UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS

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1 UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS ESTUDIO MOLECULAR DE LOS GENES DE ANTIGENOS CLASE II REGIÓN DQ, DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD ASOCIADOS CON LA ARTRITIS CRÓNICA JUVENIL Tesis para optar por el grado de Doctor en Ciencias Médicas presenta: M en C. Mario Salazar Páramo Asesor Básico Dr. en C. Miguel Huerta Asesor Clínico Dr. en C. Fernando Rivas Solís Colima, Col. Junio de

2 Dedicado a: Ingrid Patricia, Ingrid de María y Mario. Agradecimientos: A mis asesores Dr. Miguel Huerta Viera y Fernando Rivas Solís. A la M en C. Norma Olivares Gassamans. A la Facultad de Medicina de la Universidad de Colima y al Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social. 2

3 INDICE Indice de Tablas y Figuras 1 Resumen 2 Abstract. 4 Introducción.. 6 Antecedentes.. 8 Artritis crónica juvenil. Generalidades. 8 Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y Antígenos leucocitarios humanos (HLA).14 Planteamiento del problema...27 Justificación Objetivos Material y método.30 Resultados Discusión Conclusiones Bibliografía 49 Anexos 56 3

4 Índice de Figuras y Cuadros Figura 1, Inmunorregulación en artritis crónica juvenil..13 Figura 2, Localización de los genes del MHC 16 Figura 3, Análisis molecular de alelos del MHC mediante PCR 44 Cuadro 1, Cuadro 2, Cuadro 3, Subgrupos clínicos de artritis crónico juvenil..23 Resultados, datos demográficos de los pacientes..37 Resultados de frecuencias alélicas globales.39 Cuadro 4, Resultados, frecuencias genotípicas.. 40 Cuadro 5, Resultados frecuencias genotípicas 41 Cuadro 6, Frecuencias alélicas DQA 42 Cuadro 7, Frecuencias alélicas DQB 43 4

5 RESUMEN La artritis idiopática juvenil incluye un grupo de artropatías crónicas de la infancia fenotípicamente heterogéneo. Los subtipos más comunes de la artritis crónica juvenil (ACJ) definidos por el Colegio Americano de Reumatología son el pauci u oligoarticular, la poliarticular y la artritis sistémica. Los factores tanto ambientales como genéticos juegan un papel importante de la susceptibilidad a la ACJ. Los estudios genéticos se han enfocado en el entendimiento de la contribución de los polimorfismos del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y la susceptibilidad al desarrollo de ACJ. La región del CPH se encuentra localizada en el brazo corto del cromosoma 6 e incluye a más de 200 genes, muchos de los cuales son esenciales para el sistema inmune. Las asociaciones entre el CPH y la ACJ siguen siendo reconocidas. La ACJ se ve influenciada en su expresión por la presencia de alelos clase II del CPH y continúan los esfuerzos para identificar estos alelos en diferentes grupos poblacionales alrededor del mundo. En el presente estudio nuestro objetivo fue identificar a los alelos clase II del CPH (región DQ) mediante la reacción en cadena de la polimerasa con secuencias específicas de oligonucleótidos y en combinación con polimorfismos obtenidos con fragmentos de longitud restringidos (RFLP), en niños mexicanos mestizos con ACJ. Pacientes y métodos. Usando un diseño transversal analítico, se tipificaron para genes clase II (DQA y DQB) del CPH, 38 pacientes con ACJ y 54 controles de mismo origen racial y no relacionados familiarmente. Se registraron datos 5

6 demográficos, clinicos y de laboratorio. El análisis estadístico mediante el uso de estadística paramétrica (comparación de promedios) y las variables categóricas mediante chi cuadrada y exacta. Resultados. Del total de pacientes 23 ( 61%) correspondieron al género femenino, la edad promedio fue de 16±5 años al momento de la evaluación y duración de la enfermedad de 5±5 años. Los alelos del MHC clase II más frecuentes fueron para: DQ 1: *0101 (6.6), *0102 (10.5), *0103 (2.6), *0104 (5.3), *0201 (2.6), *0301 (30.3), *0302 (3.9), *0401 (18.4); DQ 2: *0102 (2.6), *0103 (2.6), *0201 (2.6), *0301 ( 23.6), *0401 (23.6), *0501 (39.4); DQ 1: *0101 (13.2), *0201 (26.3), *0301 (31.5), *0302 (36.8), *0402 (2.6), *0501 (2.6); DQ 2: *0201 (2.6), *0302 (26.3), *0402 (26.3), *0501 (18.4), *0601 (5.2), *0602 (5.2), *0603 (10.5). Conclusión. En el presente trabajo se demostró que existen alelos individuales del MHC clase II DQ y DQ con frecuencias menores a lo observado entre el grupo sano. Palabras clave: Artritis crónica juvenil, complejo mayor de histocompatibilidad, polimorfismos, reacción en cadena de la polimerasa, oligonucleótidos. 6

7 ABSTRACT Juvenile idiopathic artritis includes a phenotypically heterogenous chronic childhood arthropathies. The most common subtypes of juvenile chronic arthritis (JCA) defined by the American College of Rheumatology are the pauci or oligoarticular, polyarticular and systemic arthritis. Genetic and enviromental factors are believed to play a role in the susceptibility to JCA. Genetic studies have focused on the understanding the contribution of polymorphisms in the major histocompatibility complex (MHC) to JCA susceptibility. The MHC region located on chromosome 6 includes more than 200 genes, many of them are essential to the immune system. Associations and linkage between MHC and JCA are still recognizing. JCA is influenced by MHC class II alleles and efforts continue to identify these alleles in different ethnic populations around the world. In the present study our objective was to identify the MHC class II alleles (DQ region) using the polymerase chain reaction (PCR) technique, with sequence specific-primers in combination with the restriction fragment length polymorphisms (RFLP) in Mexican mestizo children with JCA. Patients and methods. Using a cross-sectional design, we typed 38 patients with JCA and 54 ethnically matched unrelated controls for MHC class II (DQA and DQB) genes by PCR methods. Demographic, clinical and laboratory data were registered. Parametric analysis was used for comparison among means. For categoric variables we used chi square and exact test. 7

8 Results. There were 23 (61%) women with a mean age of 16±5 years at disease evaluation and evolution of 5±5 years. More frequent MHC class II allele were as follows: DQ 1: *0101 (6.6), *0102 (10.5), *0103 (2.6), *0104 (5.3), *0201 (2.6), *0301 (30.3), *0302 (3.9), *0401 (18.4); DQ 2: *0102 (2.6), *0103 (2.6), *0201 (2.6), *0301 ( 23.6), *0401 (23.6), *0501 (39.4); DQ 1: *0101 (13.2), *0201 (26.3), *0301 (31.5), *0302 (36.8), *0402 (2.6), *0501 (2.6); DQ 2: *0201 (2.6), *0302 (26.3), *0402 (26.3), *0501 (18.4), *0601 (5.2), *0602 (5.2), *0603 (10.5). Conclusions. In the present work we have demonstrated that individual alleles in the MHC class II are less frequent among JCA patients when compared with healthy controls. Key words: Juvenile chronic arthritis, histocompatibility major complex, polimorphisms, polymerase chain reaction, specific sequencing primers. 8

9 Introducción La artritis crónica juvenil (ACJ) comprende un grupo heterogéneo de enfermedades de etiología desconocida que aparece en la infancia. La prevalencia estimada en EUA es de /1000 niños. La incidencia anual de ACJ varía de 0.12 a 139/1000 niños con edades entre 1 a 16 años (Benjamín CM, 1990; Kaipiainen-Seppanen O et al. 2001). En México la prevalencia aproximada es 2 casos por cada habitantes, con una incidencia anual de 0.7 a 0.8 casos por 100,000 habitantes. Varios subtipos de la enfermedad han sido identificados, siendo el más común el oligo o pauciarticular (45% de los casos), la variedad poliarticular seronegativa sucede en el 25% de todos los casos, la poliarticular seropositiva en el 7% y aproximadamente un 23% de casos son considerados de presentación sistémica (enfermedad de Still). Se desconoce la etiología de la ACJ, pero es probable que intervengan diversos factores que predisponen a su expresión, tanto de origen genético como factores ambientales (Benjamín CM, 1990; Grom AA, et al. 1994; Woo P, et al. 1998). Algunos estudios han implicado la participación de agentes infecciosos en particular de origen viral como desencadenantes de la ACJ. Asimismo se han asociado a otros antígenos bacterianos (Lipnick RN, et al. 1990). Sin embargo, a nivel mundial no existe consenso sobre el verdadero papel de estos agentes infecciosos en la génesis de la ACJ. El avance en el conocimiento sobre genética molecular ha permitido establecer asociaciones genéticas en los grupos de niños con ACJ. La región más extensamente estudiada del genoma ha sido el complejo 9

10 principal de histocompatibilidad (MHC-HLA), varios productos de este grupo de genes se encuentran involucrados en la presentación y procesamiento de antígenos (Nepom B, 1991). Diversos estudios han revelado frecuencias mayores en la expresión de genes del MHC a lo normal en subgrupos de pacientes con ACJ. La escasez de afectación en pares en una hermandad en la ACJ ha dificultado el abordaje genómico completo, pero una combinación de abordajes (escrutinio genómico y genes candidatos) ayudaría a aclarar las asociaciones alélicas con el riesgo de ACJ. Datos también en estudio incluyen la participación de genes relacionados a citocinas (Nepom B, 1991). En el presente trabajo nos hemos propuesto identificar mediante metodología molecular (reacción en cadena de la polimerasa -PCR-, utilizando secuencias de primers oligonucleótidos- específicos) la frecuencia de los genes del MHC clase II (HLA-DQA, -DQB) presentes en un grupo de pacientes con ACJ, y compararlos con aquellas frecuencias que se observan en individuos sanos. La mejoría en la precisión del mapeo genético de los loci del HLA permite incrementar el número de genes involucrados en las enfermedades, además de establecer especificidades de asociaciones clínicas con alelos separados. 10

11 Antecedentes Artritis Crónica Juvenil. Generalidades. La ACJ es una enfermedad idiopática, de carácter inflamatorio con diversos síntomas clínicos tanto al inicio como durante el curso de la enfermedad que afecta a individuos menores de 16 años. En Estados Unidos de América (EUA) la ACJ afecta aproximadamente a niños, prevalencia de 30 a 150 casos por habitantes. En este mismo país la incidencia anual por 1000 niños con edades entre 0-16 años varía de 0.12 a (Falcini F, 2000; Ilowite 2002). Para los países de la comunidad europea existe un amplio rango de incidencia: de 1.3 a 22.6 por niños menores de 16 años (Andersson Gäre B, 1999). De diversos estudios epidemiológicos europeos (Benjamín 1990, Glass 1999, Kaipiainen-Seppanen O et al. 2001) se desprende una tendencia a un mayor gradiente de incidencia en países del norte respecto a países del sur. En Latinoamérica, de un estudio realizado en Costa Rica, la incidencia es de 6.8 por habitantes niños (Arguedas O, et al 1998). La prevalencia de ACJ también muestra una gran variabilidad que va de 8 a 400 casos por niños menores de 16 años. En nuestro país no se conocen datos precisos acerca de la prevalencia de la enfermedad. Sin embargo, dos estudios a nivel nacional analizan las manifestaciones clínicas, la forma en que inicia y su evolución de la esta enfermedad (Hernández-Ochoa, et al. 1988, Orozco-Alcalá, et al. 1989). Las edades del inicio de la enfermedad para ambos grupos fue similar siendo de 2 a 15 años, con predominio del género femenino. La forma de inicio más común de 11

12 esta enfermedad fue la poliarticular (cualquiera de sus subtipos) seguida de la oligoarticular, siendo la menos frecuente la forma de inicio sistémica. Clasificación. La ACJ es una enfermedad heterogénea clasificada de acuerdo a su forma de como inicia según la Liga Internacional Contra el Reumatismo (ILAR). En función de esta característica existen tres tipos mayores: 1) la variedad oligo o pauciarticular (donde se afectan 4 o menos articulaciones), 2) el tipo poliarticular (con 5 o más articulaciones afectadas) y 3) la forma sistémica (conocida también como variedad de Still). La variedad oligoarticular se subdivide a su vez en los tipos temprano y tardío, también llamados I y II. La forma poliarticular también puede presentarse en dos variedades, basados en la presencia o no del factor reumatoide (FR) (FR-isotipo IgM), de ahí encontramos pacientes con ACJ -FR positivo (seropositiva) o ACJ -FR negativo (seronegativa). Asimismo, se incluyen el síndrome entesitis artritis, la artritis psoriásica y un grupo que incluye variedades de ACJ que no logran ser clasificables (Cassidy JT, 1986; Woo P, 1998; Ilowite NT, 2002) Aspectos clínicos de la Artritis Crónica Juvenil. Artritis Oligoarticular. Este tipo de ACJ es la forma de presentación inicial más común comprendiendo hasta el 45% de los casos del total de ACJ. Los primeros signos de la enfermedad oligoarticular pueden ser insidiosos, incluyendo fatiga, rigidez matinal. La articulación afectada más frecuentemente son las rodillas, la cual puede estar inflamada sin dolor. Existen pocos datos clínicos sistémicos en esta variedad, con un mayor riesgo de presentar uveítis de la cámara anterior del 12

13 ojo. Hasta un 50-75% de los pacientes presentan un resultado de anticuerpos antinucleares positivo. Artritis Poliarticular con FR-negativo. Se establece en 30-40% de los casos con ACJ afectando principalmente a las niñas (4:1)(Thomas E, et al 2000; Woo P 1998), ocurre a cualquier edad con picos entre 1 a 3 años y 8 a 10 años. Puede acompañarse de manifestaciones sistémicas como fiebre de bajo grado, fatiga, anorexia y rigidez matinal. El patrón de afección articular es poliarticular, aditivo, simétrico. La destrucción articular es progresiva si no se trata a tiempo, resultado en incapacidades físicas y deformidades articulares prominentes. Artritis Poliarticular con FR-positivo. Contrario a lo que ocurre en la ACJ FRnegativo, el grupo de pacientes con esta variedad es más homogéneo y comprende del 7-10% del total de casos con ACJ. La mayoría de los pacientes también son mujeres y la presentación clínica es indistinguible de la forma de presentación en el adulto de la clásica artritis reumatoide (AR), en la cual existe un severo proceso erosivo con artritis debilitante, simétrica que afecta a grandes y pequeñas articulaciones (Falcini F, et al 2000). A diferencia de los adultos en esta variedad de ACJ pocos eventos extrarticulares son apreciados. Artritis Sistémica (Enfermedad de Still). Hasta un 23% de casos de ACJ pueden presentarse bajo la forma sistémica que afecta por igual a niños y niñas. En la presentación de este tipo se incluyen predominantemente síntomas y signos generales que obligan al clínico a establecer un protocolo de diagnóstico donde 13

14 datos como fiebre en picos (hasta 38ºC), la presencia de un eritema rosado, maculo-papular, migratorio, evanescente, así como la presencia de artritis que puede llegar a ser severa y habiendo descartado otras entidades patológicas hacen el diagnóstico (Woo P, 1998). Tratamiento de la artritis crónica juvenil. El manejo de la ACJ incorpora los esfuerzos coordinados de un equipo interdisciplinario de profesionales al cuidado de la salud. Los objetivos terapéuticos incluyen: alivio de los síntomas, mantenimiento de la función articular y la fuerza muscular, prevención del daño anatómico, optimizar el estado funcional, incorporar al paciente a la vida productiva y la dinámica familiar. El tratamiento es dividido en componentes físicos, sociales y farmacológicos. El manejo con medicamentos está dirigido a tratar manifestaciones articulares y sistémicas de la enfermedad. El uso de antinflamatorios no esteroideos es uno de los primeros pasos y en su uso habrá que tomar en cuenta los efectos colaterales que éstos ocasionan. De los medicamentos que modifican el curso de la enfermedad, el metotrexate es el más ampliamente estudiado y utilizado (Falcini F, et al. 2000). Otros agentes modificadores del curso de la enfermedad incluyen el uso de la sulfasalazina, leflunomida y más recientemente el manejo con medicamentos biológicos del tipo del etanercept. Otras complicaciones severas que colocan al pacientes en riesgo de morir pueden ser manejadas con corticoesteroides, sin embargo la alta frecuencia de los eventos indeseables y la carencia de evidencias de que estos medicamentos alteren el curso natural de la enfermedad hacen contrapeso en su 14

15 uso rutinario en la ACJ (Singsen BH, et al. 1997; van Rossum MAJ, et al. 1998; Cron RQ, et al. 1999; Ilowite NT, et al ). Etiología, Fisiopatología e Inmunología de la ACJ. El papel de la autoinmunidad en la etiología de la ACJ es poco claro, pero numerosos estudios han demostrado claramente las anormalidades inmunológicas en esta enfermedad. La respuesta inmune patogénica involucra la interacción del receptor de células T o de los linfocitos promotores de la enfermedad que reconocen antígenos peptídicos particulares que son presentados en el contexto de las moléculas que participan en el MHC. El polimorfismo de las moléculas del MHC permite que sean reconocidos los péptidos antigénicos que serán eficientemente presentados (Abbas AK, et al 1999, Cortes-Prieto L, 1999). El reconocimiento del antígeno lleva a la proliferación de linfocitos con especificidad de receptor para el MHC. Uno de los resultados es la liberación de enzimas proteolíticas y citocinas inflamatorias que reclutan otras células, incluyendo macrofágos y linfocitos B en el tejido dañado (Figura 1). El tejido sinovial inflamado es caracterizado por una marcada infiltración mononuclear, donde predominan los linfocitos T CD4+. En estrecha relación a esta población de linfocitos se encuentra las células dendríticas que expresan altos niveles de genes del MHC (antígenos de histocompatibilidad HLA- ) (Grom A, et al. 1994). Diferentes hallazgos histopatológicos característicos en articulaciones enfermas apoyan este concepto, así como la fuerte asociación existente entre las diferentes formas de ACJ y ciertos genes relacionados al MHC. 15

16 Figura 1. Diagrama que representa la inmunoregulación que se desarrolla durante la enfermedad de artritis crónica juvenil Agentes Infecciosos Factores Ambientales Factores Genéticos Proliferación de células B Células T Diferenciación de celulas B Factor reumatoide Producción de anticuerpos Anticuerpos antinucleares, Autoanticuerpos Antígenos Complejos Inmunes Depósito en Tejidos Patología Activación de complemento sérico Liberación de aminas vasoactivas Leucotrienos 16

17 El Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y Antígenos leucocitarios humanos (HLA). El MHC es una región de genes altamente polimórficos cuyos productos son expresados en una gran variedad de células. Las proteínas codificadas en el MHC, son comúnmente llamadas moléculas del MHC o antígenos MHC. Este locus fue descrito en la década de los años 40 gracias a los trabajos de Snell y Dausset. Posteriormente, son Benacerraf y McDevitt quienes describen la importancia fisiológica de las moléculas del MHC en la respuesta inmune (McDevitt HO, et al. 1968; Terasaki PI, et al. 1978). Zinkernagel y Doherty a finales de los años 70 demuestran que los linfocitos T no reconocen antígenos en una forma soluble o libre sino que lo hacen a través de péptidos unidos en forma no covalente a la moléculas del MHC, en otras palabras las moléculas del MHC ofrecen un sistema que permite la presentación de antígenos de naturaleza peptídica a las células T (Zinkernagel RM. 1979). Los científicos Bjorkman y Brown y colaboradores, en la década de los 80 y 90 respectivamente, describen las estructuras moleculares del MHC clases I y II (Bjorkman 1987, Brown 1993). En los trabajos de diversos investigadores (McDevitt HO, et al. 1968; Terasaki PI, et al. 1978) notaron que los pacientes que rechazaban tejido renal o presentaban reacción a trasfusiones sanguíneas frecuentemente desarrollaban anticuerpos circulantes contra antígenos presentes sobre la superficie de los leucocitos de la sangre u órgano donado, se desarrolló el término de antígenos leucocitarios humanos (HLA), que en la actualidad es conocido como el MHC humano. El grupo total de alelos del MHC presente en cada cromosoma es denominado como 17

18 haplotipo del MHC; y cada alelo del MHC tiene una designación numérica (Abbas A, 1999). Localización y clasificación del MHC. El MHC humano contiene más de 200 genes en aproximadamente 4 MB de ADN. Codificado en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3), representa aproximadamente el 1% del genoma. Los genes de antígenos de histocompatibilidad codificados dentro del MHC forman los tipos tradicionales del HLA que se subdividen en clases I y II. Los genes clase I del HLA se encuentran en la región telomérica del MHC y existen por lo menos 6 bien caracterizados locus de esta clase de antígenos, que se asocian a los principios antigénicos de trasplantes en humanos y que se expresan en toda clase de células nucleadas humanas (HLA-A, -C y B). Por otro lado, para antígenos clase II del HLA, que se extiende aproximadamente 800kb se han identificado hasta 14 diferentes locus, dentro de tres subregiones mayores denominadas HLA-DR, -DQ, y DP. Cada una de estas subregiones contiene por lo menos un locus funcional beta ( ) y un alfa ( ), así como genes y pseudogenes adicionales de función no precisada. La subregión del DR contiene un solo gene A y múltiples genes B. Se conocen actualmente nueve locus HLA-DRB, que se denominan DRB1 al DRB9. La subregión del DQ contiene los genes DQA1 y DQB1, y los pseudogenes DQA2, DQB2 y DQB3. La cadena es el determinante o antígeno principal de una molécula de DQ. En la región del DP se contienen los genes DPA1 y DPB1 así como los pseudogenes DPA2 y DPB2. Por extensión, existe una región denominada clase III, que comprende un grupo heterogéneo de moléculas y a sus 18

19 genes localizados en la misma región cromosómica. Estas moléculas tienen diversas funciones que no se relacionan directamente con la respuesta inmune (Figura 2). Figura 2. Representación esquemática de la localización de los genes del MHC en el brazo corto del cromosoma 6 <centrómero telómero> DP DQ DR C4 TNF Hsp70 B C A Estructura de las moléculas del MHC. HLA clase I. Todas las moléculas clase I contienen dos cadenas polipeptídicas separadas: una cadena pesada o cadena de aproximadamente 44 kd y una cadena (no codificada en el MHC) de 12kD. La cadena es formada por un centro polipeptídico de 40kD que contiene un oligosacárido en la región amino terminal. La cadena interactúa en forma no-covalente con la porción extracelular de la cadena pesada y no directamente con la células. Basados en las secuencias de aminoácidos primarios y la estructura cristalográfica de las porciones 19

20 extracelulares de las moléculas de clase I, ésta ha sido dividido en 4 regiones: una región amino-terminal extracelular (región de ligamiento del péptido); una región parecida a la estructura de las inmunoglobulinas; una porción transmembrana y otra citoplásmica. HLA clase II. Las moléculas de clase II están compuestas de dos cadenas de polipéptidos asociadas en forma no-covalente. La cadena de 32 a 34kD es ligeramente más grande que la cadena (29 a 32kD). Ambas cadenas contienen grupos de oligosacáridos en la región amino terminal; la región aminoterminal es de localización extracelular y la región carboxiterminal intracelular, dos tercios de cada cadena se identifican en el espacio extracelular. Las 2 cadenas de las moléculas clase II se codifican en diferentes genes del MHC. Así como las moléculas de clase I, las de clase II tienen diferentes regiones: el sitio de unión al péptido, la región parecida a la inmunoglobulina, y las regiones transmembrana y citoplásmica. Los antígenos clase II del HLA son extremadamente polimórficos y esto podría significar que cuando un marcador se asocia a una determinada enfermedad, la susceptibilidad genética estaría dada por el mismo marcador o un gene estrechamente relacionado al mismo en virtud de desequilibrio de ligamiento (Abbas AK, 1999). Presentación de antígenos por las moléculas del MHC clase II. La presentación de antígenos que alcanzaron una célula presentadora de antígenos (APC) extracelularmente es generalmente a través de las moléculas del MHC clase II. 20

21 Estos antígenos exógenos incluyen proteínas sintetizadas por bacterias extracelulares, hongos parásitos, así como proteínas administradas durante las inmunizaciones (Marks 1998). La fase inicial en la presentación de antígenos exógenos es la unión de la proteína nativa a una APC. Existen diferentes tipos de APC con especificidades y eficiencias particulares. Algunas APC unen antígenos de manera no específica, sin embargo, otras modulan la internalización mediante receptores específicos, como las porciones Fc de las inmunoglobulinas o los receptores para el fragmento C3b del complemento. Poco tiempo después de que los antígenos se unen a las APC, entran a la célula por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptores de superficie en vesículas recubiertas. Los antígenos proteicos solubles también se adentran a la célula por un proceso de pinocitosis sin tener que unirse primero a la superficie. Tales antígenos se localizan posteriormente en membranas intracelulares unidas a vesículas denominadas endosomas (Weenink SM, 1997). Para que ocurra una presentación antigénica eficiente varios eventos intracelulares ocurren simultáneamente. La proteína monomórfica denominada cadena invariante Ii actúa como molécula chaperona ya que se une a los heterodímeros clase II que se formaron en el retículo endoplásmico y los conduce hacia los endosomas. Durante el transporte, la cadena Ii previene la asociación del heterodímero con péptidos inespecíficos. Una vez que el complejo llega al medio ácido de los endosomas, la cadena Ii se degrada proteolíticamente y se disocia el complejo, dejando el sitio libre para unirse a un péptido antigénico derivado de proteínas exógenas (Malcherek G, 1998). El último fragmento de la cadena Ii se le llama CLIP y es removido físicamente con la ayuda de otra molécula del MHC 21

22 llamada DM (Kropshofer H, 1996). La interacción de la molécula DM con el heterodímero clase II ayuda también al ensamblaje rápido de péptidos de alta afinidad al surco (Kenty G, 1998). El complejo con el péptido sale del compartimiento endocítico para presentar el péptido a los linfocitos T CD4+ en la superficie. Las subunidades y de las moléculas clase II se unen entre sí de una forma no covalente poco tiempo después de haberse formado en el retículo endoplásmico. La cadena Ii también se oligomeriza, formando complejos homotriméricos con puentes disulfuro intercatenarios cerca de su porción citoplásmica. Cada uno de los trímeros de Ii se une a 3 cadenas - clase II. Una vez ensamblados los nonámeros de este complejo, este es transportado al aparato de Golgi para su glucosilación y sialización terminales (Kropshofer H, et al. 1996). Para que las moléculas clase II se puedan unir al antígeno, la cadena Ii tiene que ser liberada mediante un corte proteolítico en los lisosomas. Los primeros productos formados durante el corte de la cadena Ii incluyen polipéptidos inducidos por leupeptina (LIP) de 21KD y péptidos pequeños inducidos por leupterina (SLIP) de 11 kd. Los fragmentos de LIP incluyen las partes citoplásmicas y transmembranales de la cadena Ii y los fragmentos SLIP son precursores del CLIP (Sanderson F, et al. 1994). La molécula CLIP se degenera ya que puede unirse a diferentes moléculas del MHC. Está unión es débil, lo que asegura su fácil liberación para que posteriormente se una a un péptido (Weenink SM, 1997). 22

23 Antes de que los antígenos sean presentados deben ser procesados. Las enzimas involucradas en este proceso son las de los compartimientos ácidos endocíticos, proceso en el cual se ven involucradas las hidrolasas lisosomales. Una vez que se ha internalizado la proteína, esta viaja a través de medios cada vez más ácidos desde los endosomas tempranos hasta los tardíos y luego a los lisosomas. La mayoría de las moléculas clase II están localizadas en la célula dentro de los compartimientos denominados compartimientos MHC clase II, ácidos y ricos en heterodímeros clase II y en moléculas DM, a donde llegan los antígenos por medio del receptor de membrana. Enseguida, otras vesículas se encargan de transportar los complejos clase II hacia la superficie de la célula (Cresswell P, 1994; Weenink SM y Gamautam AM 1997) Genes del MHC asociados a enfermedades autoinmunes y reumáticas sistémicas. La motivación para los estudios de asociación entre el HLA y las enfermedades de origen autoinmune y particularmente reumáticas sistémicas ha sido la mejor comprensión de nuestro conocimiento general sobre la susceptibilidad conferida por el HLA al desarrollo de estas enfermedades. Este conocimiento ayudará en la práctica clínica al diagnóstico, categorización y predicción de las complicaciones de este tipo de enfermedades. Estudios iniciales entre las poblaciones de pacientes con ACJ, determinaron que el perfil de los antígenos del MHC era diferente al que se presentaba entre adultos con AR y controles sanos (Fink CW, et al 1995). A partir de ese momento se han realizado diferentes esfuerzos por tratar de identificar genes y polimorfismos específicos del HLA que predisponen al desarrollo de la ACJ. Diferentes estudios 23

24 apoyan la asociación entre ciertas formas de ACJ y genes del MHC (veáse Cuadro 1). La ACJ tiene un fondo genéticamente diferente a lo que se observa en el adulto, en la mayoría de los casos de ACJ los marcadores de susceptibilidad del MHC no residen en el mismo haplotipo. En la ACJ de inicio pauciarticular que en su evolución cursa bien sea como enfermedad poliarticular o pauciarticular la asociación mayor es con DPB1*0201 y DPB1*0301, en el caso de la evolución poliarticular con presencia de factor reumatoide positivo. Otros estudios han establecido asociación con DR8 y DR5. El alelo DR8 es usualmente ligado al alelo DQB. El locus DQ puede modular la enfermedad, estableciéndose la asociación de DQA1*0101 con la presencia de artritis erosiva y uveítis crónica otros alelos involucrados son: DQA1*0401, 0501, 0601, 0103 y en DQB1*0301, 0402 y La baja frecuencia de los alelos DR4, DR2 y DR7 en la variedad pauciarticular parece jugar un papel protector al desarrollo de la enfermedad. En la ACJ de inicio poliarticular con factor reumatoide negativo, existe una baja frecuencia de DR4 y en contraste frecuencia incrementada de DR5, DR6, DR8. Dentro de este grupo de inicio oligoarticular con factor reumatoide negativo con características clínicas similares a la AR del adulto con FR positivo, adquieren particular importancia los alelos DR1 y DR4 sin embargo DR8 (DRB*0801) es más frecuente. En el grupo de ACJ poliarticular con FR positivo, que clínicamente es muy similar a la enfermedad del adulto el DR4 es común (hasta el 60% de los casos) con frecuencia incrementada del DRB1*04. Finalmente en la variedad sistémica las asociaciones con los genes del MHC-HLA son variables, destacando 24

25 la presencia del DR4, en la población con enfermedad severa (Murray KJ 1999, Oen K 1998). Sin embargo, a pesar de las posibles asociaciones del HLA y la susceptibilidad al desarrollo de los diferentes subtipos de ACJ es importante tomar en cuenta: primero, que la definición de los criterios de inclusión varía ampliamente entre los diferentes estudios; segundo, las variabilidades étnicas y geográficas de los pacientes y sus controles; tercero, la tipificación de los genes del HLA ha evolucionado y sufrido cambios importantes en la última década. Esto último va desde la capacidad inicial de tipificar sólo antígenos de clase I por serología, progresando a la tipificación serológica de los antígenos de clase II, más adelante a la tipificación celular utilizando cultivos mixtos de linfocitos, para llegar a las más recientes técnicas basadas en abordaje molecular a partir del ADN (Terasaki PI, et al 1978; Erlich HA, et al, 1991; Bidwell J, 1994). 25

26 Cuadro 1. Artritis crónica juvenil. Subgrupos clínicos y asociaciones con el MHC-HLA*. Subtipo de ACJ (variedad clínica) Asociación con HLA (susceptibilidad) Asociación con HLA (protección) Oligoarticular DQA1*0401, 0601 DQB1*0301, 0402 DRB1*07 DQA1*0201 DRB1*08, 11 Poliarticular, FR negativo, Aan positivos Poliarticular, FR negativo, Aan negativos Poliarticular, FR positivo DRB1*11, DQA1*0101,0102 DRB1*14 DQB1*0301, 0302 DRB1*04 DQB1*0301,0302,0402 Sistémica ( de inicio) DRB1*0401 DRB1*13 DQA1*0103,0201,0501 DQB1*0603 Sistémica (evolución) DQB1*0301, 0303 DRB1*13 * Prieur AM et al. 12 Taller Internacional de Histocompatibilidad (1996). Abreviaciones: FR (factor reumatoide), Aan (anticuerpos antinucleares). 26

27 Importancia del estudio molecular del MHC clase II. Métodos de tipificación del HLA. Las moléculas de clase II del MHC son participantes claves de los eventos de activación inmune en la autoinmunidad, así como en la respuesta inmune normal. Los polimorfismos entre los alelos de las moléculas clase II resultan cruciales en al menos dos eventos de la activación inmune: primero, el polimorfismo de los aminoácidos de las moléculas clase II determina la especificidad o no de los péptidos antigénicos que serán presentados sobre la superficie de la célula presentadora de antígenos al receptor de la célula T. Segundo, este polimorfismo regula el desarrollo de la selección de la especificidad al receptor de la célula T durante el proceso de diferenciación y maduración de la célula T en el timo. Es a partir de estos dos eventos básicos que las moléculas clase II del MHC controlan los aspectos de competencia inmune y activación periférica (Abbas AK, 1999). En las moléculas clase II del MHC localizadas en el brazo corto del cromosoma 6, la metodología utilizada en su identificación sólo determina regiones del exón 2, que son los determinantes del polimorfismo (Olerup O et al, 1992, 1993). Novedosas metodologías moleculares en la tipificación del polimorfismo de proteínas clase II del MHC, representan un avance en términos del costobeneficio. Por otro lado, el polimorfismo de los genes clase II depende principalmente de las regiones DRB, -DQA, -DQB. Regiones que se han visto asociadas a un incremento en el riesgo relativo de un gran número de enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica progresiva) que tienen alta prevalencia en la población 27

28 (Nepom GT, 1991). La identificación de moléculas DQA y DQB particularmente, es útil como referencia para estudios poblacionales, y el trasplante de tejidos. Métodos de tipificación del HLA. En las últimas dos décadas, la tipificación del HLA se ha hecho más sofisticada, esto es particularmente importante desde el advenimiento e introducción de técnicas de biología molecular para la discriminación entre los genes del HLA clase II estrechamente relacionados. Los avances en la metodología de la tipificación han permitido identificar haplotipos específicos y en algunos casos genes individuales que asocian al HLA con las enfermedades autoinmunes (Nepom y Erlich, 1991). En el curso de la historia de la tipificación de los genes del HLA se han utilizado métodos serológicos, bioquímicos, de reconocimiento de los linfocitos T, siendo en la actualidad reemplazados por la tipificación del ADN. El espectacular avance en el desarrollo de métodos moleculares de tipificación del HLA basados en la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha llevado a clarificar la diversidad de los alelos y haplotipos relacionados. Entre los métodos moleculares de detección del HLA destacan, los polimorfismos de longitud con enzimas de restricción (RFLP s), adoptada ampliamente en 1988, sin embargo desplazados actualmente por métodos de PCR (Bidwell 1994). Los métodos que emplean la técnica de la PCR, son: 1) La tipificación a partir de secuencias específicas de oligonucleótidos (PCR-SSO). Este procedimiento implica la hibridización de un panel de secuencias específicas de primers (SSP) dirigidas a secuencias blanco de productos de ADN amplificados por PCR. Las secuencias blanco son normalmente amplificadas a partir de exones polimórficos 28

29 de los genes del HLA (el exón 2 para los genes HLA clase II). Esta metodología del PCR-SSO para HLA ha sido implementada y estandarizada desde ) Técnicas basadas en electrofóresis incluyen: a) el análisis de productos de PCR por RFLP s, que utiliza un panel de endonucleasas de restricción que digieren los productos amplificados por la PCR previo al análisis por RFLP en gel de agarosa o acrilamida. b) PCR de un paso con primers de secuencias específicos (PCR-SSP), método que deriva de los sistemas de amplificación de productos de mutación refractarios y que ha sido particularmente apropiado para su aplicación en la tipificación de transplante de órganos de donadores cadavéricos, dado que es una prueba rápida (dos horas) (Ota M et al, 1991; Olerup O et al, 1992, 1993). Una derivación de esta prueba de PCR-SSP es la denominada PCR-SSP anidada. 3) Análisis conformacionales, al final de cada ciclo de PCR un proporción del ADN generado puede existir en forma no-homoduplex, bien sea de cadena sencilla o de doble cadena, estos artefactos producidos en el realineamiento del proceso de la PCR posee formas conformacionales que son específicas para alelos individuales o haplotipos del HLA. Muchos de estos métodos utilizados en la tipificación de los genes clase II del HLA permanecerán probablemente como herramientas de referencia o investigación, algunos de estos incrementaran su filtración hacia los escenarios clínicos en la forma de reactivos o equipos. La contribución del avance en los nuevos métodos en la tipificación molecular del HLA tanto a la histocompatibilidad como a la inmunogénetica, tanto en el nivel básico como en el clínico, continúa siendo notable y muy importante. 29

30 Planteamiento del Problema El advenimiento y desarrollo de la metodología molecular en la identificación y tipificación de los alelos de los genes del MHC, particularmente aquellos relacionados a la clase II, representa un avance importante en la búsqueda de una asociación con susceptibilidad a la expresión clínica de diversas enfermedades. De las enfermedades relacionadas al HLA destacan las de origen autoinmune y en particular las enfermedades reumáticas sistémicas. La ACJ constituye una de estas últimas enfermedades, donde dada la diversidad de síndromes clínicos en que se manifiesta y la controversia en relación con diferentes alelos de los genes clase II del HLA resulta de interés describir las frecuencias alélicas de dichos genes en particular en nuestra población de pacientes con ACJ. Por otro lado, hasta donde se tiene conocimiento no existen estudios que describan la frecuencia de alelos de genes clase II del MHC en población mexicana con ACJ, cuando estos genes son tipificados utilizando métodos moleculares. De ahí nuestra pregunta: cuál es la frecuencia de los alelos de los genes clase II del MHC en pacientes mexicanos con ACJ? 30

31 Justificación La utilización de métodos moleculares en la determinación de alelos de los genes del MHC, representa avances en la sensibilidad para identificar variaciones de secuencias y disminuir significativamente las reacciones cruzadas entre los alelos. Es por ello que actualmente se han adoptado cada vez con mayor aceptación técnicas de ADN para el análisis de estos genes. Estudios moleculares de la frecuencia de genes clase II del MHC, particularmente los sitios HLA-DQA, -DQB en pacientes con ACJ son necesarios para tratar de establecer posibles diferencias entre los diversos síndromes clínicos en los que se expresa esta enfermedad. Finalmente, se desconoce la epidemiología molecular de los genes clase II del MHC entre pacientes con ACJ y cuál es el peso que los factores de tipo inmunogenético juegan en la expresión de esta artropatía en nuestro medio. Conociendo más acerca de la participación de genes del HLA en la expresión de enfermedades como la ACJ, tendremos oportunidad de acercarnos a comprender cómo un huésped susceptible en asociación con factores ambientales y otros desconocidos desarrolla esta enfermedad, que tiene un impacto directo en diversas áreas del desarrollo de un individuo. 31

32 Objetivos El objetivo general esta tesis es el de Identificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores de secuencias específicos (SSP) y polimorfismos de longitud mediante enzimas de restricción (RFLP) los alelos correspondientes a los genes de las moléculas clase II del sistema HLA (locus DQA y DQB) en pacientes con artritis crónica juvenil. Teniendo como objetivos particulares: Determinar la frecuencia alélica de los genes clase II del MHC (HLA -DQA, - DQB) en pacientes con artritis crónica juvenil. Comparar las frecuencias alélicas obtenidas de la población de pacientes con artritis crónica juvenil con aquellas referidas a la población general. Estimar los riesgos relativos para el desarrollo de la ACJ de los alelos de los genes clase II del MHC. Desarrollar la metodología molecular en la tipificación de los genes clase II del MHC. 32

33 Material y Métodos Tipo de estudio: Transversal, descriptivo, analítico. Universo de estudio: Pacientes con diagnóstico de ACJ. Sujetos sanos como controles de comparación. Criterios de Inclusión: Pacientes con diagnóstico de ACJ, evaluada en base a los criterios del Colegio Americano de Reumatología 1987 (Cassidy JT, et al 1986) y que voluntariamente acepten participar en el estudio. Criterios de no inclusión: Pacientes con manifestaciones articulares que no reúnan criterios de diagnóstico de ACJ. Criterios de exclusión: Casos en los que no se obtengan los datos clínicos completos o no se pueda obtener una tipificación completa. Tamaño de la muestra: Un tamaño de muestra considerado como mínimo para estimar correctamente alelos con frecuencia mayor al 5% es de 60 cromosomas, lo que equivale a estudiar a 30 individuos (Chakraborty R, 1992a). Pacientes. En todos los casos, se solicitó el consentimiento informado para participar en el estudio en forma voluntaria de parte de los pacientes y en caso de ser menores de edad se sometió a consideración del padre o tutor (veáse Anexo 2). La población de estudio incluyó 40 pacientes de los servicios de consulta externa de Reumatología, del Hospital General de Occidente de la Secretaría de Salud, del OPD Hospital Civil de Guadalajara Fray Antonio Alcalde y Juan I. Menchaca así como del Departamento de Pediatría del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social, que reunían los criterios 33

34 del Colegio Americano de Reumatología para ser considerados como portadores de ACJ (Cassidy JT et al, 1986). El cuadro clínico de presentación inicial se clasificó de acuerdo a: oligo/pauciarticular (<4 articulaciones afectadas), poliarticular (4 ó más articulaciones afectadas) y sistémica (Anexo 3). Se registraron datos demográficos, incluyendo (edad, sexo, escolaridad, estado socio-económico), edad de inicio, tiempo de diagnóstico y seguimiento, datos clínicos extrarticulares, índice de actividad articular (adaptado de los índices utilizados para pacientes adultos con AR, aprobados por el ACR), evaluación serológica (velocidad de sedimentación globular VSG-, proteína C reactiva, FR- IgM por método de látex y nefelometría, anticuerpos antinucleares) y evaluación radiográfica de procesos erosivos. Se incluyeron individuos sanos como controles sin historia familiar de artritis u otras enfermedades de origen autoinmune. 34

35 Descripción general de la metodología utilizada. Diagrama de flujo. Extracción de ADN Cuantificación y Dilución del ADN Tipificación molecular (PCR-SSP o RFLP) Electroforesis Tinción (bromuro de etidio), fotografía Análisis e interpretación de resultados 35

36 Técnicas de laboratorio. Obtención de ADN total a partir de leucocitos de sangre periférica. La muestra de sangre periférica fue recolectada en tubos con EDTA como anticoagulante, a partir de lo cual se extraen leucocitos. Para la extracción del ADN, se utilizó uno de los dos métodos, a) método de DTAB-CTAB (Gustincich S y cols. 1991) también conocido como micrométodo y que brevemente consiste en: una vez obtenida la sangre periférica (500 µl microlitros-), se procede a incubar con amortiguador de lisis DTAB a 65ºC por 5 min, para añadir 500 mcl de cloroformo al 100% y proceder a agitación; centrifugación posterior a 13,000 rpm durante 10 min. Se obtiene la fase superior y se añaden 900 mcl de dh20 y 100 mcl de CTAB al 5%, se mezcla y se centrífuga 5 min a 10,000rpm. Se procede a resuspender en 300 mcl de NaCL 1.2 M y se añaden 600 mcl de etanol al 100%, centrífugando 5 min. a 10,000 rpm. Finalmente se elimina el sobrenadante y se lava con etanol al 70%, resuspendiendo el amortiguador de conservación y almacenando durante 6-12 meses a -20ºC. b) método de fenol-cloroformo o macrométodo, una vez separados los leucocitos (que pueden ser preservados a -20ºC, por máximo un mes), se incuba 10 min, a 37ªC con NaCl O4 3.5M. Se añade fenol/tris y una solución de alcohol isoamílico-cloroformo 24:1. se mezcla y se centrífuga, recuperando el sobrenadante. Se agrega nuevamente solución de alcohol-cloroformo 24:1 se mezcla y se centrífuga. se recupera el sobrenadante y se agrega etanol frío al 100%. se procede a recuperar el ADN y lavar con etanol al 70%. Finalmente se resuspende en amortiguador de conservación y se pude almacenar durante meses (veáse Anexo 4). 36

37 El ADN obtenido se cuantifica en cuanto a su concentración por espectrofotometría y su calidad se valora mediante geles de agarosa (veáse Anexo 4 y Figura 3). Genotipificación de alelos HLA clase II, DQ mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR-. La determinación del polimorfismo alélico de los genes HLA clase II, -DQA1 y -DQB1 se realizó por el método de amplificación de la PCR utilizando oligonucleótidos para secuencias específicas (PCR-SSP) y técnicas de RFLP (polimorfismos de longitud mediante enzimas de restricción). En estas técnicas, la asignación de alelos se basa, respectivamente, en la presencia o ausencia de productos amplificados y en la combinación de sitios positivos a enzimas de restricción y la observación de los fragmentos de diferente longitud. La identificación se hace en electroforesis en geles de agarosa. Los SSPs y RFLPs utilizados fueron obtenidos del informe de Olerup O, et al Técnica de Primer Secuencia Específico (PCR-SSP). En este método se utilizan oligonucleótidos (iniciadores) altamente específicos que amplifican el exón 2 de los genes DQA1, DQB1 del sistema HLA e identifican un alelo o grupo de alelos. La asignación de alelos esta basada en la presencia o ausencia del producto amplificado. Para descartar problemas en la amplificación de productos, este método incluye el uso de un par de iniciadores que amplifican una región del intrón 3, que debe estar presente en todos los individuos y este es el control positivo de 37

38 la amplificación. Las condiciones completas del procedimiento de amplificación y su detección se detallan en el Anexo 4. Técnica de PCR-RFLP. Para distinguir los alelos HLA-DQB1*0302 del *0303 se amplifica un segmento de 237 pb del exón 2. El segmento amplificado se sometió a digestión con enzimas de restricción HpaII y Hsp921. Consideraciones éticas. El proyecto fue previamente evaluado y aprobado por el Comité de Investigación y Etica del Hospital General de Occidente de la Secretaría de Salud en Guadalajara, Jal. Todos los participantes del mismo fueron detenidamente informados del proyecto y su realización aceptando colaborar en forma voluntaria. El consentimiento por escrito fue obtenido antes de la toma de muestra sanguínea (Anexo 2). Manejo estadístico de los datos. Las variantes cuantitativas se esperan con una distribución normal, por lo que se utilizarán métodos paramétricos en su análisis (comparaciones de medias, ANOVA). Las variables categóricas se estudiarán mediante las pruebas de Chi cuadrada y exacta. En la medida en que el número de casos lo permita, se estratificará la población de enfermos para el análisis respectivo. La base de datos y su procesamiento se llevó a cabo utilizando el software SPSS para Windows versión 8.0 (Chicago, IL. EUA.) 38

39 Resultados Características demográficas y clínicas de los pacientes. La edad promedio de los 40 pacientes con ACJ estudiados fue de 16 años (rango 5-25 años) de los cuales 23 fueron mujeres (61%) y el resto hombres (39%). En la mayoría de los pacientes a media de duración de la enfermedad fue de 5 años ó más, siendo la edad de inicio de la enfermedad en promedio a los 10 años (rango 2-15 años). Las variedades clínicas en las que fueron clasificadas se aprecian en el cuadro 2. El número promedio de articulaciones inflamadas al momento de la evaluación clínica fue de 6±7. Otros datos clínicos y de laboratorio incluyen: historia de fiebre en 11/38 (29%), historia del eritema en 6/38 (16%), presencia de nódulos reumatoides en 8/38 (21%), evidencia de iridociclitis en 2/38 ( 5%). La presencia de factor reumatoide en 10/38 (26%), positividad para la prueba de la proteína C reactiva en 33/38 (87%) y anticuerpos antinucleares presentes en 14/38 (37%), siendo el patrón de fluorescencia más frecuente el moteado fino (11/38). Como parte del tratamiento una mayoría de pacientes se encontraba recibiendo alguno de los medicamentos inductores de remisión de la enfermedad (28/38) y el uso de esteroides en diferentes dosis fue documentado en 11/38 (29%) pacientes. Grupo Control. Como grupo control se incluyeron 54 individuos que procedían de familias mestizas, aparentemente sanos participantes de un protocolo de tipificación de polimorfismos del MHC en población general (Cortés-Prieto L, 1999, Cortes LM, et al 2004). Todos estos individuos fueron no relacionados entre sí o no existía historia de consanguinidad. 39

40 Cuadro 2. Datos demográficos, de laboratorio y clínicos de la población de pacientes con artritis crónica juvenil Género femenino 61% Edad al momento del estudio* 16±5 Edad de inicio* 10±4 Duración de la enfermedad* 5±5 Número articulaciones Inflamadas* 6±7 Variedades clínicas: Oligoarticular tipo I n (%) 7 (18%) Oligoarticular tipo II 10(26%) Poliarticular seropositiva 10(26%) Poliarticular seronegativa 7(18%) Sistémica (Still) 4(11%) Serología Factor reumatoide+ (positivo) 10/38 (26%) Proteína C reactiva (positiva) 33/38 (87%) Anticuerpos antinucleares 14/38 (37%) Especificaciones: * promedios ± desviación estandard; +nefelometría, título >20U/ml; nefelometría, título >0.8mg/L; inmunofluorescencia indirecta células HEp-2, título >1:40; ± desviación estándar. 40