSA: Frcción enriquecid en pectins de intercción déil PSE: Frcción enriquecid en pectins de intercción iónic PSH: Frcción enriquecid en pectins de intercción covlente Hem: Frcción enriquecid en hemiceluloss Figur 12: Mrch de extrcción de l pred celulr y sus distintos componentes. El tejido es homogeneizdo con etnol y llevdo reflujo. El sólido resultnte de l filtrción, residuo insolule en lcohol (RIA), está compuesto principlmente por ls predes celulres presentes en el tejido. L extrcción secuencil con gu, EDTA y HCl permite l soluilizción de pectins de intercción déil, iónic y covlente, respectivmente. Medinte el trtmiento con NOH del residuo resultnte de l extrcción de pectins, se soluilizn ls hemiceluloss (Hem). El residuo sólido finl está conformdo por celulos (Cel). 20

26 INTRODUCCIÓN Pr l soluilizción de hemiceluloss hitulmente se utiliz solución lclin diluid (hemiceluloss déilmente unids) y solución lclin concentrd (hemiceluloss fuertemente unids). Es de destcr que l extrcción direct con un solución lclin concentrd, permite l soluilizción de ms frcciones de hemiculoss (frcción enriquecid en hemiceluloss, Hem). El residuo remnente de est últim extrcción está compuesto predominntemente por celulos (Cel). Si ien est mrch de extrcción permite l otención de frcciones enriquecids en cierto tipo prticulr de moléculs, ésts pueden contener pequeñs cntiddes de otros polímeros por lo que en relidd consisten en mezcls de distintos polímeros coextrídos (Brummell, 2006) Cmios en l pred celulr durnte l mdurción Los distintos componentes de l pred sufren modificciones como consecuenci de l cción de diverss enzims y proteíns (ver Sección 6 pr un descripción detlld). Est modificción en l pred celulr está fuertemente socid los cmios de textur crcterísticos de los frutos durnte su mdurción Depolimerizción de poliurónidos Los polímeros pécticos pueden sufrir depolimerizción con un consecuente reducción de su ms moleculr. El grdo de depolimerizción oservdo en cd frcción péctic no es el mismo cundo se comprn distints especies (Brummell, 2006). En grn cntidd de trjos se nlizó l depolimerizción de frcciones de pectins que incluyen tnto poliurónidos solules en gu como en gentes quelntes, es decir pectins de intercción déil e iónic, respectivmente. Est frcción estrí compuest fundmentlmente por homoglcturonnos, unque tmién pueden estr presentes en menor proporción RG I y RG II (Brummell, 2006). En especies como pimiento (Hrpster y col., 2002), nn (Wde y col., 1992) y mnzn (Yoshiok y col., 1992)) se oservó un leve depolimerizción de ests frcciones. En plt (Huer y O'Donoghue, 1993) el grdo de depolimerizción fue lto, mientrs que en tomte (Huer y O'Donoghue, 1993; Brummell y Lvitch, 1997) y en durzno (Brummell y col., 2004) fue intermedio. Luego de que los polímeros pécticos solules en gu y gentes quelntes hn sido removidos, l extrcción con N 2 CO 3 o HCl soluiliz un frcción de poliurónidos que estrín unidos l pred trvés de enlces éster, los cules son hidrolizdos por dichos gentes soluilizntes. Este extrcto generlmente contiene rmnos, que es un componente principl de los RG I, y un myor contenido de rinos y glctos, típicos de 21

27 INTRODUCCIÓN ls cdens lterles de los RG I (Redgwell y col., 1991; Rose y col., 1998; Brummell y col., 2004). Es de notr que en l myorí de los trjos no se h nlizdo el grdo de depolimerizción que sufren este tipo de polímeros pécticos, lo cul puede llevr generlizciones incorrects respecto del grdo de modificción de ls pectins en ciertos frutos. En los pocos csos en los que se estudió est frcción (tomte (Brummell y Lvitch, 1997), melón (Rose y col., 1998) y durzno (Brummell y col., 2004)), no se hn oservdo grndes cmios en el perfil de mss moleculres; sin emrgo, es prole que esto se consecuenci del empleo de métodos drásticos durnte l extrcción de est frcción (Brummell, 2006). Es decir que como consecuenci del proceso de islmiento de est frcción, es posile que los polímeros sen modificdos y que esto enmscre diferencis existentes entre distintos estdios de l mdurción Pérdid de glctnos y rinnos L myorí de l glctos y rinos de ls PCP se encuentr presente en 1,4-β-Dglctnos, 1,5-α-L-rinnos o rinoglctnos rmificdos, formndo prte de ls rmificciones de los RG I. L pérdid de glctos y rinos polimérics es un proceso que ocurre comúnmente durnte l mdurción de l myorí de los frutos (Gross y Sms, 1984; Redgwell y col., 1997). Amos zúcres son hlldos en tods ls frcciones de pectins, pero se encuentrn preferentemente en ls frcciones solules en álclis. Sin emrgo, suelen quedr remnentes de estos zúcres en el residuo insolule luego de l extrcción con álcli, correspondiente l celulos (Seymour y col., 1990; Redgwell y col., 1997). Esto sugiere que prte de los RG I estrín íntim y fuertemente integrdos l pred trvés de sus cdens lterles y/o su cden principl (Redgwell y col., 1997; Zykwinsk y col., 2005) Demetilción de pectins Los HG inicilmente son sintetizdos y secretdos l pred celulr con un lto grdo de metilesterificción (Crpit y McCnn, 2000), el cul disminuye durnte el desrrollo deido l cción de enzims poplástics. L reducción del grdo de metilción es un crcterístic común durnte el desrrollo vegetl y es prticulrmente notle en l mdurción de frutos (Brummell, 2006). Asocid este proceso se encuentr l pectin metilesters (PME), que ctliz l hidrólisis de dichos ésteres (ver Sección 6.2). Como consecuenci de l cción de est enzim se gener metnol y el C-6 del AG que intervení en el grupo éster, se trnsform en un grupo croxilo con l cpcidd de formr puentes 22

28 INTRODUCCIÓN iónicos. L demetilción de ls pectins modific significtivmente el grdo de hidrtción y l soluilidd de ls misms. Igulmente, el grdo de metilción fect l finidd que poseen cierts enzims pectinolítics por los polímeros pécticos (Pressey y Avnts, 1982; Seymour y col., 1987; Koch y Nevins, 1989; Wkyshi y col., 2000; Wkyshi y col., 2003). Ls condiciones del medio poplástico tmién son fectds por este proceso de demetilción y que l ionizción del grupo croxilo que se gener (en H + y croxilto) modific el ph y el lnce iónico. Además se genern superficies con crg eléctric que pueden lterr el movimiento de otros componentes crgdos de l pred y el poplsto (Grignon y Sentenc, 1991) Soluilizción de pectins En l myorí de los frutos se oserv un umento en l cntidd de poliurónidos que componen ls frcciones solules en gu y en gentes quelntes durnte l mdurción (proceso denomindo soluilizción de pectins ). Este fenómeno h sido descrito en kiwi, plt, ppy, tomte y durzno, entre otros (Redgwell y col., 1992; Huer y O'Donoghue, 1993; Lzn y col., 1995; Brummell y Lvitch, 1997; Wkyshi y col., 2000; Brummell y col., 2004). Los mecnismos por los cules ciertos poliscáridos psn formr prte de frcciones con intercciones más déiles con los demás componentes no hn sido completmente diluciddos. En lgunos csos, como en tomte, est soluilizción h sido vinculd l depolimerizción de poliurónidos (Giovnnoni y col., 1989). En otros, como kiwi, melón y durzno, se registró un umento en l soluilidd sin depolimerizción detectle (Dwson y col., 1992; Redgwell y col., 1992; Rose y col., 1998; Brummell y col., 2004). L desesterificción de pectins tmpoco prece ser l cus primri de su soluilizción (Wkyshi y col., 2000). Al menos en frutill, se h propuesto que l soluilizción de ls pectins estrí socid l degrdción de ls cdens lterles presentes en ls misms (Koh y Melton, 2002). Del mismo modo, no se conoce con certez si l soluilizción previ de los polímeros pécticos es necesri pr que ocurr l depolimerizción, unque en l myorí de ls especies l soluilizción comienz en etps temprns de l mdurción (Brummell, 2006) Depolimerizción de hemiceluloss Se h descrito un disminución en ls mss moleculres de ls frcciones que componen los polímeros con l cpcidd de ser extrídos con álcli (glucnos de mtriz; principlmente hemiceluloss) en frutill (Huer, 1984), tomte (Tong y Gross, 1988; 23