ESTUDIO GENÉTICO DE PACIENTES CHILENOS CON CÁNCER DE COLON HEREDITARIO NO POLIPÓSICO (HNPCC) CAROLINA ALEJANDRA RÍOS DEL PRADO

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1 UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO ESTUDIO GENÉTICO DE PACIENTES CHILENOS CON CÁNCER DE COLON HEREDITARIO NO POLIPÓSICO (HNPCC) CAROLINA ALEJANDRA RÍOS DEL PRADO TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS Directora de Tesis: Prof. Dra. Lucía Cifuentes Ovalle 2012

2 UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO INFORME DE APROBACION TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Medicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por la candidata CAROLINA ALEJANDRA RÍOS DEL PRADO ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 1 de Diciembre de Prof. Dra. Lucía Cifuentes Ovalle Directora de Tesis Programa de Genética Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Chile COMISION INFORMANTE DE TESIS PROF. DR. JAIME CONTRERAS PROF. DR. JOSÉ LUIS SANTOS PROF. DR. CARLOS VALENZUELA PROF. DRA. LILIAN JARA Presidente Comisión de Examen II

3 Para Gonzalo Car ma vie, car mes joies Aujourd'hui, ça commence avec toi III

4 AGRADECIMIENTOS Si bien, hay muchas personas a las que debo agradecer por su apoyo y participación durante todo este tiempo, quisiera primero dar las gracias a mi directora de tesis, la doctora Lucía Cifuentes. Ella siempre me ha entregado su constante ayuda, consejos, respaldo, revisiones y comentarios. También a la profesora Mónica Acuña, por todas las oportunidades que me ha brindado durante mi estadía en el laboratorio de Epidemiología Genética. A los doctores Leonardo Espíndola, Mario Abedrapo, Claudio Muñoz, Ricardo Villalón, Yamile Corredoira, Laura Carreño, Laura Segovia y todos los pacientes que participaron en este estudio. Sin su desinteresada cooperación, esta tesis no habría sido posible. A Jorge Muñoz por su ayuda en la realización de las inmunohistoquímicas y las profesoras Cecilia Leyton e Isabel Castro por todo su apoyo en los pequeños y mil detalles que necesité y que ellas me facilitaron. Además, quisiera agradecer a la comisión informante de esta tesis, los doctores Lilian Jara, Carlos Valenzuela, José Luis Santos y Jaime Contreras, por los valiosos aportes realizados durante este tiempo, que han permitido mejorar la realización de este trabajo de tesis. A mis compañeros de laboratorio Dayhana, Eduardo y Roxana por su ayuda permanente y a todo el equipo de trabajo de Genytec. A Ale, Clau, Tania, Yohanna y todos mis amigos, por su cariño, amistad y todo lo que eso acarrea Gracias a todos! También quisiera darle las gracias a mis papás Hernán y Carmen, mi hermano Luis Hernán, mis sobrinos Luis Felipe y María Ignacia, por ser una de mis fuentes de inspiración cada vez que las cosas se veían difíciles; a todos mis tíos y mi nueva familia Thies Aresti que me han apoyado y ayudado durante este tiempo que llevo en Santiago. IV

5 A Gonzalo por todo su amor, paciencia y apoyo durante estos años. Sin él, nada tendría sentido. Finalmente, quisiera agradecer el apoyo de las instituciones Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, CONICYT y Genética y Tecnología Ltda. Esta tesis fue financiada por el proyecto FEBA 157 y Beca de Apoyo de Tesis Conicyt (AT ). V

6 ÍNDICE DE CONTENIDOS Sección Título Página 1. RESUMEN Summary 3 2. INTRODUCCIÓN Cáncer de Colon y Recto Progresión Carcinogénica en Colon y Recto Vía de Inestabilidad Cromosómica Vía de Inestabilidad de Microsatélites Sistema de Reparación de Bases Mal Apareadas MSH MLH Agregación Familiar de Cáncer de Colon y Recto Poliposis Adenomatosa Familiar Síndrome de Lynch Características Clínicas del Síndrome de Lynch Diagnóstico de Síndrome de Lynch Criterios Clínicos Inmunodetección de MSH2 y MLH Inestabilidad de Microsatélites (MSI) Detección de Mutaciones Estudios en Población Chilena HIPÓTESIS OBJETIVOS Objetivo General Objetivos Específicos PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS Pacientes Materiales Métodos Extracción de DNA genómico Extracción de DNA genómico de sangre Extracción de DNA genómico de tejido Extracción de DNA genómico de tejido colónico fijado en formalina e incluido en parafina Detección inmunológica de proteínas MLH1 y MSH2 en tejido tumoral Análisis de inestabilidad microsatelital (MSI) Detección de la mutación somática del gen BRAF c.1799 T>A Búsqueda de mutaciones en los genes MLH1 y MSH Análisis Estadísticos RESULTADOS Identificación de pacientes en riesgo de padecer Síndrome de Lynch Análisis de la expresión de las proteínas hmlh1 y hmsh2 en VI

7 tejido tumoral Inmunohistoquímica para MLH Inmunohistoquímica para MSH Análisis de Inestabilidad de Microsatélites Análisis de variables clínicas en pacientes con alteraciones en expresión de proteína o con inestabilidad de microsatélites Estudio de la mutación somática c.1799 T>A del gen BRAF Búsqueda de mutaciones en el los genes MSH2 y MLH DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA 82 ANEXOS 106 ÍNDICE DE FIGURAS Figura Título Página 1 Tasa de mortalidad general por cáncer de colon y recto en población chilena entre los años 1990 y Características de las dos principales vías de progresión neoplásica en el cáncer de colon y recto 8 3 El sistema MMR corrige errores post-replicativos a través de una serie de etapas 12 4 Diagrama de los genes hmsh2 y hmhl1 y sus respectivas proteínas 14 5 Distribución de casos de cáncer de colon y recto según etiología y MSI 16 6 Expresión de las proteínas MSH2 y MLH1, evaluada por inmunohistoquímica 51 7 Ausencia de expresión de la proteína MLH1 en tejido tumoral 52 8 Ausencia de expresión de la proteína MSH2 en tejido tumoral 54 9 Análisis de inestabilidad de microsatélites en un paciente con inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) Análisis de inestabilidad de microsatélites en un paciente con microsatélites estables (MSS) Análisis de la presencia de la mutación somática c.1799 T>A del gen BRAF realizada por secuenciación Resumen de la metodología utilizada y los resultados obtenidos Mutación heterocigota c.2131 C>T en el exón 13 del gen MSH Mutación homocigota c C>G en el intrón 1 del gen MSH Propuesta de protocolo para diagnóstico de Síndrome de Lynch en Chile 81 VII

8 ÍNDICE DE TABLAS Tabla Título Página I Proteínas que participan en el Sistema de Reparación de Bases Mal Apareadas en humanos 11 II Criterios de Ámsterdam I y Ámsterdam II (Amsterdam criteria).. 21 III Criterios de Bethesda (Bethesda Guidelines) 22 IV Partidores para análisis de inestabilidad microsatelital optimizados para amplificaciones a partir de DNA obtenido de tejido fijado en formalina V Partidores para análisis de la secuencia de los 19 exones del gen MLH1. 43 VI Partidores para análisis de la secuencia de los 16 exones del gen MSH2. 45 VII Criterios de reclutamiento y hospitales de procedencia de pacientes VIII Resultados análisis de expresión de las proteínas hmlh1 y hmsh2 mediante inmunohistoquímica 50 IX Resultados análisis de inestabilidad de microsatélites (MSI).. 56 X Número de pacientes con 0, 1, 2, 3 o 4 loci microsatelitales inestables según el número de microsatélites analizado. 57 XI Resultados de los análisis de expresión proteica e inestabilidad de microsatélites.. 61 XII Análisis de pacientes con y sin alteraciones en la expresión proteica y/o en la estabilidad de microsatélites según sus variables clínicas cualitativas 62 XIII Análisis de pacientes sospechosos de padecer Síndrome de Lynch versus aquellos que han sido descartados como tales según sus variables clínicas cualitativas. 68 VIII

9 1. RESUMEN Antecedentes: El cáncer colorrectal es la sexta causa de muerte por neoplasias malignas en Chile. Al menos 3% de estos casos son producto de un síndrome, llamado Síndrome de Lynch, causado por mutaciones germinales en genes del sistema de reparación de bases mal apareadas (MMR), principalmente MLH1 y MSH2. La detección de este síndrome se basa en la identificación de estas mutaciones, lo cual no es económicamente conveniente hacer para todos los pacientes de cáncer colorrectal. Por esto se han propuestos diversos protocolos para aumentar la eficiencia del diagnóstico de estos pacientes y así solo secuenciar aquellos que pueden presentar mutaciones con mayor probabilidad. Estos protocolos incluyen la selección de pacientes por criterios clínicos y la realización de pruebas moleculares fenotípicas, para determinar el funcionamiento del sistema MMR. Objetivo: Estudiar pacientes chilenos de cáncer de colon y recto no polipósico, que cumplan con los Criterios de Bethesda Revisados, sugerentes de HNPCC, para buscar las mutaciones causantes de este síndrome. Metodología: En esta tesis, se estudiaron 50 pacientes que cumplen con los Criterios de Bethesda Revisados. Se realizaron análisis de inestabilidad de microsatélites y de expresión proteica mediante inmunohistoquímica para las proteínas hmsh2 y hmlh1. A los pacientes seleccionados se les realizó un estudio de la presencia de una mutación somática en el gen BRAF, que permite discriminar entre las alteraciones estructurales y epigenéticas del gen MLH1. Finalmente, se analizaron 6 pacientes en búsqueda de mutaciones de los genes MSH2 y/o MLH1, mediante secuenciación de las regiones exónicas. Resultados: Solo 22,5% de los pacientes presentaron alteraciones en la expresión proteica de MLH1 y/o MSH2, mientras que 26,5% tuvieron inestabilidad de microsatélites alta. Finalmente, 16 (32%) pacientes presentaron alteraciones en uno de los dos exámenes o en ambos. Además estos pacientes presentaron preponderantemente cáncer de colon derecho. Se identificaron dos mutaciones, ya descritas, en el gen MSH2. Una de ellas corresponde a un polimorfismo abundante en pacientes con cáncer de colon y recto chilenos, que se ubica en el intrón 1 del gen. La otra mutación es c.2131 C>T en el exón 13. Esta es una mutación 1

10 patogénica que genera un codón de término prematuro, lo que elimina un dominio funcional de la proteína. Conclusión: Con estos resultados, y la experiencia adquirida durante el desarrollo de esta tesis, se propone un protocolo tentativo para ser utilizado en la búsqueda de mutaciones causantes de Síndrome de Lynch en población chilena. 2

11 1.2. Summary Background: Colorectal cancer is the sixth leading cause of death from malignant neoplasms in Chile. At least, 3% of these cases are the result of a syndrome, called Lynch syndrome, caused by germline mutations in genes of the mismatch repair system (MMR), mainly MLH1 and MSH2. The detection of this syndrome is based on the identification of these mutations, which is not economically desirable to do for all colorectal cancer patients. Therefore, various protocols have been proposed to increase the efficiency of diagnosis of these patients and so, sequence only those who most likely may have mutations. These protocols include the selection of patients based on clinical and molecular phenotypic testing, to determine the functioning of the MMR. Objective: To study Chilean patients with nonpolyposis colon and rectum cancer, who comply with the Revised Bethesda Guidelines, suggestive of HNPCC, and search for mutations causing this syndrome. Methodology: In this thesis, we studied 50 patients who meet the Revised Bethesda Guidelines. Microsatellite instability analysis and protein expression by immunohistochemistry for hmsh2 and hmlh1 proteins were performed. Selected patients underwent a study of the presence of a somatic mutation in the BRAF gene, which can discriminate between structural and epigenetic alterations of the MLH1 gene. Finally, 6 patients were analyzed for mutations in the genes MSH2 and/or MLH1, by sequencing exonic regions. Results: Only 22.5% of patients had alterations in the protein expression of MLH1 and/or MSH2, whereas 26.5% had high microsatellite instability. Finally, 16 (32%) patients had abnormalities in one of the two tests, or both. In addition, these patients had predominantly right colon cancer. Two mutations were identified in the MSH2 gene, which are already described. One of them corresponds to an abundant polymorphism in Chilean patients with cancer of the colon and rectum, located in intron 1 of the gene. The other mutation is c.2131 C> T in exon 13. This is a pathogenic mutation that generates a premature stop codon, which eliminates a functional domain of the protein. 3

12 Conclusion: With these results and the experience gained during the development of this thesis, we propose a tentative protocol to be used in the search for causative mutations for Lynch syndrome in Chilean population. 4

13 2. INTRODUCCIÓN El cáncer es un conjunto de enfermedades genéticas que surgen de la acumulación de alteraciones genéticas, heredadas o somáticamente adquiridas, que permiten la transformación de células normales a neoplásicas y su posterior progresión (Pearson y Van del Luijt, 1998). Este crecimiento es un proceso que involucra varias etapas y que se caracteriza por el potencial proliferativo ilimitado que poseen estas células, las que se vuelven autónomas respecto de las señales de crecimiento (Ej. Factores de crecimiento) e insensibles a las señales inhibitorias. Además, evaden la apoptosis, producen angiogénesis sostenida, invaden tejidos y generan metástasis (Hanahan y Weinberg, 2000; Blagosklonny, 2003). Una de las particularidades de estas células es la inestabilidad genética, la que permite la acumulación de mutaciones en genes de crecimiento y sobrevida celular. La variabilidad de estos genes le confieren ventajas adaptativas a las células tumorales por sobre las no tumorales (Blagosklonny, 2003) Cáncer de Colon y Recto El cáncer de colon y recto (CCR) es el modelo de carcinogénesis más estudiado y mejor comprendido, siendo uno de los mejores ejemplos del potencial de crecimiento de las células cancerígenas y de cómo se desarrolla la enfermedad (Fearon y Vogelstein, 1990; Kinzler y Vogelstein, 1996; Bodmer, 2006; Gryfe, 2009; Boland y Goel, 2010). A nivel mundial, más de 1,2 millones de personas desarrollan CCR anualmente, mientras que más de 600 mil mueren por esta causa en el mismo período de tiempo (de la Chapelle, 2004; Lynch et al., 2009ª; Jemal et al., 2011). El cáncer de colon y recto es uno de los tumores malignos más frecuentes en los países industrializados y el 50% de los pacientes de cáncer colorrectal muere durante los primeros cinco años (Weitz et al., 2005; Jemal et al., 2011). Si bien en los últimos años, en Estados Unidos, ha disminuido tanto la incidencia como la mortalidad por cáncer colorrectal, aún es el tercer cáncer más frecuente en ambos aspectos, con 140 mil diagnósticos nuevos y 50 mil muertes anuales. Esta disminución es atribuida a la detección 5

14 temprana y a la mejora en los tratamientos (de la Chapelle, 2004; Bosetti et al., 2005; Jemal et al., 2011; Siegel et al., 2011). En Chile, en el año 2009, 1267 personas fallecieron por tumores malignos de colon, lo que equivale a una tasa de 7,5/ habitantes, mientras que 427 fallecieron por tumores malignos de recto, equivalente a una tasa de 2,5/ habitantes (Figura 1) (DEIS, MINSAL 2011). El análisis de registros históricos muestra un aumento significativo de la tasa de mortalidad y los egresos hospitalarios por cáncer de colon en Chile entre principios de la década de los noventa y la primera mitad de la siguiente (Donoso et al., 2006; Hirsch et al., 2009) Progresión carcinogénica en colon y recto Se ha descrito ampliamente la necesidad de un variado número de alteraciones genéticas para la iniciación y progresión del cáncer (Vogelstein et al., 1988; Fearon y Vogelstein, 1990; Kinzler y Vogelstein, 1996). Esto ha llevado a proponer la existencia de inestabilidad genética en las etapas tempranas de la carcinogénesis, fenómeno conocido como fenotipo mutador, que llevaría a la acumulación de mutaciones y la aparición de tumores (Loeb, 1991; Gryfe, 2009). Estudios en cáncer de colon y recto han llevado a la identificación de dos vías principales para la progresión de adenoma a carcinoma: Una vía con inestabilidad cromosómica y otra con inestabilidad de microsatélites (Figura 2), ambas asociadas a la mayor parte de los casos de cáncer (Jass et al., 2002; Søreide et al., 2006; Gryfe, 2009; Boland y Goel, 2010) Vía de Inestabilidad Cromosómica La inestabilidad cromosómica (CIN, Chromosomal Instability) se define como el aumento en la tasa de pérdidas o ganancias de grandes porciones cromosómicas o cromosomas enteros en células cancerosas (Gryfe, 2009). En cáncer colorrectal, específicamente, se ha descrito la pérdida frecuente y temprana de algunos 6

15 Tasa/100 mil habitantes 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 Tasa de Mortalidad por Cáncer de Colon 2,0 1,0 Tasa de Mortalidad por Cáncer de Recto 0,0 Año Figura 1 Tasa de mortalidad general por cáncer de colon y recto en población chilena entre los años 1990 y Se presenta la tasa de mortalidad cruda (tasa por cien mil habitantes) de cáncer de colon (línea roja) y recto (línea azul) de los últimos 20 años. Se observa una tendencia ascendente, especialmente marcada en el cáncer de colon (Datos: Serie de Mortalidad por tumores malignos, Cáncer del Colon y del Recto, DEIS, MINSAL 2011). 7

16 Vía de Inestabilidad Cromosómica (CIN) Alteraciones genéticas a través de pérdidas y ganancias cromosómicas Deleción 1p Deleción 8p LOH 17p LOH 18q APC COX2 K-ras DCC/Smad4 p53 Mucosa Normal Adenoma temprano Adenoma Intermedio Adenoma Tardío Carcinoma Metástasis β-catenina Epigenética Bax TCF-4 IGF-IIR TGF-βRII MLH1 MSH2 MSH6 Hipermetilación CIMP Vía de Inestabilidad Microsatelital (MSI) Alteraciones genéticas a través de proteínas defectuosas del sistema de reparación de bases mal apareadas Figura 2 Características de las dos principales vías de progresión neoplásica en el cáncer de colon y recto. La vía de inestabilidad cromosómica se caracteriza por la pérdida de regiones cromosómicas específicas, producidas por mutaciones puntuales en los genes APC, K-ras y otros. La vía de inestabilidad de microsatélites ocurre por la inactivación de genes del sistema MMR. Esta vía se caracteriza por la presencia de mutaciones puntuales en genes específicos como Bax y otros. CIMP: Fenotipo metilador de islas CpG (CpG Island Methylator Phenotype) (Adaptado de Søreide et al., 2006). 8

17 segmentos de cromosomas, como los brazos 5q, 17p y 18q (Vogelstein et al., 1988; Fearon y Vogelstein, 1990; Gryfe, 2009). Además, involucra mutaciones puntuales en diversos genes de control de ciclo celular, oncogenes y genes supresores de tumores, como APC, K-ras y p53, entre otros (Figura 2). Estudios más recientes sugieren que estas mutaciones no surgirían siempre en el mismo orden, originando distintas combinaciones que se asociarían a aberraciones cromosómicas y presentaciones clínicas específicas (Kinzler y Vogelstein, 1996; Smith et al., 2002; Leslie et al., 2003; Søreide et al., 2006; Boland y Goel, 2010). El cáncer de colon y recto con CIN corresponde al 85% de los casos (Søreide et al., 2006; Søreide, 2007) Vía de Inestabilidad de Microsatélites Los microsatélites son secuencias cortas de DNA, de entre uno y seis pares de bases, que se repiten en tándem entre 10 y 100 veces, pueden ser codificantes o no codificantes y se encuentran ampliamente distribuidas en el genoma (Vilar y Gruber, 2010). Su estructura repetitiva los hace propensos a deslizamientos de la polimerasa durante la replicación, lo que induce fácilmente a errores de apareamiento y la aparición de pequeños bucles, que cuando no son reparados generan ganancia o pérdida en el número de repeticiones, lo que lleva a la aparición de nuevos alelos. Este evento se conoce como inestabilidad de microsatélites (MSI, Microsatellite Instability) y da el nombre a esta vía de progresión a carcinoma (Liu et al., 1996; Søreide et al., 2006; Boland et al., 2008), que da cuenta del 15% de los casos de cáncer de colon y recto (Kinzler y Vogelstein, 1996; Aaltonen et al., 1998; Hampel et al., 2005). La inestabilidad de microsatélites involucra mutaciones, tanto somáticas como germinales, e inactivación epigenética de los genes del sistema de reparación de errores de la replicación (MMR, Mismatch Repair System) (Figura 2). Este sistema consiste en varias proteínas que actúan de manera concertada para detectar y reparar errores que ocurren durante la replicación del DNA en la fase S del ciclo celular. Cuando esta maquinaria se encuentra alterada, aumenta la tasa de mutaciones por corrimiento del marco de lectura y sustituciones de bases (Boland et al., 2008). Estos errores se hacen más evidentes en las secuencias microsatelitales. 9

18 2.3. Sistema de reparación de bases mal apareadas (MMR). En el ciclo celular, para la transición desde fase S a mitosis a través de G2 se requiere de la reparación de los errores ocurridos durante la replicación. Sin este proceso, el ciclo celular no puede proseguir (Boland et al., 2008). Los errores postreplicativos más frecuentes son los apareamientos erróneos de bases y la formación de pequeños bucles, que en una célula funcionalmente normal son corregidos por el sistema MMR. Este sistema está altamente conservado desde bacterias hasta humanos (Kunkel y Erie, 2005; Vilar y Gruber, 2010) y en estos últimos se han identificado más de diez proteínas participantes (Tabla I) (Kolodner y Marsischky, 1999; Kunkel y Erie, 2005; Plotz et al., 2006). El sistema MMR es homólogo al sistema de reparación MutHLS de procariontes y actúa de manera similar. En general, cuando se detecta un apareamiento erróneo, se forman heterodímeros de homólogos de las proteínas MutS y MutL. El heterodímero MutS reconoce los errores post-replicativos. MutL reconoce a MutS e interactúa con el factor de replicación C, que reclutan a Exonucleasa I y PCNA (Proliferating-Cell-Nuclear Antigen) que escinden las bases mal apareadas. Finalmente, DNA polimerasa δ y DNA ligasa re-sintetizan y ligan la hebra de DNA, respectivamente (Figura 3) (Plotz et al., 2006; Vilar y Gruber, 2010). Dentro de los homólogos de MutS y MutL, se destacan los productos génicos MSH2 y MLH1, que son factores de participación obligatoria en el sistema MMR humano. Estos funcionan como adaptadores generales y participan en la formación de todos los heterodímeros de reparación. Por esta razón, las mutaciones que afectan a estos genes llevan, frecuentemente, a la inactivación del sistema de reparación, lo que puede llevar al desarrollo de cáncer (Plotz et al., 2006) MSH2 El gen MSH2 (OMIM ) es homólogo al gen MutS procarionte. En humanos, este gen se localiza en la región 2p22-p21 (Peltomäki et al., 1993; Fishel et al., 1993; Leach et al., 1993). Posee pares de bases (pb) y 16 exones con 10

19 Proteína MSH2-MSH6 (MutSα) MSH2-MSH3 (MutSβ) MLH1-PMS2 (ypms1) (MutLα) MLH1-MLH2 (hpms1) (MutLβ) MLH1-MLH3 (MutLγ ) PCNA Complejo FRC EXOI (Rth1) 3 exo de Pol δ 3 exo de Pol ε DNA pol δ Función Repara apareamientos erróneos base-base y los IDL de 1 2 bases. Repara algunos IDL de una base e IDLs 2 bases. Parcialmente redundante con Msh2-Msh6. Adaptador que coordina los eventos desde la unión de MutS al apareamiento erróneo hasta síntesis del DNA reparado. Se desconoce la función de este heterodímero en humanos. Suprime la mutagénesis de algunos IDLs Participa en meiosis Interactúa con homólogos MutS y MutL. Recluta proteínas MMR a las bases mal apareadas. Aumenta la unión específica de Msh2-Msh6 a las bases mal apareadas. Participa en escisión y probablemente en señalización. Participa en síntesis DNA en reparación. Carga PCNA, modula la polaridad de la escisión. Escisión de dsdna Escisión de ssdna. Re-sintetiza de forma precisa el DNA. RPA Participa en la escisión y síntesis del DNA. DNA ligasa Sella las mellas después que se completa la síntesis del DNA. Tabla I Proteínas que participan en el Sistema de Reparación de Bases Mal Apareadas en humanos. Se describen las distintas proteínas y complejos proteicos (indicados por paréntesis) que participan en reparación en humanos y sus respectivas funciones. IDL, bucle de inserción-deleción; dsdna, DNA doble hebra; PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen; FRC, factor de replicación C; ssdna, DNA de hebra simple; RPA: proteína de unión a DNA de hebra simple (Adaptado de Kunkel y Erie, 2005). 11

20 A B C Figura 3 El sistema MMR corrige errores post-replicativos a través de una serie de etapas. A. El complejo MutSα (MSH2-MSH6) reconoce la base mal apareada (G-T), introducida por la DNA polimerasa, y forma una abrazadera alrededor del DNA capaz de deslizarse. MHS2 hidroliza ATP y MutSα se aleja de la base mal apareada cuando el complejo MutLα (MLH1-PMS2) se le une. Este adaptador recorre la hebra de DNA hasta que encuentra a la DNA polimerasa. B. El proceso descrito en A puede presentar modificaciones, ya que MutSα sólo reconoce bases mal apareadas y pequeños bucles, mientras que el complejo MutSβ (MSH2-MSH3) reconoce bucles de mayor tamaño (panel izquierdo). MLH1 puede dimerizar con PMS2, PMS1 o MLH3 (panel derecho), pero MutSβ interactúa preferentemente con el dímero MLH1-MLH3 (complejo MutLγ). C. Cualquiera sean los dímeros de reconocimiento (A y B), todos interactúan con exonucleasa-1, PCNA y DNA polimerasa, para escindir las bases mal apareadas y resintetizar la hebra, corrigiendo el error (Modificado de Boland y Goel, 2010). 12

21 longitudes entre los 98 y 279 pb, totalizando pb codificantes (Figura 4A) (Kolodner et al., 1994; Domingo y Schwartz, 2005 a ). Se han descrito 938 variantes del tipo sustituciones, deleciones, duplicaciones, inserciones, inserciones/deleciones e inversiones. Estas mutaciones se distribuyen a lo largo de todo el gen, afectando tanto a exones como intrones (Colon Cancer Gene Variant Databases, 2010). La proteína MSH2 humana (Figura 4B) tiene un peso molecular de 104,7 kda (934 aminoácidos). Su función es el reconocimiento de bases mal apareadas por cambio de base o inserción-deleción de bucles de hasta 10 o 12 bases. Para esto, MSH2 es miembro obligatorio en la formación de heterodímeros con otros homólogos de MutS, y es el responsable de conferir especificidad al reconocimiento: con MSH6 forma el complejo MutSα, que se une a bases únicas mal apareadas, y con MSH3 forma MutSβ, que se une preferentemente a bucles pequeños (Tabla I, Figura 3) (Jiricny y Nyström-Lahti, 2000; Kolodner y Marsischky, 1999; Domingo y Schwartz, 2005a; Plotz et al., 2006; Boland et al., 2008). Además, posee un sitio de unión a ATP con actividad ATPasa. La unión e hidrólisis de ATP en este sitio está relacionado con la unión de MutS a las bases mal apareadas y el reclutamiento de las proteínas necesarias para llevar a cabo la reparación (Bellacosa, 2001; Plotz et al., 2006; Boland et al., 2008) MLH1 El gen MLH1 (OMIM ) es homólogo al gen MutL procarionte, que también pertenece al sistema MutHLS. En humanos, este gen se localiza en el brazo corto del cromosoma 3 (3p21.3) (Lindblom et al., 1993; Nyström-Lahti et al., 1994; Papadopoulos et al., 1994). Tiene una longitud de pb con 19 exones (tamaños entre 43 y 371 pb) que totalizan pb codificantes (Figura 4C) (Kolodner et al., 1995; Han et al., 1995). En este gen se han descrito mutaciones, que incluyen sustituciones, deleciones, duplicaciones, inserciones e inserciones/deleciones, que se distribuyen homogéneamente en todo el gen, y afectan exones e intrones. No se han descrito inversiones (Colon Cancer Gene Variant Databases, 2010). 13

22 A ATG STOP B N Dominio de unión a DNA Dominio de Interacción MSH3/ MSH Dominio de Interacción con homólogos de MutL C C ATG STOP D N Dominio ATPasa Dominio de Interacción con homólogos MutS Dominio de Interacción con PMS2/MLH3/PMS1 C Figura 4 Diagrama de los genes hmsh2 y hmhl1 y sus respectivas proteínas. A. Gen MSH2. B. Proteína MSH2. C. Gen MLH1. D. Proteína MLH1. Los exones se representan con cajas a escala, las zonas transcritas están en celeste (MSH2) y azul (MLH1), mientras que las no transcritas en amarillo. Se indica el número del exón y el tamaño (en pares de bases) sobre y bajo cada caja, respectivamente. Los intrones están representados por triángulos (no a escala) y se indica el tamaño de cada uno en pares de bases. Las flechas indican los codones de inicio (ATG) y de término de la traducción (STOP). Los diagramas de las proteínas están a escala. Los números en las cajas representan el exón desde el cual se traduce cada segmento y las cajas internas representan los distintos dominios proteicos; C: Carboxilo terminal; N: Amino terminal (Adaptado de Domingo y Schwartz, 2005ª, b ). 14

23 Su producto proteico tiene un tamaño de 84,6 kda (756 aminoácidos), en el cual se reconocen dos dominios funcionales conservados que se conectan por una región larga y flexible (Figura 4D). El dominio amino terminal posee actividad ATPasa, mientras que el carboxilo terminal permite la dimerización. MLH1 es miembro obligatorio en la formación de dímeros con PMS2, PMS1 o MLH3 para formar los complejos MutLα, MutLβ o MutLγ, respectivamente (Tabla I, Figura 3). Estos complejos tienen actividad de endonucleasa dependiente de ATP y funcionan como adaptadores, ya que interactúan con los dímeros MutS, que se encuentran unidos a las bases mal apareadas y ensambla los factores necesarios para corregir el apareamiento erróneo (Kolodner y Marsischky, 1999; Bellacosa, 2001; Domingo y Schwartz, 2005 b ; Plotz et al., 2006; Boland et al., 2008) Agregación Familiar de Cáncer de Colon y Recto Etiológicamente, la mayor parte de los casos de CCR son esporádicos, es decir se desarrollan por mutaciones somáticas adquiridas al azar. Menos del 15% de los pacientes presentan casos con agregación familiar, donde se observa una mayor frecuencia del cáncer en un grupo familiar, pero sin un patrón de herencia claro, y que podría estar explicado por causas ambientales comunes a la familia o por la presencia de genes de baja penetrancia. Solo en un 5 a 10% de los casos se observa un patrón de herencia mendeliana (Figura 5) (Lynch y de la Chapelle, 2003; de la Chapelle, 2004; Søreide, 2007). En esta categoría se han descrito varios síndromes, de los cuales destacan la Poliposis Adenomatosa Familiar y el Síndrome de Lynch, que es el foco de esta tesis Poliposis Adenomatosa Familiar La Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) tiene un patrón de herencia autosómico dominante y se produce por mutaciones germinales en el gen APC (5q21) (Kinzler et al., 1991), siendo este síndrome un ejemplo clásico de carcinogénesis por la vía CIN. Clínicamente, se caracteriza por la presencia de 15

24 Esporádico 10-20% MSI?% MSI Familiar otros HNPCC 0% MSI >90% MSI Figura 5 Distribución de casos de cáncer de colon y recto según etiología y MSI. Del total de casos de cáncer de colon y recto, entre el 70 y 75% son esporádicos, de los cuáles, de 10 a 20% presentan inestabilidad de microsatélites. De 10 al 15% de los casos presentan agregación familiar y menos del 10% presentan patrones de herencia mendelianos claros. El síndrome de Lynch o HNPCC da cuenta de la mitad de estos casos y se asocia fuertemente a MSI. Otros incluye los síndromes Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) y otros síndromes menos frecuentes (Adaptado de Søreide, 2007). 16

25 cientos a miles de adenomas en el colon y recto de los pacientes, que aparecen en la adolescencia. Si la condición no es tratada, uno o más de esos pólipos se transformarán en adenocarcinoma, por ende, la penetrancia de este síndrome en cercana al 100%. La incidencia de PAF se estima en 1/7.000 a 1/ en la población general, mientras que menos del 1% de los pacientes de CCR presentan esta enfermedad. El diagnóstico de este síndrome es clínicamente evidente, por lo que muchas veces no es necesario realizar análisis genéticos (Lynch y de la Chapelle, 2003; de la Chapelle, 2004) Síndrome de Lynch El Síndrome de Lynch o Cáncer de Colon Hereditario No Polipósico (HNPCC, Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer) fue descrito clínicamente por primera vez en el año 1913 por A.S. Warthin. En los años sesenta, H.T. Lynch describió dos familias extensas con este síndrome, que hoy en día lleva su nombre, y planteó la hipótesis de la existencia de factores genéticos como su causa (Peltomäki, 2001; Lynch y Lynch, 2002; Drescher et al., 2010). Este síndrome corresponde al cáncer colorrectal hereditario más frecuente (Lynch et al., 2009 b ). Su origen es la presencia de mutaciones germinales en los genes del sistema de reparación de bases mal apareadas e implica a la vía MSI de progresión a carcinoma (Søreide et al., 2006; Søreide, 2007). Si bien se han identificado más de diez genes pertenecientes al sistema de reparación de bases mal apareadas, solo cuatro de ellos se han relacionado directamente con el Síndrome de Lynch: MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. Las mutaciones en tres de estos genes, MLH1, MSH2 y MSH6, dan cuenta del 95% de los casos de síndrome de Lynch y de ellos, los más estudiados son MSH2 y MLH1, que implican más del 90% de los casos (Peltomäki, 2001; Peltomäki, 2005; Vilar y Gruber, 2010). Se hereda de manera autosómica dominante con una penetrancia cercana al 80%, lo que lleva a que en las familias afectadas, el síndrome se presente en todas las generaciones y que alrededor del 50% de sus miembros desarrollen cáncer (Lynch y de la Chapelle, 2003; Vasen, 2005; Alonso et al., 2006; Boland et al., 2008). 17

26 Da cuenta de aproximadamente 3% de los casos de CCR, mientras que su incidencia se estima entre 1/1000 y 1/2000 en la población general (Aaltonen et al., 1998; Grady, 2003; Umar et al., 2004 a ; Hampel et al., 2008; Lynch et al., 2009ª) Características clínicas del Síndrome de Lynch Además de la alta incidencia de cáncer de colon y recto, especialmente de colon derecho, este síndrome se caracteriza por la presencia de cáncer de endometrio (segundo en frecuencia), ovario, estómago, intestino delgado, páncreas, tracto hepatobiliar, cerebro, tracto uroepitelial superior, adenomas y carcinomas sebáceos y queratoacantomas, que se desarrollan a edades tempranas (Grady, 2003; Lynch y de la Chapelle, 2003; Vasen, 2005; Thomas et al., 2009). Otro rasgo distintivo es la ocurrencia de múltiples tumores sincrónicos (múltiples cánceres al momento de la cirugía y/o hasta 6 meses después de ésta) y metacrónicos (cánceres que aparecen más de 6 meses después de la cirugía) (Lynch y de la Chapelle, 2003; Alonso et al., 2006). En el HNPCC, los adenocarcinomas de colon se presentan principalmente en el colon derecho, son pobremente diferenciados y mucinosos con células en anillo de sello. Presentan una reacción similar a la observada en la Enfermedad de Crohn (presencia de nódulos linfáticos, incluyendo centros germinales, localizados en la periferia o infiltrando el carcinoma) y linfocitos infiltrantes en el tumor (Grady, 2003; Alonso et al., 2006; Thomas et al., 2009). Además, la progresión neoplásica, de adenoma a adenocarcinoma, es acelerada: se produce en dos a tres años, en contraposición a los ocho a diez que toma el proceso en los casos de cáncer no Lynch (Lynch y de la Chapelle, 2003; Alonso et al., 2006). Los tumores presentes en el síndrome de Lynch son diploides y rara vez muestran alteraciones cromosómicas (Lynch y de la Chapelle, 2003, Søreide et al., 2006). Sin embargo, estos tumores presentan las alteraciones en el DNA a nivel de microsatélites, descritas en la sección 3.2.2, las cuales se han observado en todo el genoma y se deben a errores en la replicación no corregidos (Aaltonen et al., 1993; Thibodeau et al., 1993). Estos 18

27 errores también se han observado en alrededor de 15% de los tumores esporádicos (Figura 5) (Aaltonen et al., 1993; Søreide, 2007; Vila y Gruber, 2010). Estos hallazgos clínicos solo sugieren la existencia de HNPCC, pero no son probatorios ya que existe un porcentaje importante de tumores esporádicos que presentan características similares (Søreide et al., 2006; Søreide, 2007). Es por esto que los hallazgos moleculares son los únicos que pueden establecer si los casos corresponden realmente a Síndrome de Lynch (Lynch y Lynch, 2002; Lynch y de la Chapelle, 2003). De ahí la importancia de estudiar este síndrome desde el punto de vista molecular Diagnóstico del Síndrome de Lynch La identificación del mecanismo causante del síndrome de Lynch permitió definir a nivel molecular este síndrome y generar una forma de diagnóstico más precisa, que involucra la detección de las mutaciones germinales causantes de la inactivación de MMR (Ionov et al., 1993; Hemminki et al., 1994; Papadopoulos et al., 1994; Liu et al., 1996). Por lo tanto, la identificación de portadores de mutaciones en estos genes se ha convertido en un punto crítico en el diagnóstico de este síndrome (Piñol et al., 2005). La identificación de portadores de mutaciones que causan Síndrome de Lynch tiene una gran relevancia para los pacientes y sus familiares cercanos, ya sea a nivel de prevención o tratamiento del cáncer. En todos los portadores de mutaciones se puede evitar la aparición de cáncer colorrectal, realizando controles colonoscópicos sistematizados, que permiten identificar y remover lesiones pretumorales. También se puede prevenir la aparición de cáncer en sitios asociados a este síndrome, utilizando exámenes médicos adecuados para cada órgano posiblemente afectado (Lynch y Lynch, 2004; Mecklin y Järvinen, 2005). Además, en los pacientes portadores permite tomar decisiones terapéuticas, como el tipo de cirugía colorrectal a la que serán sometidos (Lynch y Lynch. 2004). La mejor forma de identificar mutaciones es mediante la secuenciación completa de genes, pero esto tiene un alto costo, por lo que se han propuesto 19

28 distintas estrategias para aumentar la sensibilidad y disminuir el costo de la identificación de pacientes con síndrome de Lynch (Debniak et al., 2000; Baudhuin et al., 2005; Southey et al., 2005; Engel et al., 2006). Estas estrategias incluyen los siguientes aspectos: Criterios Clínicos Recién en el año 1991 se logró unificar los criterios clínicos para la identificación del HNPCC, llamados criterios de Ámsterdam (Vasen et al., 1991). Estos criterios se basaron principalmente en la historia familiar de cáncer de colon y la edad de diagnóstico (Tabla II) (Vasen et al., 1991). Estos criterios no consideraron la presencia de tumores extra-colónicos, por lo que en el año 1999 se generaron nuevos criterios clínicos, conocidos como criterios de Ámsterdam II, que incluyeron este aspecto y excluyeron los casos de PAF (Tabla II) (Vasen et al., 1999). Estos criterios permiten clasificar las familias como portadoras de HNPCC, pero tienen una sensibilidad limitada y no permiten tomar decisiones sobre qué pacientes debieran realizarse un análisis genético (Umar et al., 2004 a ). En el año 1996 se realizó un taller de trabajo sobre Síndrome de Lynch, donde se generaron una serie de recomendaciones, los criterios de Bethesda (Tabla III), para identificar tumores que debieran ser analizados en busca de inestabilidad de microsatélites y mutaciones (Rodríguez-Bigas et al., 1997). Estos criterios contemplaron la historia familiar, como se presenta en los criterios de Ámsterdam, pero también incluyeron características de aparición frecuente en los casos de HNPCC (Rodríguez-Bigas et al., 1997). En el año 2004 estos criterios fueron revisados y modificados para mejorar la identificación de familias con HNPCC que requieren análisis genético (Tabla III) (Umar et al., 2004 b ), constituyendo una aproximación útil y altamente efectiva para lograr este objetivo (Piñol et al., 2005; Rodríguez-Moranta et al., 2006). Las distintas modificaciones que se han realizado a los criterios han servido para aumentar su sensibilidad, pero como consecuencia, su especificidad ha disminuido. Por lo anterior, se recomienda utilizar un segundo nivel de selección, basado en un análisis de la funcionalidad del sistema MMR (Baudhuin 20

29 Criterios de Ámsterdam I (criterios clásicos) Criterios de Ámsterdam II Debe haber al menos tres familiares con cáncer colorrectal. Todos los siguientes criterios deben estar presentes: Un paciente afectado debe ser pariente en primer grado de los otros dos. Al menos dos generaciones sucesivas deben estar afectadas. Al menos un CCR debe ser diagnosticado antes de los 50 años. Debe haber al menos tres familiares con un cáncer asociado a HNPCC (CCR, endometrio, intestino delgado, uréter o pelvis renal). Todos los siguientes criterios deben estar presentes: Un paciente afectado debe ser pariente en primer grado de los otros dos. Al menos dos generaciones sucesivas deben estar afectadas. Al menos un caso de cáncer debe ser diagnosticado antes de los 50 años. Debería excluirse PAF en los casos de CCR. Los tumores deben verificarse por exámenes histopatológicos. Tabla II Criterios de Ámsterdam I y Ámsterdam II (Amsterdam criteria). Criterios para el diagnóstico clínico de Síndrome de Lynch. CCR: Cáncer de Colon y Recto, HNPCC: Cáncer de Colon Hereditario No Polipósico, PAF: Poliposis Adenomatosa Familiar (Tomado de Vasen et al., 1991 y Vasen et al., 1999). 21

30 Criterios de Bethesda Criterios de Bethesda Revisados Debe cumplirse uno de los siguientes criterios: Individuos con cáncer de familias que cumplen con los criterios de Ámsterdam. Individuos con dos cánceres relacionados a HNPCC, incluyendo CCR sincrónicos y metacrónicos o extracolónicos asociados. Individuos con CCR y un pariente en primer grado con CCR y/o cáncer relacionado a HNPCC extracolónico (diagnosticado antes de los 45 años) y/o adenoma colorrectal (diagnosticado antes de los 40 años). Individuos diagnosticados con CCR o cáncer de endometrio antes de los 45 años. Individuos con CCR de lado derecho y patrón histopatológico indiferenciado diagnosticado antes de los 45 años. Individuos con CCR con células en anillo de sello diagnosticado antes de los 45 años. Individuos con adenomas diagnosticados antes de los 40 años. Debe cumplirse uno de los siguientes criterios: CCR diagnosticado antes de los 50 años. Presencia de CCR sincrónico, metacrónico u otro tumor asociado a HNPCC sin importar la edad. CCR con histología sugerente de MSI-H* diagnosticado en pacientes menores de 60 años. CCR con uno o más parientes en primer grado con CCR o tumores asociado a HNPCC. Uno de los cánceres debe haber sido diagnosticado antes de los 50 años. CCR con dos o más parientes en primer o segundo grado con CCR u otro cáncer relacionado con HNPCC sin importar la edad. Tabla III Criterios de Bethesda (Bethesda Guidelines). Criterios de selección de tumores para realizar análisis moleculares. *La histología sugerente de inestabilidad de microsatélites alta incluye: linfocitos infiltrantes, reacción tipo Crohn, células en anillos de sello, mucinoso, patrón de crecimiento medular. CCR: Cáncer de Colon y Recto, HNPCC: Cáncer de Colon Hereditario No Polipósico (Tomado de Rodríguez- Bigas et al., 1997 y Umar et al., 2004ª). 22

31 et al., 2005). En general, se utilizan dos metodologías para estudiar el funcionamiento del sistema MMR: detección de la presencia/ausencia de las proteínas de reparación mediante inmunohistoquímica y la detección de microsatélites inestables, condición provocada por un sistema MMR defectuoso Inmunodetección de MSH2 y MLH1 Los trabajos de identificación de las proteínas del sistema de reparación de bases mal apareadas mediante inmunohistoquímica se comenzaron a realizar en el año 1996, cuando estuvieron disponibles los primeros anticuerpos monoclonales para estas proteínas (Leach et al., 1996; Thibodeau et al., 1996). La inmunohistoquímica es una técnica simple, económica y rápida para realizar tamizaje de tumores en busca de ausencia de expresión de estos genes (Thibodeau et al., 1996). Además, ha mostrado alta sensibilidad y especificidad, con un alto valor predictivo positivo, para la detección de pacientes con Síndrome de Lynch (Stormorken et al., 2001; Stormorken et al., 2005; Payá Romá et al., 2006; Shia, 2008). La detección de la pérdida de expresión de las proteínas del sistema MMR con inmunotinción se realiza en cortes de tejido colorrectal, que pueden obtenerse de muestras de biopsias fijadas en formalina e incluidas en parafina, y utiliza anticuerpos comerciales específicos (Baudhuin et al., 2005). La expresión de los genes del sistema MMR es regulada fisiológicamente, por lo que su expresión puede variar de una célula a otra. Es por esto, que cuando se analiza las tinciones para estas proteínas, es necesario comparar los resultados obtenidos en las células tumorales con células sanas de tejidos adyacentes, como epitelio no neoplásico, linfocitos, estroma, etc., que sirvan como controles positivos de la técnica (Lynch et al., 2009ª). Si el tejido tumoral no presenta inmunotinción y el sano sí, se interpreta como ausencia de la proteína evaluada (Debniak et al., 2000; Müller et al., 2001; Baudhuin et al., 2005). Una de las mayores ventajas que presenta el análisis por inmunohistoquímica es que permite dirigir la búsqueda de mutaciones a uno de los genes involucrados (Baudhuin et al., 2005; Vasen et al., 2007; Hampel et al., 2008). Actualmente, para 23

32 diagnóstico de Síndrome de Lynch se está recomendando utilizar un panel de cuatro anticuerpos: MSH2, MLH1, MSH6 y PMS2 (Paya Romá et al., 2006; Molaei et al., 2010). Así, se ha observado la pérdida de la expresión de MLH1 en un 50% de los casos de HNPCC, MSH2 en un 39% de los casos, MSH6 en un 7% y PMS2 en menos del 4% (Paya Romá et al., 2006). La mayor parte de las mutaciones germinales en MSH2 lleva a la pérdida de expresión de la proteína. En cambio, las mutaciones en MLH1, frecuentemente son mutaciones de sentido erróneo, que alteran la funcionalidad de la proteína, pero no su inmunoreactividad (Pëltomaki, 2005; Shia, 2008; Boland et al., 2008; Lynch et al., 2009ª). Esto hace que realizar un diagnóstico de mutaciones en MLH1 solo por inmunotinción sea poco preciso. Además, hay que considerar que la expresión de MLH1 puede estar siendo inactivado por metilación de su promotor. Este aspecto será discutido en la sección Si bien, la técnica presenta bastantes ventajas, es una técnica que solo demuestra la ausencia de la proteína (por reacción inmunohistoquímica) y no informa de la causa de esa ausencia. Además, presenta desventajas, como lo ya discutido sobre MLH1 o la necesidad de tener controles internos (como en cualquier técnica) y requiere de un observador con experiencia que pueda diferenciar patrones celulares de tinción alterados (Müller et al., 2001; Paya Romá et al., 2006; Shia, 2008: Klarskov et al. 2010) Inestabilidad de Microsatélites (MSI) La inestabilidad de microsatélites se define como un cambio en el largo de un microsatélite, debido a inserciones o deleciones de unidades de repetición en un tumor comparado con tejido normal (Boland et al., 1998). La detección de MSI se realiza mediante el análisis de loci microsatelitales que se encuentran frecuentemente mutados en el DNA de tejido tumoral cuando hay inactivación del MMR (Grady, 2003). Muchos cánceres de colon presentan un pequeño porcentaje de alteraciones en las secuencias microsatelitales (Ionov et al., 1993), por lo que se ha definido que un tumor presenta MSI como fenotipo cuando al menos 30-40% de sus microsatélites son inestables, situación que se designa como 24

33 MSI-H (High, alta frecuencia), mientras que los casos que presentan menos del 30% de inestabilidad se denominan MSI-L (Low, baja frecuencia). Finalmente, están los casos con microsatélites estables o MSS (Boland et al., 1998; Umar et al., 2004 b ; Baudhuin et al., 2005). Los tumores MSI-L y MSS representan un tipo clínicamente distinto a los MSI-H y no están relacionados con el Síndrome de Lynch (Tomlinson et al., 2002; Umar et al., 2004 b ). Si bien se cree que la mayoría de las mutaciones en las secuencias microsatelitales, en especial aquellas que se utilizan para el diagnóstico de la inestabilidad, no están relacionadas con la progresión tumoral, sí se ha identificado inactivación de genes que poseen microsatélites en sus secuencias codificantes. Hay alrededor de 32 genes que tienen repeticiones mononucleotídicas que podrían volverse inestables. Algunos ejemplos relacionados con cáncer de colon y recto son BAX (involucrado en apoptosis), TGFβRII (receptor del supresor de tumores TGF-β) y varios genes del sistema de reparación de bases mal apareadas. Todos ellos se inactivan por corrimiento del marco de lectura. Además, el gen β-catenina, un oncogén que regula la proliferación y el comportamiento celular, frecuentemente está inactivado por mutaciones puntuales (Figura 2) (Søreide et al., 2006; Søreide, 2007; Boland et al., 2008). Con el fin de uniformar el análisis y obtener resultados comparables entre los laboratorios, en una reunión del National Cancer Institute (NCI) de Estados Unidos, se escogió un panel de cinco loci microsatelitales para el análisis de MSI (Boland et al., 1998). Este panel incluye dos loci con repeticiones mononucleotídicas: BAT-25 (4q12/c-kit) y BAT-26 (2p16.3/hMSH2), y tres loci con repeticiones dinucleotídicas: D2S123 (2p16/hMSH2), D5S346 (5q21/APC) y D17S250 (17q11.2/BRCA1) (Boland et al., 1998). Diversos estudios han mostrado que este panel y otros loci microsatelitales son altamente sensibles para la detección de pacientes con síndrome de Lynch, mostrando también una alta especificidad y valor predictivo positivo, especialmente, si se utilizan en combinación con criterios clínicos de selección de pacientes (Suraweera et al., 2002; Brennetot et al., 2004; Piñol et al., 2005; Murphy et al., 2006), ya que existe una alta probabilidad de encontrar mutaciones génicas en 25