UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS FECUNDACIÓN IN VITRO EN CANINOS: EVALUACIÓN DE LA PENETRACIÓN ESPERMÁTICA EN EL TIEMPO UTILIZANDO SEMEN FRESCO Y REFRIGERADO CON OVOCITOS EN DIFERENTES ESTADOS DE MADURACIÓN. Crl Fernnd Anguit Bohmwld Memori pr optr l Título Profesionl de Médio Veterinrio Deprtmento de Fomento de l Produión Animl. PROFESOR GUÍA: DRA. MONICA DE LOS REYES S. Finnimiento Proyeto FONDECYT 1030380 SANTIAGO CHILE 2006

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS FECUNDACIÓN IN VITRO EN CANINOS: EVALUACIÓN DE LA PENETRACIÓN ESPERMÁTICA EN EL TIEMPO UTILIZANDO SEMEN FRESCO Y REFRIGERADO CON OVOCITOS EN DIFERENTES ESTADOS DE MADURACIÓN. Crl Fernnd Anguit Bohmwld Memori pr optr l Título Profesionl de Médio Veterinrio Deprtmento de Fomento de l Produión Animl. NOTA FINAL: 7.0 NOTA FIRMA PROF. GUÍA: DRA. MONICA DE LOS REYES S....... PROF. CONSEJERO: DR. WALTER VON FREY...... PROF. CONSEJERO: DR. VICTOR H. PARRAGUEZ...... SANTIAGO CHILE 2006

ABSTRACT The im of this work ws to investigte in vitro fertilizing hbility of ooled (4 ) nd fresh espermtozo to ross the zon pelluid (ZP) nd penetrte the itoplsm (C) of immture nd in vitro mtured bith ooytes through out different oinubtion times. Ejultes were obtined by mnul stimultion from five dult dogs using the sperm-rih frtion. After semen evlution, seminl plsm ws removed by entrifugtion. The reminig pellet of the sperm tht ws going to be proessed s fresh smple (ontrol) ws resuspended in Fert TALP medi. The one left to be proessed s ooled smples ws rediluted in TRIS- egg yolk-itri id extender nd then mnteined t 4 C for 24 hours, fter tht the extender ws removed by entrifugtion nd the pellet ws resuspended in Fert TALP medi. Fresh nd hilled spermtozo were oinubted with immture nd in vitro mturted bith ooytes seprtely. Ovries from ovrietomy were merted to obtin ooytes wih were seleted under stereosopi mirosope nd wshed in PBS medi. Those ooytes used s immture ooytes were previously dpted in Fert TALP medi nd then oinubted whith fresh o hilled spermtozo. Ooytes for in vitro mturtion were inubted in TCM 199 medi suplemented whith 10% FCS, 10 UI/mL de hcg, 2,5µL/mL of pyruvte solution nd 5 µl/ml ntibioti solution for 72 nd 96 hours. Finlly, they were oinubted with both fresh nd hilled sperm seprtely. Gmetes were oinubted for up to ten hours in Fert TALP medi. At eh hour ooytes were removed from the o-ulture medi, fixed with eti id-methnol- hloroform solution (3:6:2) for 3 minutes, nd with id eti-methnol solution for 72 hours t 4 C. The ooytes were then stined with 0.1% of propidium iodide nd exmined with epifluoresene mirosope. Penetrted ooytes were defined s those hving sperm heds in ZP, PV or C. A totl of 3391 immture (n= 1765) nd mtured (n=1626) ooytes were evluted. 1

The results showed tht s the o-ulture time inreses the penetrtion rte through the egg ots lso inreses using fresh nd hilled dog sperm. The inrese in the pentetrtion rte with fresh sperm ws found signifint from 3 hours of o-ulture for immture ooytes nd 2 hours for in vitro mtured ooytes (p<0,05). Nevertheless, hilled sperm showed signifint inrese sine 5 hours of o-ulture for immture ooytes nd 2 hours for in vitro mtured ooytes. Fresh sperm penetrted more ooytes thn hilled sperm in ll o-ulture time, exept in the first hour when hilled sperm ould penetrte more in vitro mtured ooytes (p<0,05). In vitro mtured ooytes were more penetrted thn immture ooytes during ll o-ulture time (p<0,05). In onlusion, when o-ulture time is inresed mjor number of sperm re pble of pssing through the egg ots. Although fresh sperm penetrte more ooytes the hilled sperms this ones n penetrte erlier in vitro mtured ooytes. Eventhough immture nd in vitro mtured dog ooytes n be pentrted by fresh or ooled nine sperms, in vitro mture ooytes would be more propite to evlute the fertilizing pity of fresh or hilled dog sperm. 2

RESUMEN En este trbjo se investigó medinte feundión in vitro, l pidd de espermtozoides ninos refrigerdos 4 C y fresos (ontroles), de trvesr l ZP, y penetrr el itoplsm ovulr, de ovoitos de perr en estdo inmduro y mdurdos in vitro, trvés de diferentes tiempos de oinubión gméti. Se trbjó on eyuldos de 5 perros dultos, el semen se obtuvo por estimulión digitl, utilizndo l segund frión espermáti. Luego de l evluión del semen, se retiró el plsm seminl por entrifugión, los espermtozoides utilizdos omo ontroles (fresos) fueron resuspendidos en medio Fert TALP y los espermtozoides que se sometieron refrigerión se resuspendieron en extensor o diluyente en bse TRIS-yem de huevoáido ítrio y fueron posteriormente refrigerdos 4 C, por 24 hors. Posterior ese tiempo, se retiró el diluyente por entrifugión y el pellet espermátio fue resuspendido en medio Fert TALP. Ambos tipos de espermtozoides -fresos y refrigerdos- fueron oinubdos on ovoitos de perr tnto inmduros omo mdurdos in vitro, en form seprd. Los ovoitos utilizdos provinieron de ovrios merdos, obtenidos previmente por ovrietomí. Los ovoitos fueron seleiondos bjo l lup estereosópi y lvdos en PBS. Posteriormente, los utilizdos en estdo inmduro se mbientron en medio de oinubión Fert TALP y luego se oinubron on espermtozoides fresos o refrigerdos. Los ovoitos que se sometieron mdurión in vitro fueron inubdos en medio TCM 199 suplementdo on 10% de suero fetl bovino, 10 UI/mL de hcg, 2.5 µl/ml de soluión piruvto y 5 µl/ml de soluión ntibióti por 72 y 96 hors. Posteriormente fueron oinubdos seprdmente on mbos tipos de espermtozoides. L oinubión gméti se relizó por períodos de 1 10 hors en medio Fert TALP. Cd hor de inubión se retirron ovoitos, se fijron en un soluión en bse áido étio, metnol y loroformo (3:6:2) por tres minutos, y posteriormente en áido étio y metnol (1:3) por 72 hors 4 C y teñids on 0,1% de Yoduro de Propidio pr l 3

posterior evluión de l penetrión espermáti y feundión en mirosopi de epifluoreeni. Un ovoito penetrdo se determinó undo se enontró espermtozoides en zon pelúid (ZP), en espio perivitelino (PV) o en el itoplsm ovulr (C). Se utilizó nálisis de vrinz y de regresión pr determinr diferenis en los diferentes prámetros estudidos. Se evluron un totl de 3391 ovoitos inmduros (n= 1765) y mdurdos in vitro (n= 1626). L penetrión espermáti fue diretmente proporionl l tiempo de oinubión. El umento del porentje de penetrión totl on espermtozoides fresos fue signifitivo prtir de ls 3 hors en ovoitos inmduros y 2 hors en ovoitos mdurdos in vitro (p< 0,05). Con espermtozoides refrigerdos, los ovoitos inmduros muestrn diferenis en l penetrión totl prtir de ls 5 hors de oinubión, en ovoitos mdurdos in vitro es posible observr diferenis prtir de ls 2 hors. Los myores porentjes de penetrión totl se obtuvieron prtir de ls 6 y 7 hors de oinubión y hi finles del ultivo. Los espermtozoides refrigerdos tuvieron un menor porentje de penetrión que los fresos, durnte todo el periodo de ultivo, exepto l primer hor de oinubión on ovoitos mdurdos in vitro y espermtozoides refrigerdos (p<0,05). Los ovoitos mdurdos in vitro fueron penetrdos en myor proporión que los inmduros (p< 0,05), onsiderndo todo el periodo de ultivo. Se onluye que l umentr el tiempo de ultivo, un myor número espermtozoides logró trvesr ls ubierts ovoitris. Los ovoitos inmduros y mdurdos in vitro son penetrdos en myor porentje por espermtozoides fresos respeto quellos refrigerdos, sin embrgo, los espermtozoides sometidos refrigerión serín pes de penetrr ntes los ovoitos mdurdos in vitro. No obstnte los ovoitos de perr inmduros y mdurdos in vitro pueden ser penetrdos por espermtozoides ninos fresos y refrigerdos, l utilizión de ovoitos mdurdos serí más propido pr evlur l pidd feundnte de los espermtozoides fresos y riopreservdos. 4

INTRODUCCIÓN Los estudios de spetos reprodutivos en el perro doméstio permiten su extrpolión otros ánidos silvestres, lo que obr importni espeilmente en quellos que se enuentren en peligro de extinión. Por otr prte, en los ninos doméstios tmbién son importntes estos estudios pr superr problems en pobliones on difiultdes en su pidd reprodutiv, omo por ejemplo mhos línimente dispitdos, hembrs que no eptn l mont o bien que tengn nomlís en su trto reprodutivo que le impidn reproduirse. Alguns biotenologís reprodutivs importntes de estudir y profundizr deudmente en ninos son: l riopreservión de espermtozoides, inseminión rtifiil y feundión y desrrollo embrionrio in vitro, pudiendo sí desrrollr posteriormente otrs más vnzds omo l trnsfereni nuler o lonión. L riopreservión de semen, en omprión l semen freso, permite tener un myor mrgen de tiempo pr su utilizión. Desde el punto de vist prátio, filit l difusión del mteril genétio de nimles que se enuentren distnidos, sin tener que utilizr trnsporte del individuo y todo lo que ello impli. A difereni del semen ongeldodesongeldo, el semen refrigerdo tiene un myor vibilidd posterior su preservión, por lo tnto, un myor porentje de preñees logrds (Bouhrd et l., 1990; Pinto et l., 1999). No obstnte lo nterior, l refrigerión tmbién us lteriones en ls estruturs del espermtozoide, soids mbios funionles, que se trduirín en el detrimento de su pidd feundnte. En estudios reientes, evlundo l vibilidd de espermtozoides de perro, expresd trvés de l tividd mitoondril y determind on l sond fluoresente Mitotrker, sí omo l integridd rosoml evlud según l esibilidd del Soyben Trypsin Inhibitor (SBTI) -onjugdo on AlexFluor 488 l rosom de espermtozoides vivos, se h determindo que en los espermtozoides refrigerdos hy un disminuión signifitiv de l vibilidd (76%) e integridd de membrn (75%), on respeto los espermtozoides fresos (84 y 82% respetivmente), observándose tmbién un umento en l ruptur rosoml de los espermtozoides refrigerdos, difereni que se mntiene l ser inubdos hst 6 hors (Mnoslv et l., 2005). 5

L evluión de l interión gméti on semen ongeldo, h demostrdo que el dño espermátio produto del enfrimiento, fet l funionlidd del espermtozoide en relión su pidd de penetrión l ZP (Strõm- Holst et l., 2000). Est deud penetrión espermáti trvés de ls ubierts ovoitris y l fusión del espermtozoide on l membrn plsmáti del ovoito, dependen de un estdo rosoml funionl, pr sí poder experimentr l pitión y reión rosómi del espermtozoide que le permitirá intertur on ls ubierts del ovoito (De los Reyes y Brros, 2000). En semen refrigerdo y ongeldo de perro, se h observdo demás un inremento signifitivo de espermtozoides reiondos entre ls 0 y 2 hors de inubión en medio pitnte, evludos medinte el ensyo de lortetrilin (CTC) (Rot et l., 1999), tiempo signifitivmente menor que en espermtozoides fresos. En otrs espeies omo el rtón (Fuller y Whittinghm, 1997), omprndo el semen ongeldo on el semen freso, el primero es pz de penetrr l ZP en orto tiempo, difereni de los espermtozoides fresos que requerirín un período de inubión más lrgo. L evluión de l pidd feundnte de espermtozoides ninos que hn sido refrigerdos, en relión on su unión y tiempo de penetrión l ZP del ovoito no h sido determind, por lo que su estudio yudrí l orret interpretión de los mbios experimentdos por estos espermtozoides en el proeso de feundión, optimizndo ls ténis de riopreservión espermáti y feundión in vitro en los ninos. 6

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Inseminión Artifiil L inseminión rtifiil (IA) impli el depósito de semen, trvés de ténis instrumentles, en el trto reprodutivo de l hembr. El primer informe sobre el uso de en IA on éxito nimles doméstios fue del ientífio Itlino Lázro Spllnzni en 1780, justmente en ninos, que obtuvo horros de un perr insemind on semen freso (Frstd, 2000; De Los Reyes, 2004). Atulmente l IA en ninos se reliz usndo semen freso, refrigerdo o ongeldo. El Amerin Kennel Club reonoe rís nids medinte ulquier de estos tipos de semen (Pinto et l., 1999). El número mínimo totl de espermtozoides reomenddo pr un inseminión vri desde 40 200 millones; sin embrgo, se hn obtenido gestiones on un número más reduido l depositrlos en el útero, y se trvés de ténis quirúrgis o trnservil (De Los Reyes, 2004). El uso de semen refrigerdo pr IA en ninos h obrdo importni en el último tiempo (Rot et l., 1999). Comprndo l IA utilizndo semen refrigerdo versus semen ongeldo, este último proesmiento disminuye signifitivmente l vibilidd espermáti, por lo que ls tss de preñees logrds son menores (Bouhrd et l., 1990). Además, requiere de equipos más sofistidos en su proesmiento y ténis más omplejs durnte l inseminión (inseminión intruterin) (Linde-Forsberg et l., 1999). Con el semen refrigerdo en mbio, ls tss de gestión son eptbles ún emplendo l téni intrvginl pr el depósito del semen. Por otr prte, el semen refrigerdo es de fáil mnejo, tnto en su proesmiento omo en su pliión (Rot et l., 1995) Diluyentes pr refrigerión del semen Se hn estudido diferentes tipos de diluyentes por su pidd de mntener l motilidd del semen nino sometido refrigerión trvés del tiempo (Bouhrd et l., 1990; Rot et l., 1995; Pinto et l., 1999; Ström- Holst et l., 2000; Iguer- Oud y Vergesten 2001; Tsuitsui et l., 2003; Ponglowpn et l., 2004). Estos diluyentes pueden inluir: itrto, 7

Tris, fosfto y gliin omo sustnis buffer, lehe, rem esterilizd, zúres, yem de huevo y ntibiótios (Rot et l., 1995). Se h demostrdo que l yem de huevo tendrí un efeto protetivo ontr l reión rosómi espontáne, uyo menismo no está un lro, pero puede ser medinte l mntenión de l presión oloideosmóti del medio externo (en el ul se enuentrn los espermtozoides) y por l proteión de l membrn plsmáti y rosómi (Foulkes, 1977; Wtson, 1981). Esto último puede ser debido que l yem de huevo previene o redue l pérdid de fosfolípidos de membrn que ourre durnte el shok térmio (Bouhrd et l., 1990). L gluos (Rot et l., 1997) y frutos (Silv y Verstegen, 1995) son los zúres ms utilizdos en los diferentes diluyentes. Los espermtozoides pueden obtener energí por l fosforilión oxidtiv mitoondril y gliólisis de estos zúres. Se h visto que el prinipl efeto de estos monosáridos en los diluyentes es mntener l motilidd y el ptrón de movimiento (Ponglowhpn et l., 2004), por lo tnto l utilizión de estos zúres, en diluyentes en bse yem de huevo, hn ddo un buen resultdo undo se evlú l motilidd espermáti, integridd de l membrn plsmáti y del rosom, tiempo de superviveni (Rot et l., 1995; Iguer-Oud y Vergesten, 2001; Ponglowhpn et l., 2004) y el número de rís luego de l inseminión rtifiil (Linde-Forsberg, 1995). Entre otros omponentes de los diluyentes están ls sustnis buffer, de ls ules ls que más se utilizn en ninos son el itrto y TRIS (Englnd, 1993; Linde Forsberg y Forsberg, 1993; Silv y Vergesten, 1995; Rot et l., 1997). En estudios donde se hn probdo diversos extensores pr semen nino, on quellos en bse yem de huevo- Tris (EYT), se hn obtenido mejores resultdos, tnto in vivo omo in vitro (Bouhrd et l., 1990; Rot et l., 1995, Ström- Holst et l., 2000; Iguer- Oud y Vergesten, 2001; Tsuitsui et l., 2003; Ponglowpn et l., 2004), tnto en l integridd rosoml evlud on diferentes métodos de tinión, omo en l mntenión de l motilidd espermáti por myor tiempo, obteniéndose un myor ntidd de espermtozoides vivos (Rot et l., 8

1995). Esto puede ser tribuible que est omposiión del diluyentes prevendrí l fls reión del rosom, que ourre junto l muerte del espermtozoide o junto un dño irreversible de él (Alseth y Ske, 1985). Criopreservión de espermtozoides L primer inseminión rtifiil exitos on semen refrigerdo nino fue relizd en 1954 por Hrrop, quien usó omo diluyente lehe y lo lmenó 4 C por 100 hors (Pinto et l., 1999; Tsuitsui et l., 2003). El uso del semen refrigerdo h demostrdo un buen resultdo en relión ls tss de fertilidd obtenids (Iguer-Oud y Verstegen, 2001). Sin embrgo, se h desrito que l fertilidd serí menor en omprión l semen freso (Linde- Forsberg et l., 1999; Wtson, 2000). Los espermtozoides de perro, humno y onejo son más tolerntes l shok térmio (enfrimiento) que los espermtozoides de otros nimles doméstios, omo los de los verros (Bouhrd et l., 1990). Esto es debido que los espermtozoides ninos tienen un relión de áidos grsos sturdos y poliinsturdos unidos los fosfolípidos de membrn menor, por lo tnto serín menos suseptibles l shok térmio que otrs espeies omo l porin (De los Reyes, 2004). En el proeso de enfrimiento, l membrn plsmáti sufre mbios morfológios (Sirividypong et l., 2000; De los Reyes, 2004), se produen lteriones en los lípidos de membrn y por lo tnto mbi el estdo funionl de est (Wtson, 2000). Dentro de estos mbios, ourre l seprión lterl de l fse lipídi on l grupión de ls proteíns integrles de membrn (Buhr et l., 1994). Est grupión puede fetr l funión de ls proteíns, espeilmente quells que juegn un rol estruturl y de modulión, omo por ejemplo, ls que onformn los nles iónios (Wtson, 2000). Otros mbios morfológios de membrn son un umento en su permebilidd y onseuente entrd de lio l espermtozoide (Robertson y Wtson, 1986; Mnoslv et l., 2005). Esto último es más grve durnte l ongelión que durnte l refrigerión y 9

tendrí onseuenis en términos de l funión elulr, lo ul en sos severos puede ser inomptible on l vibilidd del espermtozoide (Prks y Lynh, 1992). Se h visto que l membrn plsmáti es más sensible l enfrimiento que l estrutur rosoml del espermtozoide, por lo ul el deterioro de est membrn ourre ntes que el dño rosómio (Ponglowhpn et l., 2004). El ingreso de lio l élul durnte el enfrimiento ontribuye mbios en l pitión y en los eventos de fusión entre l membrn plsmáti y l membrn rosoml extern. Se hn desrito similitudes entre mbios en l membrn durnte el enfrimiento y l reión del rosom (Wtson, 2000). Un vne signifitivo h sido el reonoer que el espermtozoide riopreservdo se omportrí omo si estuviese pitdo (Wtson, 1995), unque ún no está lro si el espermtozoide mnifiest los mismos mbios de l pitión o ps diretmente l exoitosis del ontenido rosoml. En resumen, no obstnte del diluyente empledo, los proesos de riopreservión resultn en un disminuión de los porentjes de fertilidd si se ompr on semen freso. Se h demostrdo que esto surge de l ombinión de l pérdid de vibilidd y un deterioro de l funión en l poblión sobreviviente (Wtson, 2000). Cpitión espermáti Un vez que los espermtozoides hn sido eyuldos, neesitn llevr bo un serie de modifiiones durnte su tránsito por el trto genitl de l hembr, ntes de que sen pes de penetrr el ovoito. Estos mbios que preprn l espermtozoide pr l futur interión gméti y feundión son onoidos omo pitión (Austin, 1951; Chng, 1951). L regulión de l pitión in vivo es un funión del oviduto (Petrunkin et l., 2004), mientrs que in vitro es posible induirl en medios espeiles (Prrish et l., 1988; Brros, 1974; Mhi y Yngimhi, 1976; 1978; Hewitt y Englnd, 1998). 10

Dentro de estos mbios está l hipertivión, donde el espermtozoide pitdo mbirá el ptrón de movimiento flgelr pr que su movimiento se más tivo (Brros, 1974; Brros et l., 1993; Yngimhi, 1994). Este mbio en el ptrón de motilidd gener un myor mplitud y fuerz en el btir del flgelo. Se ree que esto es neesrio tnto pr que el espermtozoide logre liberrse de ls éluls ovidutles omo pr su pso trvés de ls éluls del úmulo, pudiendo sí lnzr l ZP (Hrrison, 1996; Kwkmi et l., 2001). L reión del rosom ourre en l erní o en ontto on ls ubierts ovoitris (Brros et l., 1993; 1996). Este proeso involur l fusión y fenestrión de l membrn rosómi extern y l membrn itoplsmáti (Brewis y Moore, 1997; Wssrmn et l., 2005), exepto en l porión que ubre l región posterior del rosom, es deir, el segmento eutoril (Brros y Austin, 1967), permitiendo l exposiión de enzims rosomles, omo l rosin, l ul prtiiprí en l penetrión del espermtozoide trvés de ls ubierts ovoitris (De los Reyes y Brros, 2000). El estdo rosoml, por lo tnto, debe onservrse intto ntes de l interión de los gmetos, lo que impli un mnejo espermátio in vitro que impid l reión premtur de los espermtozoides (Sirividypong et l., 2000). Se h visto que el tiempo de pitión es menor en los espermtozoides riopreservdos que en quellos fresos (Rot et l., 1999), por lo que se h espeuldo que los espermtozoides que hn sido sometidos bjs temperturs serín funionlmente diferentes (Fuller y Whittinghm, 1997). Esto podrí explir l reduión en el tiempo de vid fértil de los espermtozoides riopreservdos. Mhi y Yngimhi (1976), observron que el espermtozoide nino er pz de penetrr l zon pelúid solo siete hors o más luego de iniid l oinubión gméti, lo que sugiere que el espermtozoide debe estr pitdo ntes de penetrr l zon pelúid y que l pitión espermáti demor l menos 7 hors bjo ls ondiiones in vitro utilizds por dihos utores. En estudios posteriores utilizndo diferentes medios de 11

pitión espermáti, se observó l penetrión l zon pelúid de ovoitos ls 2 y 4 hors de oinubión gméti (Kwkmi et l., 1993; Ymd et l., 1993). Se hn desrrolldo vrios métodos pr evlur l pitión espermáti y estdo rosoml en el nino; entre ellos podemos enontrr ensyo on Clortetrilin (Hewitt y Englnd, 1998), Tinión Triple (Peñ et l., 1999), Letins Fluoresentes (Kwkmi et l., 1993) y sonds fluoresentes (De Los Reyes et l., 2002; 2004). Interión Gméti y Feundión En generl en los rnívoros el depósito de semen ourre nivel del trsfondo vginl (Linde-Forsberg et l., 1999). Desde este lugr los espermtozoides deben trvesr el érvix hi el lúmen uterino, psndo por diferentes brrers ntómis y fisiológis del trto genitl de l hembr. El muus ervil onstituye un brrer, seleionndo espermtozoides móviles y removiendo el omponente seminl que podrí inhibir l pitión (Brewis et l., 2001). Se h visto que los espermtozoides son lmendos en el trto reprodutivo de l hembr, on el propósito de esperr l ovulión y l mdurión de los ovoitos. En este lugr los espermtozoides onservn l motilidd y fertilidd gris l soiión de ellos on ls éluls del epitelio ovidutl y el efeto del fluido ovidutl (Kwkmi et l., 1998). Existen evidenis que los gliosminoglinos del fluido ovidutl y uterino de perrs en estro, fvoreerín l pitión de los espermtozoides de nino (Kwkmi et l., 2000). Los ovoitos de mmíferos están rodedos por dos ubierts: un más extern elulr, portd por ls del úmulo oóforo y otr, más intern elulr, l ZP (Hrrison, 1996; Wssrmn, 1999). Est últim se form durnte l ovogénesis y es un mtriz extrelulr ompuest por glioproteíns sulftds (Dunbr et l., 1994; Brros et l., 1996). Grn prte de l interión ovoito- espermtozoide ourre entre el espermtozoide y ls ps que roden el ovoito, siendo l soiión del espermtozoide on l ZP uno de los psos 12

más ruiles en l feundión de mmíferos (Brros et l., 1996; Myeno- Aguirre y Pérez Cortés, 1998; Peñ et l., 2004). Est ubiert puede ser dispersd medinte enzims del espermtozoide omo l rosin (Brros et l., 1996; Moreno y Brros, 2000; Moreno et l., 2002; Cortés et l., 2006). Existen dos tipos de ligndos en el espermtozoides: Los que están presentes en l membrn plsmáti del espermtozoide (ligndo primrios) y los que se enuentrn en el rosom y que quedrán expuestos luego de que l reión del rosom hy ourrido (Brros et l., 1996; De los Reyes y Brros, 2000). Luego de l reión rosómi, estimuld por l ZP, espeífimente l glioproteín ZP3, el espermtozoide se sepr del rosom y omienz trvesr l ZP. Se h sugerido que l digestión ontrold de ls glioproteíns de l ZP, omo ZP2 por prte de l rosin, permitirí l exposiión de oligosáridos presentes en l ZP, uy funión serí mntener l soiión estreh on l superfiie del espermtozoide (Brros et l., 1993; De los Reyes y Brros, 2000; Moreno et l., 2002). Un vez que el espermtozoide h trvesdo l zon pelúid, ruz el espio perivitelino y por l región eutoril de l membrn plsmáti del espermtozoide se fusion on l membrn plsmáti del ovoito, pr penetrr posteriormente l itoplsm ovulr (Yngimhi, 1994; Töpfer- Petersen et l., 2000) En ninos, los ovoitos son ovuldos en estdo de vesíul germintiv (VG), por lo tnto en estdo inmduro omo ovoitos primrios, difereni de lo que ourre en ls otrs espeies mmífers, donde el ovoito se ovul después de l primer división meióti, en l segund metfse (MII) (Mhi y Yngimhi, 1976; Ymd et l., 1993; Hewitt y Englnd, 1998b; 1999; Frstd, 2000; Sint-Dizier et l., 2001; Otoi et l., 2002; De los Reyes et l., 2005). En lguns espeies omo el hámster, se h observdo que el espermtozoide puede penetrr ovoitos en estdo inmduro, sin embrgo, no hbrí un posterior desrrollo del espermtozoide hst l deud tivión del ovoito (Brros y Muñoz, 1973). En perros se h determindo, en estudios previos in vitro, que el espermtozoide penetrrí ovoitos en estdo inmduro (Mhi y Yngimhi, 1976; Hewitt y Englnd, 1997; Ström- Holst et l., 2000), no obstnte, se desonoe si bjo ls 13

misms ondiiones experimentles hbrí diferenis en l penetrión de l zon pelúid y subseuente desrrollo entre ovoitos primrios (inmduros) o en MII (mduros). En est memori, se estudió l feundión en ninos trvés de l pidd de unión y tiempo de penetrión espermáti por ls ubierts de ovoitos, inmduros y mdurdos in vitro, on espermtozoides fresos y refrigerdos, lo que permitirá mejorr los protoolos de riopreservión espermáti, promoviendo l inseminión rtifiil, omo tmbién otrs biotenologís reprodutivs en est espeie. 14

HIPÓTESIS L pidd de trvesr l zon pelúid y penetrr l itoplsm ovulr no vrirá de uerdo l estdo de mdurión de los ovoitos, pero será diferente entre los espermtozoides fresos y refrigerdos, trduiéndose en distintos tiempos de penetrión en quellos espermtozoides riopreservdos respeto los espermtozoides fresos. OBJETIVO GENERAL Determinr posibles diferenis en l interión espermtozoide-ovoito en ninos, utilizndo semen freso y refrigerdo, on ovoitos inmduros y mdurdos in vitro. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Evlur los porentjes de penetrión espermáti l ZP de ovoitos de perr entre distintos tiempos de oinubión gméti, utilizndo espermtozoides eyuldos refrigerdos y fresos (ontroles) - Comprr el tiempo de penetrión espermáti l ZP de ovoitos de perrs, entre espermtozoides eyuldos fresos o sometidos refrigerión. -Determinr en ovoitos de perr, inmduros y mdurdos in vitro, posibles diferenis en l pidd de ser penetrdos por espermtozoides ninos, y se fresos o riopreservdos. 15

MATERIAL Y MÉTODOS El trbjo experimentl se relizó en el Lbortorio de Reproduión de l Fultd de Cienis Veterinris y Peuris de l Universidd de Chile. ) Obtenión de espermtozoides El semen se obtuvo trvés de estimulión digitl, utilizndo op reoletor de vidrio previmente entibid, 5 perros dultos de diferentes rzs, snos, perteneientes privdos. Se utilizó l 2 frión seminl, es deir, l frión espermáti, evlundo en form subjetiv l motilidd progresiv (MP), medinte mirosopí de ontrste de fses. L onentrión espermáti se midió utilizndo ámr de reuento elulr de Neubuer, utilizndo un diluión previ de 1:100, de uerdo ls ténis estbleids en el Lbortorio (De los Reyes et l., 2006). Se utilizron solo muestrs de semen uy MP fue myor 70%. El plsm seminl se retiró entrifugndo ls muestrs (324 G por 5 minutos), previmente diluids en buffer TRIS (Tris (hidroximetil)- minometno) (Rot et l., 1999). Los espermtozoides que fueron utilizdos omo fresos se resuspendieron en medio Fert TALP (Prrish et l., 1988), pr luego ser oinubdos on los ovoitos. Los espermtozoides que se sometieron refrigerión fueron resuspendidos en el diluyente, en onentrión de 2 x 10 8 espermtozoides/ml 16

L omposiión del diluyente de refrigerión se desribe en l Tbl 1: Tbl 1: Composiión del diluyente de refrigerión pr el semen nino. TRIS 250 mm Áido ítrio 88,5 mm Frutos 69,4 mm Yem de huevo 20% Benil peniilin 0,28 mm Sulfto Dihidroestreptomiin 0,068 Mm Ls muestrs diluids, dentro de tubos ónios (FALCON), se oloron en un vso preipitdo on gu tempertur mbiente (20 C), el que luego se llevó 4 C, lnzndo dih tempertur en proximdmente 60 minutos. Ls muestrs se mntuvieron 4 ºC por 24 hors. L motilidd espermáti se evluó en form subjetiv medinte mirosopio de ontrste de fses en ls diferentes etps del proedimiento. b) Obtenión y mdurión de ovoitos Los ovoitos se obtuvieron de ovrios de perrs sns ovrietomizds, provenientes de l Unidd de Slud Ambientl de l Muniiplidd de L Pintn. Los ovrios fueron trnsportdos l lbortorio 37 C, en un termo on soluión slin (NCl 0,9%), suplementd on 100 UI/ ml de Peniilin y 50 µg/ml de Estreptomiin (Sigm). En el Lbortorio se obtuvieron los ovoitos trvés de l merión de los ovrios on hojs de bisturí. Se seleionron los ovoitos de mejor lidd, es deir, quellos de myor tmño, on el itoplsm osuro y homogéneo y on l menos tres ps de éluls del úmulo (Hewitt y Englnd, 1997b). Los ovoitos que se mdurron en ultivo fueron proesdos de uerdo lo desrito en De los Reyes et l. (2005). El medio de ultivo utilizdo pr l mdurión de ovoitos fue TCM 199 (In vitrogen), suplementdo on 10% de suero fetl bovino (SFB), 10 UI/mL de hcg, 2,5 µl/ml de soluión piruvto (11,04 17

mg/ml de áido Pirúvio) y 5 µl/ml de soluión ntibióti (12,2 mg/ml de Peniilin y 20 mg/ml de Estreptomiin; Sigm). Los ovoitos que se oinubron on los espermtozoides en estdo inmduro, se mbientron en medio Fert TALP (Prrish et l, 1988) hst l oinubión. ) Coinubión Gméti Ls muestrs de semen que se mntuvieron refrigerds se inubron 38,5 ºC por 10 minutos. Posteriormente, el diluyente fue extrído medinte entrifugión, 112 G por 3 minutos tempertur mbiente y el sedimento espermátio fue resuspendido en medio Fert TALP (Prrish et l., 1988). Los ovoitos, mdurdos o inmduros, fueron oinubdos seprdmente on los espermtozoides fresos o refrigerdos, en un onentrión de 5 x 10 6 espermtozoides/ml on 10 15 ovoitos en d got de 100 µl de medio Fert TALP (Prrish et l., 1988). L oinubión se relizó por diferentes tiempos desde 1 10 hors, en l estuf de ultivo Form Sientifi 38 C, 5 % CO 2 y 98% de humedd. d) Evluión de l feundión Ls muestrs se evluron d un hor hst ls 10 hors de oinubión. Luego de d periodo de oinubión, los ovoitos fueron removidos desde ls gots y se extrjeron ls éluls del úmulo trvés de pipeteo fino. Los ovoitos desprovistos de éluls del úmulo fueron montdos en un portobjeto y fijdos medinte un soluión en bse áido étio, metnol y loroformo (3:6:2) por tres min. y posteriormente en áido étio y metnol (1:3) por 72 hors (Otoi et l., 2000) 4 C. Finlmente, ls muestrs fueron teñids on 0,1% de Yoduro de Propidio pr su posterior evluión. L penetrión espermáti se evluó medinte mirosopio de epifluoreseni (Nikon Optiphot 2). Se onsiderron penetrdos quellos ovoitos que tuviern uno o más espermtozoides, y se penetrndo l ZP, en PV o en el C. 18

e) Análisis estdístio Se relizron diferentes experimentos en orden de obtener proximdmente 80 ovoitos pr d evluión (ovoitos inmduros y mdurdos in vitro), pr d tiempo de oinubión (1 10 hors, d 1 hor) y pr d tipo de espermtozoides (fresos y refrigerdos). Se utilizó nálisis de vrinz pr l omprión de ls diferentes rterístis evluds (penetrión espermáti de los distintos tipos de espermtozoides en los diferentes tiempos evludos on ovoitos inmduros y mdurdos in vitro) y l prueb de Tukey pr ls eventules diferenis entre ls medis. Los resultdos expresdos en porentjes, fueron trnsformdos (rosen %). Se utilizó un nivel de signifini de p 0,05. El modelo estdístio utilizdo fue: Y ijk = µ + δ i + H j + T k + δh ij + δt ik + δht ijk + ε ijk Donde: Y ijk = Vrible estudir (Porentje de penetrión espermáti) µ= Medi poblionl δ i = Espermtozoide (freso y refrigerdo) H j = Ovoito (inmduro y mdurdo) T k = Tiempo (1 10 hors) δh ij = Interión semen- ovoito δt ik = Interión semen -tiempo δht ijk = Interión semen-ovoito- tiempo ε ijk = Error 19

Además, se relizó un modelo de regresión logísti, el ul permitió estimr si existín diferenis entre los distintos trtmientos trvés del tiempo, utilizndo SAS (Sttistil Anlysis System, SAS Institute, Cry, NC, USA). Ls diferenis on p 0,05 se onsiderron signifitivs. El modelo utilizdo fue: Y ij = β 0i + β 1i x 1j + εij Donde: Y ij = Porentje de penetrión espermáti en el tiempo. β 0i = Interepto pr d trtmiento. β 1i = Coefiiente de regresión pr d trtmiento. x 1j = Tiempo de mediión. εij = Efeto residul. 20

RESULTADOS Se evluron un totl de 3.391 ovoitos (inmduros n= 1765 y mdurdos in vitro n= 1626), los que se oinubron on espermtozoides ninos refrigerdos y fresos. L evluión se relizó onsiderndo l penetrión espermáti nivel de l ZP y espio perivitelino, itoplsm ovulr y penetrión totl (ZP+ PV + itoplsm) (Figurs 1 y 2) Figur 1 Ovoito inmduro de perr insemindo in vitro on espermtozoides en itoplsm y trvesndo l ZP 21

Figur 2 Ovoito mdurdo in vitro de perr insemindo in vitro on espermtozoides en itoplsm y trvesndo l ZP 22

Penetrión espermáti en el tiempo A) SEMEN FRESCO En relión l oinubión utilizndo semen freso y ovoitos inmduros (tbl 1), l penetrión espermáti l ZP y PV, umentó signifitivmente prtir de ls 4 hors, mnteniéndose los myores porentjes hst ls 8 hors de oinubión (p< 0,05). A nivel del itoplsm ovulr, el porentje de ovoitos penetrdos umentó signifitivmente (p<0,05) prtir de ls 3 hors de oinubión, enontrándose los myores porentjes en los tiempos de ultivo más prolongdos. Considerndo el porentje de penetrión totl, umentó prtir de ls 3 hors de oinubión, obteniéndose ls 7 hors el máximo porentje de penetrión espermáti (P< 0,05). Tbl 1 Número y porentje de ovoitos inmduros on distintos grdos de penetrión espermáti en diferentes tiempos de oinubión gméti, utilizndo semen freso Hors Coinubión Nº ovoitos on esp. en ZP y PV / totl (%) Nº ovoitos on esp. en itop. / totl (%) Nº ovoitos on esp. penetrdos totles / totl ovoitos (%) 1 20 / 84 (23,81) 13/84 (15,48) 33/84 (39,29) 2 18 /86 (20,93) 10/86 (11,63) 28,86 (32,56) 3 26/93 (27,96) 23/93 (24,73)b 49/93 (52,69)b 4 34/88 (38,64)b 26/88 (29,55)b 60/88 (68,18) 5 29/93 (31,18) 36/93 (38,71) 65/93 (69,89) 6 47/120 (39,17)b 32/120 (26,67)b 79/120 (65,83) 7 27/67 (40,3)b 27/67 (40,3) 54/67 (80,60)d 8 38/93 (40,86)b 22/93 (23,66)b 60/93 (64,52) 9 24/80 (30,00) 23/80 (28,75)b 47/80 (58,75) 10 19/94 (20,21) 49/94 (52,13) 68/94 (72,34) Letrs distints indin difereni signifitiv dentro de olumns (p 0,05) 23

Al utilizr ovoitos mdurdos in vitro, on semen freso (tbl 2), l penetrión espermáti de l ZP y PV no difirió estdístimente entre ls 10 hors de o-inubión. L penetrión itoplsm ovulr umentó signifitivmente desde ls 2 hors de oinubión (p<0,05). Igul situión se observó on los porentjes de penetrión espermáti totl. Tbl 2 Número y porentje de ovoitos mdurdos in vitro on distintos grdos de penetrión espermáti en diferentes tiempos de oinubión gméti, utilizndo semen freso Hors Coinubión Nº ovoitos on esp. en ZP y PV / totl (%) Nº ovoitos on esp en itop. / totl (%) Nº ovoitos on esp penetrdos totles / totl ovoitos (%) 1 24/74 (32,43) 4/74 (5,41) 28/74 (37,84) 2 27/77 (35,06) 12/77 (15,58)b 39/77 (50,65)b 3 30/83 (36,14) 18/83 (21,69)b 48/83 (57,83)b 4 23/74 (31,08) 28/74 (37,84) 51/74 (68,92) 5 27/80 (33,75) 34/80 (42,50) 61/80 (76,25) 6 31/81 (38,27) 30/81 (37,04) 61/81 (75,31) 7 35/83 (42,17) 33/83 (39,76) 68/83 (81,93) 8 25/81 (30,86) 29/81 (35,8) 54/81 (66,67) 9 22/88 (25,00) 38/88 (43,18) 60/88 (68,18) 10 19/87 (21,84) 44/87 (50,57) 63/87 (72,41) Letrs distints indin difereni signifitiv dentro de olumns (p 0,05) 24

B) SEMEN REFRIGERADO Los espermtozoides refrigerdos y oinubdos on ovoitos inmduros (tbl 3), no mostrron diferenis en l penetrión espermáti nivel de l ZP y PV entre ls 10 hors de ultivo; sin embrgo, en l penetrión l itoplsm ovulr y en l penetrión totl, hubo un umento signifitivo (p<0,05) prtir de ls 5 hors de oinubión. Tbl 3 Número y porentje de ovoitos inmduros on distintos grdos de penetrión espermáti en diferentes tiempos de oinubión gméti, utilizndo semen refrigerdo Hors Coinubión Nº ovoitos on esp. en ZP y PV / totl (%) Nº ovoitos on esp. en itop. / totl (%) Nº ovoitos on esp. penetrdos totles / totl ovoitos (%) 1 20/83 (24,10) 8/83 (9,64) 28/83 (33,73) 2 22/96 (22,92) 7/96 (7,29) 29/96 (30,21) 3 15/77 (19,48) 6/77 (7,79) 21/77 (27,27) 4 27/101 (26,73) 12/101 (11,88) 39/101 (38,61) 5 19/86 (22,09) 22/86 (25,58)b 41,86 (47,67)b 6 26/82 (31,71) 20/82 (24,39)b 46/82 (56,1)b 7 23/83 (27,71) 19/83 (22,89)b 42/83 (50,6)b 8 18/89 (20,22) 15/89 (16,85) 33/89 (37,08) 9 21/83 (25,30) 17/83 (20,48)b 38/83 (45,78)b 10 21/87 (24,14) 21/87 (24,14)b 42/87 (48,28)b Letrs distints indin difereni signifitiv dentro de olumns (p 0,05) 25

L oinubión on ovoitos mdurdos in vitro mostró un umento signifitivo (p<0,05) en l penetrión l ZP y PV prtir de ls 2 hors, mnteniéndose reltivmente onstnte hst finles del ultivo (tbl 4). Los ovoitos on espermtozoides en su itoplsm, en mbio, umentron prtir de ls 3 hors, mnteniéndose el porentje de penetrión similr hst ls 10 hors (p<0,05). L penetrión espermáti totl umentó signifitivmente prtir de ls 2 hors (p<0,05), siendo los porentjes más ltos hi finles del ultivo (p<0,05). Tbl 4 Número y porentje de ovoitos mdurdos in vitro on distintos grdos de penetrión espermáti en diferentes tiempos de oinubión gméti, utilizndo semen refrigerdo Hors Coinubión Nº ovoitos on esp. en ZP y PV / totl (%) Nº ovoitos on esp. en itop. / totl (%) Nº ovoitos on esp. penetrdos totles / totl ovoitos (%) 1 31/103 (30,1) 14/103 (13,59) 45/103 (43,59) 2 8/51 (15,69)b 9/51 (17,65)b 17/51 (33,33)b 3 16/84 (19,05)b 17/84 (20,24)b 33/84 (39,29)b 4 22/85 (25/88)b 18/85 (21,18)b 40/85 (47,06) 5 31/82 (37,8) 17/82 (20,73)b 48/82 (58,54) 6 24/81 (29,63)b 24/81 (29,63)b 48/81 (59,26) 7 27/81 (33,33)b 28/81 (34,57) 55/81 (67,9)d 8 29/84 (34,52)b 26/84 (30,95)b 55/84 (65,48)d 9 30/86 (34,88)b 23/86 (26,74)b 54/86 (61,63)d 10 35/81 (43,21) 19/81 (23,46)b 54/81 (66,67)d Letrs distints indin difereni signifitiv dentro de olumns (p 0,05) 26

% de penetrión El porentje de ovoitos penetrdos, tnto inmduros (Gráfio 1) omo mdurdos in vitro (Gráfio 2) trvés de los periodos de oinubión (10 hors), utilizdo espermtozoides refrigerdos fue menor que l utilizr espermtozoides fresos (p< 0,05), on exepión de l primer hor en ovoitos mdurdos in vitro, donde se observó myor porentje utilizndo espermtozoides refrigerdos (p< 0,05). Gráfio 1 Comprión de los porentjes de penetrión espermáti totl entre espermtozoides fresos y refrigerdos utilizndo ovoitos inmduros 100 Esp. Fresos 80 60 40 b b b d b b b b Esp. Refrigerdos 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hor de oinubión 27

% de penetrión Gráfio 2 Comprión de los porentjes de penetrión espermáti entre espermtozoides fresos y refrigerdos utilizndo ovoitos mdurdos in vitro 100 Esp. Fresos 80 60 40 b b b b d d d d Esp. Refrigerdos 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hor de oinubión El porentje de ovoitos penetrdos, inmduros y mdurdos in vitro, tnto on semen freso (Gráfio 3) omo on semen refrigerdo (Gráfio 4) trvés de los diferentes períodos de oinubión, mostró un myor porentje de penetrión on ovoitos mdurdos vs. inmduros l utilizr espermtozoides refrigerdos (p 0,05), y l utilizr espermtozoides fresos, lguns hors de oinubión mostrron diferenis entre mbos tipos de ovoitos. L penetrión espermáti ovoitos inmduros y mdurdos in vitro mostró diferenis entre mbos tipos de ovoitos ls 2, 3, 5, 6 y 9 hors on espermtozoides fresos (Gráfio 3) y ls 2, 6 y 9 hors on espermtozoides refrigerdos (Gráfio 4) (p 0,05). 28

% de penetrión % de penetrión Gráfio 3 Comprión entre los porentjes de penetrión espermáti en ovoitos inmduros y mdurdos in vitro utilizndo espermtozoides fresos 100 ovoitos inmduros 80 60 40 b b b b b ovoitos mdurdos in vitro 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hor de oinubión Gráfio 4 Comprión entre los porentjes de penetrión espermáti en ovoitos inmduros y mdurdos in vitro utilizndo espermtozoides refrigerdos 100 ovoitos inmduros 80 60 40 b b b ovoitos mdurdos in vitro 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hor de oinubión 29

% de Penetrión Espermáti El nálisis del grdo de penetrión (ZP, PV, y C) trvés del tiempo, se evluó medinte regresión logísti. L penetrión espermáti ZP y PV on espermtozoides fresos se mntiene onstnte durnte el periodo de oinubión, sin embrgo on espermtozoides refrigerdos l penetrión ument en funión del tiempo. Además es posible observr diferenis (p 0,05) en l penetrión espermáti ZP y PV entre espermtozoides fresos y refrigerdos (Gráfio 5). A nivel itoplsmátio el tiempo de oinubión influyó positivmente (p 0,05) en mbos tipos de espermtozoides, sin embrgo no fue posible enontrr diferenis signifitivs entre estos (Gráfio 6). En relión l penetrión totl (Gráfio 7) solo fue posible observr un influeni (p 0,05) del tiempo de oinubión sobre los espermtozoides. Gráfio 5 Penetrión ZP y PV utilizndo espermtozoides fresos y refrigerdos 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fresos Refrigerdos y= 0,33 + 0,00001x y= 0,09 + 0,04x y= Hors 30

% de Penetrión Espermáti % de Penetrión Espermáti Gráfio 6 Penetrión itoplsm utilizndo espermtozoides fresos y refrigerdos 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hors Fresos Refrigerdos y= 0,09 + 0,04x y= 0,1 + 0,01x y= Gráfio 7 Penetrión totl utilizndo espermtozoides fresos y refrigerdos 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fresos Refrigerdos y= 0,43 + 0,04x y= 0,34 + 0,02x y= Hors 31

DISCUSIÓN Est memori de título evluó, medinte ensyos de feundión in vitro on ovoitos de perr inmduros y mdurdos in vitro, l pidd feundnte de espermtozoides ninos fresos y refrigerdos, demostrndo que los tiempos de penetrión trvés de ls ubierts ovoitris, vrín en mbs pobliones espermátis, omo tmbién de uerdo l estdo de mdurión de los ovoitos. L pidd feundnte de los espermtozoides h sido investigd trvés de diferentes estudios. Medinte l inseminión rtifiil, result más ostoso y lrgo, e influyen demás otros ftores omo el ilo, pidd fértil de l hembr y l téni de inseminión empled (Lrsson y Rodríguez-Mrtínez, 2000). Ls rterístis espermátis omo l motilidd, morfologí, esttus rosoml y vibilidd del espermtozoide, hn sido freuentemente utilizdos pr evlur indiretmente l fertilidd (Silv y Vergesten, 1995). Considerndo que l evluión del dño de l estruturs moleulres trvés de ests rterístis son sólo indiretos, l unión del espermtozoide l ZP y su pso trvés de ls ubierts ovoitris, los ules son eventos rítios en l interión gméti, representn un mejor y más diret evluión de l pidd feundnte del espermtozoide (Yngimhi, 1994). L pidd de unión del espermtozoide l ZP y l penetrión espermáti hn sido estudids in vitro en ninos por diferentes investigdores (Mhi y Yngimhi, 1976, 1978; Shimzu et l., 1992; Hewitt y Englnd, 1997; De los Reyes et l., 2006). Su utilizión h tenido omo objetivos: investigr el proeso de feundión (Mhi y Yngimhi, 1976, 1978; Hewitt y Englnd, 2001) omo indidor de fertilidd de diferentes mhos (Myeno- Aguirre y Peréz Cortés, 1998) y predeir el potenil feundnte de espermtozoides que hn sido sometidos métodos de preservión (Hy et l., 1997b; De los Reyes et l., 2006). L interión gméti es un proeso omplejo, que requiere l omplet funionlidd del espermtozoide pr el reonoimiento entre los gmetos, reión rosómi y 32

penetrión trvés de l ZP (De los Reyes y Brros, 2000). Entre los ensyos de interión gméti, el de unión l ZP mide l pidd de los espermtozoides de unirse est ubiert ovoitri, lo ul es medido por reeptores en l membrn plsmáti del espermtozoide y glioproteíns de l ZP (Yngimhi, 1994). L evluión de l funión espermáti utilizndo este método h sido demostrd in vitro en otrs espeies omo en verro (Ivnov y Mollov, 1995) y equino (Fzeli et l., 1993), y se h orreliondo positivmente on l fertilidd in vivo en el gndo bovino (Fzeli et l., 1997; Zhng et l., 1998). En ninos, su utilizión pr evlur el efeto de l refrigerión y ongelión, h demostrdo que ests disminuyen l pidd de unión l ZP en omprión espermtozoides fresos (Strõm- Holst et l., 2000). Lo nteriormente expuesto onuerd on los resultdos obtenidos en este estudio, donde l unión l ZP se vió fetd por l refrigerión. L menor pidd de unirse l ZP en espermtozoides que hn sido riopreservdos en omprión espermtozoides fresos, h sido observdo previmente en trbjos de ongelión (Ivnov et l., 1999), donde l oinubr durnte un hor, hbrí menor número de espermtozoides sometidos ongelión unidos ZP, en omprión los fresos. En est memori de título se observó lgo similr on l penetrión espermáti itoplsm ovulr, l que tmbién fue menor l utilizr espermtozoides refrigerdos en omprión on quellos fresos. Se h demostrdo que l myor disminuión en l pidd de los espermtozoides pr penetrr l ZP y itoplsm de los ovoitos, ourre durnte el proeso de ongelióndesongelión, más que durnte el proeso de diluión iniil y enfrimiento hst los 4 C, por lo que l refrigerión, si bien tiene un efeto detrimentl en l morfologí, vibilidd y pidd de trvesr ls ubierts ovoitris (Hy et l., 1997b; Rot et l., 1999) este serí menor que l ongelión. L menor pidd de unión ZP y penetrión itoplsm del espermtozoide refrigerdo respeto espermtozoides fresos puede deberse, tnto su menor periodo de sobreviveni, omo l disminuión de su pidd feundnte luego de l refrigerión (Rot et l., 1999), debido que el proesmiento puede lterr tnto l membrn plsmáti omo l rosoml del espermtozoide, uy potenil onseueni es l disminuión de l pidd de unión y penetrión del ovoito (Burgess et l., 2001, Nishizono et l., 2004). 33

.En espermtozoides ninos, no existen estudios previos en los ules se hy evludo l unión ZP y penetrión espermáti trvés del tiempo. En este trbjo se obtuvo penetrión espermáti ZP y itoplsm prtir de l primer hor de oinubión gméti, lo que es inditivo de espermtozoides pitdos. L penetrión ZP de espermtozoides fresos y refrigerdos, el tiempo de inubión inrementó los porentjes de penetrión. El umento del periodo de oinubión gméti hst ls 10 hors, mostró un relión diret on los porentjes de penetrión l itoplsm en mbos tipos de espermtozoides (fresos y refrigerdos) y ovoitos (inmduros y mdurdos in vitro), obteniéndose los myores porentjes entre l 6 y 7 hors de oinubión. Se h indido, en otros trbjos, que este tiempo serí el neesrio pr que un myor número de espermtozoides ompleten l pitión espermáti y lleven bo l reión rosómi pr penetrr ls ubierts ovoitris y lnzr el itoplsm ovulr (Mhi y Yngimhi, 1978; Kwkmi et l., 1993, 1998; Rot et l., 1999). Posterior este tiempo de máxim penetrión espermáti los porentjes no umentn, lo que podrí estr soido l pérdid progresiv de enzims rosomles desde el rosom, omo l rosin, l ul se h soido l unión seundri l ZP (Moreno et l., 2002) y su posterior penetrión (Yngimhi, 1994; De los Reyes y Brros, 2000), lo ul llevrí l disminuión de l pidd de penetrión trvés del tiempo. L disminuión en l penetrión se h visto en espermtozoides ninos luego de ser pitdos, estndo ún mótiles y vibles, perdiendo grdulmente su pidd de unión y penetrión del ovoito (Peñ et l., 2004). Tnto el porentje de penetrión l itoplsm omo l penetrión totl ovoitos mdurdos in vitro, fue superior en l primer hor de oinubión gméti, utilizndo espermtozoides refrigerdos, en omprión quellos en estdo freso, sugiriendo que los primeros neesitrín menor tiempo pr trvesr ls ubierts ovoitris y penetrr el itoplsm ovulr que los espermtozoides fresos. 34

L penetrión espermáti más temprn en espermtozoides riopreservdos trvés de ls ubierts ovoitris h sido demostrd en otrs espeies, omo en el humno (Critser et l., 1987), rt (Fuller y Whitinghm, 1997), verro (Wng et l., 1991) y tigre siberino (Byers et l., 1989). En estos trbjos se h evidenido que los espermtozoides sometidos tnto refrigerión omo ongelión, serín pes de penetrr los ovoitos en un tiempo orto luego del entibimiento, difereni del semen freso que neesit lguns hors de preinubión pr l pitión. Este heho podrí implir que los espermtozoides que hn sido sometidos preservión bjs temperturs experimentrín un menor tiempo pr l pitión. Se h visto en ninos, que espermtozoides ongeldos- desongeldos tienen myor dño de su estrutur rosoml y onseuente pérdid de rosin, que espermtozoides fresos (Cortés et l., 2006). En verros, l integridd rosoml de espermtozoides sometidos ongelióndesongelión, evlud on sond Lyso Trker, disminuye en más de 50% (De los Reyes et l., 2002). En espermtozoides sometidos preservión por frío, el menor tiempo en l pitión in vitro tmbién h sido estudid trvés del ensyo de Clortetrilin en diferentes espeies omo el rnero (Pérez et l., 1996), nino (Rot et l., 1999) y rt (Fuller y Wittinghm, 1997), identifiándose espermtozoides no pitdos, pitdos, y pitdos / reiondos. En estos trbjos h sido posible observr que luego de l riopreservión existirí un myor número de espermtozoides pitdos en omprión quellos fresos, onluyendo que los proesos de pitión se ven elerdos por l riopreservión. Aunque no existen estudios que evlún l penetrión espermáti en funión del tiempo de oinubión gméti, los porentjes de penetrión totl de espermtozoides fresos, obtenidos en este trbjo ls 10 hors de oinubión on mbos tipos de ovoitos, serín similres lo obtenido por Hy et l. (1997b) ls 18 hors de oinubión gméti (73%), y superiores lo reportdo por Hewitt y Englnd, (1997) ls 12 hors (52.2%). Ls diferenis en los porentjes de penetrión entre los diferentes estudios puede deberse ls distints metodologís y tiempos de oinubión utilizdos. Los porentjes de penetrión totl obtenidos en este trbjo, utilizndo espermtozoides refrigerdos en mbos tipos de ovoitos ls 6 hors de oinubión, son superiores los 35

obtenidos l mismo tiempo bjo protoolos similres, utilizndo espermtozoides ninos ongeldos/desongeldos (34%) (De los Reyes et l., 2006), lo que onfirmrí que l refrigerión es menos detrimentl sobre l pidd feundnte de los espermtozoides. Estudios de interión gméti hn utilizdo ovoitos inmduros, ZP onservds en sl (Hy et l., 1997), ZP ongelds (Strõm- Holst et l., 2000) y ovoitos mdurdos in vitro (De los Reyes et l., 2006) pr evlur l pidd feundnte de espermtozoides ninos fresos y riopreservdos. Los estudios on ovoitos en mbos estdos de mdurión hn indido que los espermtozoides ninos pueden penetrr ovoitos de perr independiente de su estdo de mdurión, por lo que se h plntedo que el estdo de mdurión del ovoito, evludo nulermente, no fetrí l penetrión espermáti (Mhi y Yngimhi, 1976; Hewitt y Englnd, 1997). De igul form se h demostrdo que ovoitos inmduros pueden ser penetrdos por espermtozoides fresos y riopreservdos (Strõm- Holst et l., 2000). Sin embrgo, en estos trbjos l oinubión gméti fue tiempo fijo, generlmente superior ls 12 hors, sin que existn estudios en los ules se hy evludo l pidd de unión y penetrión de ZP en diferentes tiempos de oinubión más temprnos, utilizndo mbos tipos de ovoitos prlelmente, omo lo relizdo en el presente trbjo. L evluión de l penetrión de los ovoitos y se inmduros o mdurdos in vitro en diferentes tiempos de oinubión gméti, mostró diferenis entre mbos tipos de ovoitos en todo el periodo de oinubión, siendo superiores estos porentjes l utilizr ovoitos mdurdos in vitro en omprión los inmduros. Esto podrí explirse por l inmdurez de l ZP de estos ovoitos, lo ul se h reliondo diferenis en l penetrión en otrs espeies (Bezrd et l., 1998), por lo que, l utilizión de ovoitos mdurdos in vitro pree ser más propido pr evlur feundión in vitro. Los resultdos presentdos en este estudio proporionn evidenis sobre l pidd feundnte de espermtozoides ninos sometidos refrigerión, en relión su unión y tiempo de penetrión trvés de ls ubierts de ovoitos homólogos. Los nteedentes portdos en este estudio sobre riopreservión e interión gméti, bre l posibilidd 36