RIESGO DE CÁNCER EN CASOS CON SOSPECHA DE SÍNDROME DE LYNCH SIN MUTACIÓN GERMINAL

Transcripción

1 2014 RIESGO DE CÁNCER EN CASOS CON SOSPECHA DE SÍNDROME DE LYNCH SIN MUTACIÓN GERMINAL AUTORA María Rodríguez Soler DIRECTOR Rodrigo Jover Martínez

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3 D. JAVIER FERNANDEZ SÁNCHEZ, Director del Departamento de Medicina Clínica de la Universidad Miguel Hernández AUTORIZA: La presentación y defensa como Tesis Doctoral del trabajo Riesgo de cáncer en casos con sospecha de Síndrome de Lynch sin mutación germinal realizado por Dª María Rodríguez Soler bajo la dirección del Dr. D. Rodrigo Jover Martínez. Lo que firmo en Sant Joan d Alacant a Veintinueve de Abril de Dos Mil Catorce. Prof. J. Fernández Director Dpto. Medicina Clínica DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLINICA Campus de San Juan. Ctra. de Valencia (N 332), Km San Juan de Alicante Telf.: Fax: c.electrónico: med.psiqui@umh.es

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5 D. Rodrigo Jover Martínez, Doctor en Medicina como Director de Tesis Doctoral CERTIFICA: Que el trabajo Riesgo de cáncer en casos con sospecha de Síndrome de Lynch sin mutación germinal realizado por Dª María Rodríguez Soler ha sido llevado a cabo bajo mi dirección y se encuentra en condiciones de ser leído y defendido como Tesis Doctoral en la Universidad Miguel Hernández. Lo que firmo para los oportunos efectos en Alicante a Veintinueve de Abril de Dos Mil Catorce. Fdo. Dr. D. Rodrigo Jover Martínez Director de Tesis DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLINICA Campus de San Juan. Ctra. de Valencia (N 332), Km San Juan de Alicante Telf.: Fax: c.electrónico: med.psiqui@umh.es

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7 Universidad Miguel Hernández Facultad de Medicina Departamento de Medicina Clínica RIESGO DE CÁNCER EN CASOS CON SOSPECHA DE SÍNDROME DE LYNCH SIN MUTACIÓN GERMINAL Autora: María Rodríguez Soler Director de Tesis: Rodrigo Jover Martínez

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9 A mis hijos, A mi madre, A mí.

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11 Agradecimientos A Rodrigo A Óscar A mi padre A mi hermano A mis tías A Pedro Zapater A Miriam, Eva y Carla

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13 ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico APC: Adenomatous polyposis coli BRAF: v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 CCHNP: Cáncer colorectal hereditario no polipósico CE: cáncer de endometrio CIMP: Fenotipo metilador de islotes CpG CIN: Inestabilidad cromosómica CCR: cáncer colorrectal EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico EPCAM: Epithelial cell adhesión molecule IHQ: Inmunohistoquímica IMS: Inestabilidad de microsatélites KRAS: Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog MLH1: Human MutS Homologue 1 MLPA: Multiplex Ligation Probe Amplification MMR: Mismatch repair (reparación de errores de emparejamiento) MSH2: Human MutS Homologue 2 MSH3: Human MutS Homologue 3 MSH6: Human MutS Homologue 6 MSS: estabilidad en microsatélites NCI: National Cancer Institute PCR: reacción en cadena de la polimerasa PIK3CA: phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinase, catalytic subunit alpha PMS2: Human Postmitotic 2 MutL Homologue SIR: Standarized incidence ratios (tasas de incidencia estandarizada) SL: Síndrome de Lynch SLL: Síndrome Lynch-like SNC: sistema nervioso central

14 TNM: sistema de estatificación del cáncer T (tumor primario), N (afectación ganglionar), M (metástasis a distancia) TRSL: Tumores relacionados con el síndrome de Lynch TP53: tumor protein p53 SEOM: Sociedad Española de Oncología Médica

15 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN Epidemiología del cáncer colorrectal en España Fisiopatología del cáncer Vías patogénicas del cáncer colorrectal Vía de inestabilidad cromosómica o vía supresora Vía de inestabilidad en microsatélites o vía mutadora Vía metiladora o fenotipo metilador de las islas CpG Síndrome de Lynch Generalidades Diagnóstico CCR familiar tipo X Epimutaciones constitucionales de MLH1 y MSH Vigilancia JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS MÉTODOS Sujetos y recogida de datos Análisis molecular Análisis de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímico Análisis de metilación en MLH1 y mutación en BRAF Análisis de mutaciones germinales Análisis estadístico Trabajo realizado por María Rodríguez Soler RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 87

16 10. ANEXOS Financiación Otras publicaciones Grupo Epicolon Artículo 107

17 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1

18 Introducción 2

19 Introducción 1.1. Epidemiología del cáncer colorrectal en España El cáncer es una enfermedad de gran envergadura a nivel mundial debido a su incidencia, prevalencia y mortalidad. Es la segunda causa de muerte en España, y es, por tanto, un problema de salud prioritario en nuestro país. Según datos de la SEOM, la incidencia global prevista de cáncer para la población española en el año 2015 es de personas ( varones y mujeres), siendo el cáncer colorrectal (CCR) el tipo de cáncer más frecuente, por delante, en términos globales, del cáncer de pulmón y el cáncer de mama (Figura 1). Figura 1. Incidencia global de cáncer estimada para la población española en el año 2015 según datos de la SEOM (Sociedad Española de Oncología Médica). 3

20 Introducción Si separamos por sexo, la incidencia global de cáncer en varones (excluyendo los casos de cáncer de piel no melanoma) calculada para el año 2015 será de casos. El CCR será el tercer tumor más frecuente en los varones precedido del cáncer de pulmón y el cáncer de próstata. La incidencia global prevista de cáncer en mujeres españolas en el año 2015 será de En mujeres, el CCR ocupará el segundo lugar en frecuencia, precedido únicamente por el cáncer de mama (1) (Figura 2). Figura 2. Incidencia global de cáncer en hombres y mujeres prevista para el año 2015 según datos de la SEOM. 4

21 Introducción En cuanto a la mortalidad, el cáncer supuso la primera causa de muerte en varones y la segunda en mujeres en el año 2007 tras las enfermedades cardiovasculares, abarcando el 26% de las muertes en España en ese momento. A pesar de ello, la mortalidad ha descendido desde En el año 2007 fallecieron personas en España por cáncer, varones y mujeres. El tumor con mayor mortalidad fue el cáncer de pulmón seguido del CCR. Si dividimos por sexo, el CCR es el segundo tumor más mortal tras el cáncer de pulmón en varones y el cáncer de mama en mujeres. Todo ello se puede observar en las figura 3 y 4. Figura 3. Mortalidad por cáncer de manera global en el año

22 Introducción Figura 4. Mortalidad por cáncer en 2007 distribuida por sexo. 6

23 Introducción 1.2. Fisiopatología del cáncer La carcinogénesis es un proceso dinámico con múltiples pasos en el que se van produciendo alteraciones genéticas de manera progresiva en la célula normal, dando lugar a derivados celulares con una elevada malignidad. Así, las células cancerígenas poseen defectos en los circuitos reguladores de la proliferación celular y homeostasis. Básicamente existen 6 alteraciones esenciales en la fisiología celular que provocan un crecimiento maligno (2), todo ello se muestra en la figura 5: 1. Autosuficiencia en la señalización del crecimiento celular. Las células normales requieren señales de crecimiento para pasar de un estado quiescente a un estado de proliferación. Muchas células cancerígenas adquieren la capacidad de sintetizar factores de crecimiento creando una señal de retroalimentación positiva; capacidad de sobreexpresar receptores de los factores de crecimiento dando lugar a una respuesta desmesurada ante niveles de factores de crecimiento que habitualmente no provocarían proliferación; capacidad de cambiar los tipos de receptores de la matriz extracelular (integrinas) que expresan, favoreciendo aquellas que transmiten señales que promueven el crecimiento; y alteración de los componentes de los circuitos citoplasmáticos que reciben y procesan las señales emitidas por los receptores de factores de crecimiento activados e integrinas. 2. Pérdida de sensibilidad a las señales de inhibición del crecimiento celular. Dentro de los tejidos normales, múltiples señales en contra de la proliferación funcionan para mantener las células en fase quiescente y la homeostasis tisular. Las células cancerígenas evaden estas señales antiproliferativas para continuar creciendo. 7

24 Introducción 3. Evasión de la apoptosis. La capacidad de las poblaciones celulares tumorales de expandirse en número no sólo depende de la tasa de proliferación celular sino de la tasa de desgaste celular. Es bien conocido que la apoptosis celular es un mecanismo de defensa frente al cáncer. La resistencia a la apoptosis es prácticamente universal en todas las células tumorales y puede adquirirse a través de varios mecanismos, el más estudiado de los cuales es la mutación en el gen supresor de tumores p Potencial de replicación ilimitado. La desregulación del programa de proliferación celular debería ser suficiente para dar lugar a la mayoría de la población celular que constituye un tumor macroscópico. Sin embargo, existen también otros mecanismos que contribuyen al crecimiento expansivo del tumor. La mayoría de las células de los mamíferos poseen un programa intrínseco que limita su multiplicación que parece operar independientemente de las vías de señalización celulares descritas previamente. Este mecanismo debe ser abolido para dar lugar a un tumor macroscópico. 5. Angiogénesis sostenida. La vascularización proporciona oxígeno y nutrientes indispensables para el funcionamiento y supervivencia celular. Habitualmente las células de las lesiones que proliferan de manera aberrante pierden la capacidad angiogénica impidiendo así su expansión. Sin embargo, las células tumorales desarrollan capacidad de inducir y mantener la angiogénesis. 6. Invasión tisular y metástasis. La capacidad de invasión y metástasis permite a las células cancerígenas escapar de la masa tumoral inicial y colonizar nuevos tejidos sin la limitación de nutrientes y espacio que tenían inicialmente. Ello implica cambios en el acoplamiento físico de las células al microambiente y la activación de las proteasas extracelulares. 8

25 Introducción Evasión de la apoptosis Autosuficiencia en la señalización del crecimiento celular Pérdida de sensibilidad a las señales de inhibición del crecimiento celular Angiogénesis sostenida Potencial de replicación ilimitado Invasión tisular y metástasis Figura 5. Capacidades adquiridas por las células cancerígenas. The Hallmarks of Cancer, Cell,

26 Introducción 1.3. Vías patogénicas del cáncer colorrectal El CCR sigue habitualmente la secuencia conocida adenoma-carcinoma en la cual el epitelio normal del colon se transforma en adenocarcinoma pasando por un paso intermedio, el adenoma (3). En el CCR se han descrito por lo menos 3 vías patogénicas distintas: la inestabilidad cromosómica o vía supresora (CIN), la inestabilidad en microsatélites o vía mutadora (IMS) y el fenotipo metilador de las islas CpG o vía metiladora (fenotipo metilador). Estas tres vías de desarrollo tumoral no son excluyentes, así, un tumor puede manifestar características de múltiples vías Vía de inestabilidad cromosómica (CIN) o vía supresora Esta vía sigue el modelo propuesto por Fearon y Vogelstein en 1990 (4,5). Inicialmente se produce una inactivación el gen supresor de tumores APC permitiendo la proliferación de células epiteliales de una manera desmesurada con la consecuente aparición del adenoma, una lesión premaligna, a partir de la mucosa sana, seguido de la mutación de KRAS que se asocia al crecimiento del adenoma. Posteriormente se producen una serie de mutaciones adicionales en el factor de crecimiento transformante factor-β, PIK3CA, y TP53 que provocan la progresión a adenocarcinoma (Figura 6). Habitualmente los adenomas convencionales no progresan y los que progresan a una lesión maligna lo hacen de una manera lenta, requiriendo muchos años. Por ello, las estrategias de cribado mediante colonoscopias y resección de adenomas son muy eficaces en la prevención de tumores estables que siguen la vía supresora. 10

27 Introducción APC/β-catenina KRAS TP53, PIK3CA, pérdida de 18q Mucosa normal Criptas aberrantes Adenoma temprano Adenoma avanzado Cáncer invasivo EGFR, COX2 Aumento CIN Figura 6. Modelo de carcinogénesis del CCR mediante la vía de inestabilidad cromosómica. Como se ha dicho anteriormente el factor inicial de esta vía es la inactivación del gen supresor de tumores APC. El gen APC da lugar a una proteína que regula múltiples funciones celulares como la regulación de la diferenciación, adhesión, polaridad, migración, desarrollo, apoptosis e incluso la segregación cromosómica. Pero quizás, su función más importante en el proceso de carcinogénesis es su implicación en la vía de señalización Wnt. Así, su inactivación da lugar a la activación de esta vía, dando lugar a la transcripción de múltiples genes implicados en el crecimiento e invasión tumoral (6,7). 11

28 Introducción La tasa de mutaciones celulares basales no es suficiente para el desarrollo de cáncer. Así, las células cancerígenas deben adquirir algún tipo de inestabilidad genómica intrínseca, un fenotipo mutador, que incrementa su tasa de nuevas mutaciones. La inestabilidad cromosómica hace referencia a la elevada tasa de ganancias o pérdidas de todo o gran parte de los cromosomas dando lugar a la variabilidad cariotípica entre células. La consecuencia de ello es un desequilibrio en el número de cromosomas (aneuploidia), amplificación genómica y pérdida de heterocigosidad (8). La inestabilidad cromosómica está presente en el 65-70% de los CCR esporádicos y algunos estudios indican que esta vía de carcinogénesis se asocia a un peor pronóstico en los CCR (9,10,11) Vía de inestabilidad en microsatélites (IMS) o vía mutadora Esta vía se descubrió inicialmente en bacterias en los años y se definió a principios de los años 90 (12). Se caracteriza por la inactivación de los genes envueltos en el sistema de reparación del ADN (sistema MMR), principalmente MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. El sello característico de esta vía es la presencia de inestabilidad en microsatélites (IMS) en el tejido tumoral. Los microsatélites son zonas de pequeñas repeticiones (1-6 nucleótidos) en tándem del ADN distribuidas a lo largo de todo el genoma, son polimórficas entre individuos pero únicas y de longitud uniforme en cada tejido de cada persona. El sistema MMR está formado por una familia de enzimas que detectan y reparan los errores del ADN durante la fase S de replicación del mismo. En ocasiones, la enzima ADN polimerasa provoca errores durante la replicación al incorporar un número diferente de bases en zonas repetitivas del ADN como los microsatélites. El deslizamiento de una de las 12

29 Introducción cadenas del ADN durante la replicación provoca la alteración en las bases aparejadas o la inserción o deleción de un lazo que habitualmente es detectado y reparado por el sistema MMR. Si estos errores no son subsanados, durante la segunda fase de la replicación la cadena original se copia correctamente pero la cadena complementaria se copia con la mutación. Esto puede dar lugar a la formación de proteínas truncadas o no funcionales, provocando la IMS (13,14,15). Las proteínas MSH2 y MSH6 forman un heterodímero que reconoce los pares de bases mal apareadas y el segundo heterodímero formado por MLH1 y PMS2 se encarga de eliminar varias bases de la cadena de ADN recién sintetizada y así permitir la síntesis de la misma con una correcta secuencia (Figura 7). Figura 7. Sistema reparador de errores en la replicación del ADN (sistema MMR). 13

30 Introducción Alrededor del 15% de los CCR presentan IMS (9). La gran mayoría de tumores con IMS, alrededor del 90%, son esporádicos, debidos al silenciamiento epigenético de MLH1 siguiendo la vía metiladora que se describe a continuación. El resto son hereditarios y se incluyen dentro del síndrome de Lynch, donde existe una mutación a nivel germinal en uno de los genes del sistema MMR Vía metiladora o fenotipo metilador de las islas CpG (CIMP) La tercera vía de desarrollo tumoral es la vía metiladora o fenotipo metilador de las islas CpG (CIMP) (16). Esta vía no se caracteriza por presentar inestabilidad genómica sino inestabilidad epigenética, específicamente metilación del ADN. De hecho, como se ha dicho anteriormente, la gran mayoría de tumores con IMS son resultado del silenciamiento epigenético de MLH1. Las islas CpG son dinucleótidos dispuestos en racimos en las regiones promotoras de los genes y habitualmente no están metiladas. Cuando se produce la metilación de estas islas CpG se produce la inactivación transcripcional del gen correspondiente y esto suele ocurrir en genes supresores de tumores. Los tumores inestables esporádicos se asocian a la vía serrada de carcinogénesis. Un evento frecuente en esta vía es la presencia de la mutación V600E en el oncogén BRAF. Esto ayuda a diferenciar los tumores inestables esporádicos de los tumores resultantes de la mutación germinal en el sistema MMR que ocurre en el Síndrome de Lynch. Estos tumores presentan características clínicas, patológicas y moleculares distintivas como su asociación con edades avanzadas, localización proximal, pobre diferenciación, P53 wild type, IMS, mutaciones en BRAF, y proceder de lesiones serradas (17,18,19). 14

31 Introducción Figura 8. Vías patogénicas de tumores colorrectales con inestabilidad en microsatélites. Adaptado de American Associaton for Cancer Research

32 Introducción 1.4. Síndrome de Lynch Generalidades La gran mayoría de casos de CCRs son esporádicos. Aproximadamente un 20% se incluyen dentro del Cáncer colorrectal familiar (aquellos que tienen uno o más familiares con diagnóstico de CCR) y alrededor de un 5-10% de los casos de CCR siguen una herencia mendeliana (20). Figura 9. Clasificación etiológica del cáncer colorrectal. El síndrome de Lynch, también llamado cáncer colorrectal hereditario no polipósico (CCHNP), es el CCR hereditario más frecuente, representa del 2 al 5% de todos los casos de CCR (21). 16

33 Introducción Inicialmente, el síndrome de Lynch fue descrito en 1913 por Warthin en una única familia (22). En 1966, Lynch et al., describieron 2 familias con múltiples casos de CCR, cánceres gástricos y de endometrio en los que no se detectaron adenomas múltiples y propusieron su origen hereditario (23,24). El término de síndrome de Lynch fue acuñado en 1984, e inicialmente se distinguieron dos tipos de síndrome, Lynch I y Lynch II en función de la presencia de tumores extracolónicos (25,26). El síndrome de Lynch se hereda de manera autosómica dominante y está provocado por mutaciones germinales a nivel de uno de los genes del sistema MMR, principalmente MLH1 y MSH2 pero también MSH6 y PMS2 (27). De manera somática se produce una alteración en el alelo no afecto que predispone a la acumulación de mutaciones somáticas dando lugar al fenotipo hipermutador que se detecta en los tumores de estos pacientes. El sello característico de estos tumores es la presencia de IMS, presente en más del 90% de estos tumores, secundario a esta alteración del sistema MMR (27). Los pacientes con síndrome de Lynch tienen un riesgo elevado de desarrollar CCR y otros tumores, principalmente endometrio, pero también ovario, tracto urinario superior, gástrico, intestino delgado, del sistema hepatobiliar, pancreático, de piel (adenomas sebáceos y queratoacantomas) y cerebrales (28). Típicamente los tumores y pólipos aparecen a edades tempranas, con un riesgo estimado de desarrollo de CCR a lo largo de la vida de entre el 22-75% y entre un 32-45% para el desarrollo de cáncer de endometrio (29,30,31,32). Con frecuencia los casos de CCR en este síndrome se localizan en el colon derecho con un elevado riesgo de desarrollo de tumores metacrónicos, cerca del 30% a los 10 años del primer diagnóstico (24,33). 17

34 Introducción Existen diversos estudios en los que se ha evaluado el riesgo de desarrollo de otros cánceres extracolónicos tras el diagnóstico de CCR. En un estudio realizado por Win et al. se observó un aumento del riesgo de desarrollo de cánceres de tracto urinario y de intestino delgado, entre otros (34). El riesgo de cáncer de páncreas se ha evaluado en varios estudios, con un riesgo estimado del 4% (34-36). En estudios recientes se ha observado además un riesgo elevado de otros tumores extracolónicos no relacionados típicamente con el síndrome de Lynch, como el cáncer de próstata y mama (35,37,38). Se ha observado un fenotipo diferente en función del gen mutado. Así, el riesgo de desarrollo de cáncer en los portadores de mutación del gen MSH6 es menor que en los portadores de mutación en MLH1 o MSH2. Parece que el riesgo de CCR es similar para portadores de MLH1 y MSH2, el riesgo de cáncer de endometrio es superior en los portadores de la mutación en MLH1 y el riesgo de otros tumores extracolónicos superior en los portadores de mutación en MSH2 (39). Existe menos información sobre la mutación en PMS2, aunque parece que los portadores de mutación en este gen poseen menor riesgo de desarrollo de cáncer comparado con el resto de mutaciones de MMR (40). 18

35 Introducción Cáncer Riesgo en población general MLH1 y MSH2 MSH6 PMS2 Riesgo Media edad aparición Riesgo Media edad aparición Riesgo Media edad aparición Colon 5,5% 40-80% años 10-22% 54 años 15-20% años Endometrio 2,7% 25-60% años 16-26% 55 años 15% 49 años Estómago <1% 1-13% 56 años 3% 63 años años Ovario 1,6% 4-24% 42,5 años 1-11% 46 años 42 años Hepatobiliar <1% 1.4-4% años No informado No informado No informado Tracto urinario <1% 1-4% años <1% 65 años No informado Intestino <1% 3-6% años No 54 años 59 años delgado informado SNC <1% 1-3% ~50 años No No 45 años informado informado Neoplasias sebáceas <1% 1-9% No informado No informado No informado No informado No informado Páncreas <1% 1-6% No informado No informado No informado No informado No informado Tabla 1. Riesgo de cáncer en pacientes con síndrome de Lynch comparado con la población general. Adaptado de las NCCN guidelines versión

36 Introducción Histopatológicamente los casos de CCR en el síndrome de Lynch se caracterizan por ser más frecuentemente mucinosos, pobremente diferenciados y presentar linfocitosis intraepitelial, todo ello característico de los tumores con alteración del sistema MMR (Figura 10). Infiltrado linfocítico Reacción Crohn-like Mucinoso Células en anillo de sello Patrón medular Figura 10. Características histológicas de los tumores con alteración del sistema MMR. 20

37 Introducción Diagnóstico La detección de pacientes con síndrome de Lynch es crucial debido al elevado riesgo de desarrollo de cáncer que presentan estos pacientes. Existen estrategias de vigilancia que reducen el riesgo de aparición de cáncer en estos casos, por lo que la realización de cribado para el síndrome de Lynch es coste-efectiva. Una vez realizado el cribado en los pacientes, tras la detección de una mutación germinal, se debe realizar el estudio a los familiares en riesgo para poder aplicar en ellos las estrategias de vigilancia y manejo adecuadas. Sin embargo, según la mayoría de especialistas en cáncer familiar, el síndrome de Lynch está infradiagnosticado (41). Por ello, se han propuesto varias estrategias para realizar un mejor diagnóstico de este síndrome. Criterios clínicos Para realizar el diagnóstico de Síndrome de Lynch inicialmente aparecieron unos criterios clínicos, los Criterios de Amsterdam, en 1991 (42). Estos criterios detectaban familias con un elevado riesgo de tener síndrome de Lynch. Sin embargo, eran muy estrictos, poseían una elevada especificidad pero baja sensibilidad para la detección de portadores de mutaciones germinales de MMR. Por ello, posteriormente aparecieron los Criterios de Amsterdam II, donde se tienen en cuenta, además de los casos de CCR, otros casos de tumores extracolónicos (43). Finalmente, en la conferencia del National Cancer Institute (NCI) de 1997, se desarrollaron los Criterios de Bethesda, otros criterios clínicos más amplios que indican qué pacientes deben de ser estudiados para descartar un síndrome de Lynch (44). Estos criterios han sido revisados recientemente (45). Los criterios de Bethesda revisados poseen una mayor sensibilidad que los criterios de Amsterdam ya que incluyen a los tumores extracolónicos así como la detección de inestabilidad en microsatélites en tejido tumoral. Tabla 2. 21

38 Introducción Tabla 2. Criterios clínicos para el diagnóstico de síndrome de Lynch. Criterios de Amsterdam I (1991) 3 familiares con CCR, uno de ellos familiar de 1º grado de los otros dos 2 generaciones consecutivas 1 tumor diagnosticado < 50 años Se debe excluir la poliposis adenomatosa familiar Los tumores deben de ser verificados histológicamente Criterios de Amsterdam II (1998) 3 familiares con cánceres asociados al SL, uno de ellos familiar de 1º grado de los otros dos 2 generaciones consecutivas 1 tumor diagnosticado < 50 años Se debe excluir la poliposis adenomatosa familiar Los tumores deben de ser verificados histológicamente Criterios de Bethesda Revisados (2003) 1. Paciente con CCR diagnosticado antes de los 50 años. 2. Paciente con CCR sincrónico o metacrónico, u otro tumor asociado al síndrome de Lynch independientemente de la edad de diagnóstico. 3. Paciente con CCR con histología característica de síndrome de Lynch (presencia de linfocitos infiltrantes de tumor, reacción Crohn-like, diferenciación mucinosa/anillo de sello, o crecimiento medular) diagnosticado antes de los 60 años. 4. Paciente con CCR y uno o más familiares de primer grado con un tumor asociado al síndrome de Lynch, uno de los cánceres diagnosticados antes de los 50 años. 5. Paciente con CCR y 2 o más familiares de primer o segundo grado con un tumor asociado al síndrome de Lynch, independientemente de la edad de diagnóstico. 22

39 Introducción Estrategia Molecular Universal A pesar del desarrollo de los criterios de Bethesda revisados para aumentar la sensibilidad en el diagnóstico de síndrome de Lynch, más de la tercera parte de los portadores de mutaciones en el sistema MMR no son detectados mediante estos criterios clínicos (33). Además han sido criticados por su complejidad para su aplicación en la práctica clínica diaria. En este sentido, en un estudio se ha observado que la implementación de estos criterios clínicos por los especialistas tras el diagnóstico de CCR es baja debido a su complejidad (46). En vista de estos problemas, se ha recomendado el estudio del sistema MMR mediante análisis de IMS o inmunohistoquímico (IHQ), a todos los pacientes con CCR (o todos los individuos con CCR diagnosticado antes de los 70 años de edad), independientemente de los criterios clínicos (47). Se han publicado diversos estudios en este sentido. Así, en un estudio realizado por Pérez-Carbonell et al., se observó que la realización de cribado de síndrome de Lynch de manera universal, es decir, en todos los pacientes con CCR, proporcionaba una mayor sensibilidad que la realización de este cribado únicamente en los pacientes que cumplían los criterios de Bethesda revisados (48). En otro estudio internacional realizado recientemente se ha observado que la estrategia diagnóstica más sensible para la detección de pacientes con síndrome de Lynch es el estudio del sistema MMR en CCR independientemente de la edad del diagnóstico (49). Además se ha demostrado que esta estrategia diagnóstica es coste-efectiva (50,51). El estudio del sistema MMR se puede realizar mediante el estudio de IMS o el análisis de expresión de las proteínas MMR mediante IHQ en tejido tumoral. 23

40 Introducción Análisis de IMS El estudio de IMS se realiza mediante PCR y se basa en la detección de alteraciones del tamaño de estas zonas repetitivas de nucleótidos en tumor, comparadas con tejido normal. La aparición de tamaños nuevos indica IMS. Las recomendaciones del NCI para definir el CCR como inestable alto requieren que 2 o más de los 5 marcadores sean inestables en un panel de 5 repeticiones de mononucleótidos (BAT25 y BAT26) y dinucleótidos (D2S123, D5S346, D17S250). Sin embargo, se ha desarrollado un panel de 5 repeticiones de mononucleótidos (BAT25, BAT26, NR-21, NR-22 y NR-24), que son casimonomórficos, con una sensibilidad y especificidad del 100% sin necesidad de utilizar ADN normal del paciente (52). En un estudio posterior se concluye que la revisión de la inestabilidad de los marcadores BAT26 y NR24 es igual de efectiva que el uso del pentaplex para el diagnóstico de alteración en el sistema MMR (53). Figura 11. Análisis de inestabilidad de microsatélites. A la izquierda tejido normal y a la derecha tejido tumoral. 24

41 Introducción Análisis inmunohistoquímico El análisis de expresión mediante IHQ se basa en la tinción histológica mediante anticuerpos. Se puede realizar sobre tejido fijado en formol e incluido en parafina. Para su valoración se dispone de controles internos positivos (estroma, linfocitos). Se considera pérdida de expresión cuando no se observa inmunotinción en ninguna célula neoplásica. Figura 12. Análisis inmunohistoquímico de tumor con pérdida de expresión de MLH1/PMS2. 25

42 Introducción Modelos predictivos Los modelos predictivos son modelos informáticos que estiman el riesgo individual de ser portador de una mutación MMR. Incluyen el MMRPredict, MMRPro y PREMM1,2,6 (54,55,56). Pueden ser particularmente útiles para evaluar pacientes sin diagnóstico de cáncer o en aquellos casos en los que no se dispone de tejido tumoral para realizar el análisis de MMR. Sin embargo, tienen limitaciones que restringen su uso. Incluyen múltiples variables clínicas y de historia familiar que son difíciles y laboriosas de recoger, por lo son difíciles de realizar en la consulta médica habitual. Análisis mutacional El diagnóstico de síndrome de Lynch se realiza mediante la detección de mutaciones a nivel germinal de uno de los genes del sistema MMR. Sin embargo, este estudio debe estar restringido a los casos con alta sospecha de síndrome de Lynch, por los criterios clínicos y moleculares descritos previamente. Existen 2 tipos principales de mutaciones a nivel germinal de los genes MMR: - Grandes reordenamientos: deleciones o duplicaciones que afectan a grandes regiones exónicas e intrónicas de uno de los genes MMR. Se detectan fácilmente mediante la técnica MLPA (Muliplex Ligation Probe Amplification). Las grandes deleciones explican un 22% de las mutaciones en MLH1 y PMS2, un 26% de las mutaciones en MSH2 y un 7% de las mutaciones en MSH6 (21). Sin embargo, las duplicaciones son infrecuentes en este síndrome. 26

43 Introducción - Mutaciones puntuales: la mayoría de las mutaciones puntuales en el gen MSH2 son patogénicas, de tipo sin sentido (nonsense) o de desplazamiento del patrón de lectura (frameshift). Sin embargo, en MLH1 existen muchos casos de mutaciones de sentido erróneo (missense) de las que se desconoce su patogenicidad y se consideran variantes de significado incierto (57). Tras la detección de una mutación patogénica a nivel de uno de los genes MMR se debe realizar el análisis genético dirigido a los familiares en situación riesgo. Si el familiar no es portador de la mutación, se considera un verdadero negativo, y no es necesario aplicar en él las estrategias de cribado y tratamiento utilizadas en el síndrome de Lynch. Sin embargo, en los casos en los que no es posible detectar una mutación patogénica o en los casos en los que se detecta una variante de significado incierto no se puede descartar la existencia de síndrome de Lynch. La estrategia empleada en la actualidad por la mayoría de autores es el estudio inicial de la pérdida de expresión de MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 mediante análisis IHQ en tejido tumoral de CCR, seguido del análisis guiado de mutaciones germinales. Tanto el estudio de IMS como la expresión IHQ del sistema MMR son pruebas sensibles y específicas para la detección de alteración en este sistema (58,59). Sin embargo, el análisis mediante IHQ permite realizar el análisis de mutaciones germinales de los genes MMR de manera guiada. Así, la detección de pérdida de expresión de MSH2, MSH6 y PMS2 mediante IHQ es altamente sugestiva de la presencia de una mutación de estos genes a nivel germinal. Esto no ocurre así tras la detección de pérdida de expresión de MLH1. Como ya se ha dicho anteriormente, la gran mayoría de tumores con IMS son resultado del silenciamiento epigenético de MLH1 debido a su inactivación por metilación, frecuentemente asociado a la presencia de la mutación V600E en el gen BRAF. Por ello, en los casos en los que se detecta pérdida de expresión 27

44 Introducción tumoral de MLH1, antes de realizar el análisis de mutaciones germinales a nivel de MLH1, se debe realizar el análisis de mutaciones en BRAF y/o el estudio de metilación del promotor de MLH1 en tejido tumoral con el fin de descartar casos esporádicos (9). Tanto el estudio de IMS como el análisis IHQ de las proteínas del sistema MMR pueden dar como resultados falsos negativos. En los casos de mutaciones en los que se forme una proteína no funcional pero sí detectable inmunológicamente, no se observa alteración en el análisis IHQ pero sí en el análisis de IMS. En los casos de mutaciones sin sentido, puede existir una proteína con algo de funcionalidad que no es capaz de formar un heterodímero estable por lo que no es reconocida por el anticuerpo utilizado. Esto es particularmente habitual en los pacientes portadores de mutación en MSH6 (60). Estos tumores además tienden a tener con menor frecuencia IMS debido a la redundancia de la función de MSH6 y MSH3. Por todo ello, el análisis IHQ y de IMS debe, en ocasiones, utilizarse de manera complementaria, especialmente en casos de CCR precoz o cuando la sospecha es alta por la historia familiar. Una alternativa es la identificación de pacientes con síndrome de Lynch tras el diagnóstico de cáncer de endometrio (CE), también mediante estudio del sistema MMR, bien mediante análisis de IMS o IHQ (61,62). Así, el análisis molecular en las pacientes con CE también se ha demostrado que es coste-efectivo. Un estudio reciente también ha observado que la realización de cribado molecular en los adenomas sebáceos conduce a la detección de un número sustancial de casos con síndrome de Lynch (63). 28

45 Introducción CCR familiar tipo X Alrededor de un 50% de familias que cumplen los criterios de Amsterdam no presentan alteración del sistema MMR (27). Estos pacientes inicialmente se consideraban como casos de síndrome de Lynch. Tras del descubrimiento del papel del sistema MMR en este síndrome, este conjunto de familias se diferencian claramente del síndrome de Lynch ya que no presentan alteración del sistema MMR y actualmente se denominan CCR familiar tipo X. En un estudio realizado por Lindor et al. se compararon familias que cumplían los criterios de Amsterdam en función de la presencia de alteración en el sistema MMR. Encontraron que las familias que cumplían los criterios de Amsterdam, pero sin alteración de MMR, tenían menos riesgo de desarrollar CCR que las familias con alteración de este sistema, sin encontrar un incremento en el riesgo de desarrollar otras neoplasias asociadas al síndrome de Lynch (64). En los consensos de expertos se sugiere la realización de cribado de CCR en estas familias que debe comenzar entre 5-10 años antes del diagnóstico de CCR más joven y decidir la frecuencia en función de los resultados de las colonoscopia, pero no más de 5 años Epimutaciones constitucionales de MLH1 y MSH2 En un porcentaje elevado de casos con sospecha de síndrome de Lynch no se detectan mutaciones a nivel germinal de los genes del sistema MMR. Recientemente se ha observado que algunos casos de síndrome de Lynch son causados por inactivación epigenética de los genes mediante metilación. Igual que ocurre en el síndrome de Lynch, las epimutaciones de MLH1 y MSH2 afectan a una copia del gen de 29

46 Introducción manera constitucional y la pérdida somática del segundo alelo provoca el desarrollo de cáncer. Grandes deleciones que incluyen los últimos exones de EPCAM (formalmente denominado TACSTD1), localizado anteriormente al gen MSH2, pueden provocar la inactivación de este gen, IMS y pérdida de expresión de MSH2, dando lugar a un fenotipo similar al síndrome de Lynch (65,66). Por lo tanto, el análisis de EPCAM debe realizarse en pacientes en los que se detecta pérdida de expresión de MSH2 en tejido tumoral pero sin identificar una mutación patogénica a nivel germinal de este gen. El riesgo de desarrollo de CCR en pacientes con deleciones de EPCAM-MSH2 es similar que en los pacientes con mutación germinal patogénica de MLH1 o MSH2 pero mayor que en los portadores de mutación germinal a nivel de MSH6. Sin embargo, el riesgo de cáncer de endometrio (12% a los 70 años) es significativamente menor en los portadores de deleciones en EPCAM que en pacientes con mutación germinal en MSH2 o MSH6 o la deleción combinada de EPCAM-MSH2 (67). La inactivación epigenética de MLH1 puede explicar también algunos de estos casos (68-73). Las epimutaciones constitucionales de MLH1 se caracterizan por la metilación de las bases citosinas en los dinucleótidos CpG en la región promotora de un alelo y el consecuente silenciamiento transcripcional del mismo en los tejidos normales. Parece que existen 2 tipos de epimutaciones constitucionales de MLH1. Una de ellas se caracteriza por la metilación del promotor de MLH1 en los tejidos somáticos, ocurre espontáneamente y revierte entre generaciones ya que es reversible durante la meiosis, por lo que no sigue una herencia mendeliana. El otro tipo es causado por una alteración del ADN en cis siguiendo una herencia mendeliana (74). Estos pacientes muestran un fenotipo similar al síndrome de Lynch, por lo que el análisis de epimutaciones constitucionales de MLH1 y MSH2 debe ser incluido dentro del algoritmo diagnóstico del síndrome de Lynch. 30

47 Introducción CCR Estudio molecular Universal IHQ±IMS Pérdida de expresión MLH1/PMS2 Pérdida de expresión MSH2/MSH6 Pérdida de expresión MSH6 Pérdida de expresión PMS2 Análisis Metilación-MLH1 Mutación BRAF + Epimut Const MLH1 CCR esporádico Análisis mutación germinal S.Lynch Pérdida de expresión MSH2 Análisis EpCAM Figura 13. Algoritmo propuesto para el diagnóstico de síndrome de Lynch, utilizando la estrategia universal. A pesar de estos hallazgos, en un porcentaje elevado de casos con sospecha de síndrome de Lynch no se detectan mutaciones germinales a nivel de los genes del sistema MMR ni otras causas que lo expliquen (75,76). 31

48 Introducción Vigilancia La realización de colonoscopias en los pacientes con síndrome de Lynch disminuye la mortalidad relacionada con CCR y la mortalidad global (75,77). En un estudio realizado recientemente se ha observado que la realización de la colonoscopia cada 1-2 años en vez de cada 3 años reduce el riesgo de CCR de 10% a 6%, además de conseguir que el 90% de los cánceres de intervalo se diagnostiquen en estadios tempranos (78). Es importante la realización de colonoscopias completas, con una correcta valoración del colon derecho, ya que la mayoría de los tumores aparecen en este lugar. Así, en la actualidad, se recomienda la realización de colonoscopias de control cada 1-2 años, iniciando el cribado a los años o 10 años antes del caso índice de CCR de la familia, en función de lo que ocurra primero. En el síndrome de Lynch, el riesgo de CE es muy elevado e iguala o incluso sobrepasa el riesgo de CCR en mujeres portadoras de mutaciones. El pronóstico global de mujeres con diagnóstico de CE no es malo, con una supervivencia a los 10 años del 80% aproximadamente. Sin embargo, el 20% de estas mujeres morirán debido a esta enfermedad. El objetivo principal del cribado de este cáncer es la detección y erradicación de lesiones premalignas o la detección del tumor en estadios tempranos para mejorar el pronóstico de estas pacientes. Sin embargo, el cribado del CE en el síndrome de Lynch es controvertido debido a la evidencia limitada en cuanto a la eficacia de la realización de una ecografía transvaginal con aspirado endometrial en la detección temprana o en el aumento de supervivencia. Actualmente, los consensos de expertos recomiendan la realización de una ecografía transvaginal y biopsia endometrial de manera anual en mujeres a partir de los años de edad (79). Parece que la única estrategia de prevención de cáncer de endometrio efectiva en estas pacientes es la realización de histerectomía y anexectomía de manera profiláctica (80). Por ello, esta opción debe discutirse con las pacientes que hayan cumplido sus deseos reproductivos. 32

49 Introducción La eficacia del cribado de las otras neoplasias asociadas al síndrome de Lynch no están validadas y su realización se basa en opiniones de expertos. Para el cribado de cáncer de ovario se recomienda la realización de ecografía transvaginal de manera anual a partir de los años, realizando las mismas recomendaciones quirúrgicas que en el cáncer de endometrio. En vista de la baja incidencia y la falta de evidencia en cuanto al beneficio de la realización de cribado de cáncer gástrico en pacientes con síndrome de Lynch, los expertos no recomiendan su cribado de manera rutinaria. Sin embargo, sí recomiendan la realización de cribado para H.pylori y su erradicación. Además, algunos autores consideran que se debe realizar una endoscopia digestiva alta cada 1-3 años a partir de los años sólo en aquellas familias con casos de cáncer gástrico o en las zonas en las que este tipo de tumor es muy prevalente. El cribado de los tumores de vías urinarias también se ha recomendado por algunos autores, con realización de citología urinaria y ecografía urológica cada 1-2 años a partir de los años (81). Sin embargo, la mayoría de autores no recomiendan su realización debido a la falta de eficacia de este cribado. 33

50 34 Introducción

51 Justificación 2. JUSTIFICACIÓN 35

52 Justificación 36

53 Justificación El síndrome de Lynch es el CCR hereditario más frecuente. Su identificación es muy importante por las implicaciones clínicas que conlleva, ya que se ha demostrado que la realización de estrategias de prevención de cáncer en estos pacientes son costeefectivas. Para identificar a pacientes con síndrome de Lynch, inicialmente se utilizaban criterios clínicos, los criterios de Amsterdam y posteriormente los criterios de Bethesda, como estrategia de cribado. Sin embargo, estos criterios han sido criticados por su complejidad y su falta de sensibilidad y especificidad dando lugar a un infradiagnóstico de este síndrome. En vista de estos problemas, actualmente la estrategia utilizada por la mayoría de los expertos para la identificación de estos pacientes, es la realización de un cribado molecular de manera universal a todos los pacientes con CCR para descartar la alteración del sistema MMR, bien mediante la realización de análisis de IMS o mediante IHQ, independientemente de los criterios clínicos. En los casos en los que se detecta una pérdida de expresión de MLH1 en tejido tumoral se realiza análisis de metilación del promotor de MLH1 ± análisis de mutación en BRAF antes de realizar el análisis de mutaciones germinales a nivel de este gen, con el fin de descartar tumores inestables esporádicos. En los casos en los que se detecta una pérdida de expresión de MSH2, MSH6, PMS2 o MLH1 sin metilación de su promotor se debe realizar el análisis de mutaciones germinales a nivel del gen MMR correspondiente. Sin embargo, existen casos de CCR en los que se detecta una alteración del sistema MMR en tejido tumoral pero en los que no se encuentran mutaciones a nivel germinal. Algunos de estos casos se explican por la existencia de epimutaciones constitucionales 37

54 Justificación de MLH1 y MSH2. El resto de casos en los que no somos capaces de detectar una mutación a nivel germinal, son habitualmente considerados como no esporádicos ya que no conocemos otras causas distintas a las mutaciones germinales de estos genes para explicar la alteración de MMR. Por lo tanto, estos pacientes con alteración del sistema MMR en tejido tumoral en los que no somos capaces de detectar mutaciones germinales, son considerados como no esporádicos o síndromes Lynch-like, y las decisiones en cuanto a su manejo clínico son difíciles ya que en realidad desconocemos su origen. No existen estudios hasta el momento que caractericen este grupo de pacientes con CCR. Además, el riesgo de desarrollo de cáncer en estos pacientes y sus familias es desconocido. Por ello, no está claro qué tipo de estrategias de vigilancia y prevención de cáncer debemos realizar tanto en ellos y como en sus familias. En este estudio pretendemos caracterizar este grupo de pacientes, con alteración de MMR en los que no se detectan mutaciones a nivel germinal, y determinar el riesgo de cáncer de sus familiares con el fin de aportar claridad en cuanto a su manejo clínico y el de sus familias. 38

55 Hipótesis 3. HIPÓTESIS 39

56 Hipótesis 40

57 Hipótesis - La caracterización de los pacientes con síndrome Lynch-like y la determinación del riesgo de cáncer de sus familias puede ayudar a: o Determinar el origen de estos tumores. o Decidir el tipo de estrategias de vigilancia que deben recibir ellos y sus familiares para la prevención de la aparición de tumores o su detección precoz. 41

58 Hipótesis 42

59 Objetivos 4. OBJETIVOS 43

60 Objetivos 44

61 Objetivos - Determinar el riesgo de cáncer en las familias de pacientes con alteración de la vía reparadora del ADN en los que no se detectan mutaciones a nivel germinal de los genes MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2 ni otras causas posibles para su inactivación. - Caracterizar de forma clínica y familiar el grupo de pacientes con alteración de la vía reparadora del ADN en los que no se detectan mutaciones a nivel germinal de estos genes o síndrome Lynch-like. 45

62 46 Objetivos

63 Métodos 5. MÉTODOS 47

64 Métodos 48

65 Métodos 5.1. Sujetos y recogida de datos El trabajo incluido en esta tesis es un estudio poblacional y observacional en el que se incluyó una cohorte de pacientes diagnosticados de CCR procedentes de 2 estudios nacionales multicéntricos, EPICOLON I y EPICOLON II. EPICOLON I es un estudio multicéntrico nacional español en el que se incluyeron pacientes consecutivos con nuevos diagnósticos de CCR entre noviembre del año 2000 y octubre del año 2001 con el objetivo principal de estimar la incidencia del síndrome de Lynch en España (82). EPICOLON II es otro estudio multicéntrico nacional español en el que se incluyeron de manera consecutiva pacientes con nuevos diagnósticos de CCR entre marzo del año 2006 y diciembre del año 2007 con el objetivo de investigar diferentes características relacionadas con el diagnóstico de CCR hereditario (83). Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes previo a su inclusión en los estudios. Ambos estudios fueron aprobados por los comités de ética de los respectivos hospitales de origen. Se establecieron 3 grupos de pacientes en función de sus resultados moleculares: 1. Pacientes con síndrome de Lynch (SL). Este grupo comprendía pacientes en los que se detectó una mutación germinal patogénica en uno de los genes del sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2). 2. Pacientes con síndrome Lynch-like (SLL). Grupo de pacientes en los que se detectó alteración del sistema MMR, es decir, pacientes con IMS y pérdida de expresión de MSH2/MSH6, pérdida aislada de expresión de PMS2 o pérdida de expresión de MLH1 sin metilación del promotor de MLH1, pero en los que no se detectó ninguna mutación patogénica en línea germinal. 49

66 Métodos 3. Pacientes con CCR esporádico. Pacientes con CCR MSS y con expresión normal de MMR o con pérdida de expresión de MLH1 con metilación del promotor de dicho gen. Los datos demográficos, clínicos y patológicos de los pacientes y los tumores se recogieron en el momento del diagnóstico del CCR. Durante la inclusión de los pacientes en los distintos estudios, EPICOLON I y EPICOLON II, se realizaron los árboles genealógicos donde se incluyeron los familiares de primer y de segundo grado y los casos de cánceres en la familia, con especificación del tipo de tumor y edad de aparición de los mismos. La información obtenida se verificó mediante la revisión de la historia clínica de los pacientes y familiares cuando fue posible. Se calcularon las tasas de incidencia estandarizadas de cáncer (SIR: standarized incidence ratios) en el momento de inclusión de los pacientes en los estudios EPICOLON I y EPICOLON II. Las SIR se calcularon mediante la realización de la razón entre los casos de cáncer observados en la familia y los casos esperados para ese tipo de tumor en la población general. Para realizar el cálculo de las SIR sólo se utilizaron datos correspondientes a familiares de primer grado con el fin de evitar los sesgos de memoria. Además, para realizar el análisis de la historia familiar y calcular el riesgo de cáncer en las familias, se excluyó el caso índice en el momento del diagnóstico con el fin de proporcionar una información más precisa. El cálculo de las SIR se realizó únicamente en familias en las que se disponía de un árbol genealógico completo con la edad de todos los familiares, incluyendo aquellos casos sin diagnóstico de cáncer. Se consideraron tumores relacionados con el síndrome de Lynch (TRSL), distintos a los CCR, los cánceres de endometrio, ovario, tracto urinario superior, estómago, intestino delgado y sistema hepatobiliar. 50

67 Métodos En 2011, se realizó una actualización de los árboles genealógicos mediante llamadas telefónicas o visitas clínicas, preguntándoles a los pacientes o a sus familiares sobre la aparición de nuevos casos de cáncer en la familia desde la inclusión de los pacientes en los estudios. Estos datos se comprobaron en las historias clínicas de los pacientes cuando fue posible. Los casos índices se incluyeron para realizar el análisis de la aparición de nuevos casos de CCR o TRSL-no CCR durante este tiempo. Así, la aparición de un CCR metacrónico u otro TRSL-no CCR en el caso índice se consideró como un nuevo caso en la familia Análisis molecular Análisis de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímico El análisis de IMS se realizó en los tumores de todos los pacientes. El tejido tumoral para la realización del análisis se obtuvo de muestras endoscópicas o tras la resección quirúrgica que fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80º. En los casos en los que no se pudo obtener muestras congeladas se utilizaron muestras parafinadas. El ADN se extrajo mediante el QuiaAmp tissue kit (Quiagen, Cortabeuf, Francia). Para valorar la inestabilidad se utilizaron los marcadores casi monomórficos BAT26 y NR24 como se ha descrito previamente (53). Se consideró inestabilidad en microsatélites cuando al menos uno de los dos marcadores fue inestable. El análisis inmunohistoquímico de las 4 proteínas del sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) se realizó en el tejido tumoral de todos los pacientes utilizando TMAs como se ha descrito previamente (48). Los TMAs se elaboraron con la extracción de cilindros de tejido, incluidos en parafina, con un diámetro de 1 mm, a partir de las 51