MICROTÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN GEL

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1 MICROTÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN GEL FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS BÁSICAS T.H. Jorge GOLFFED Asesoría Técnica: T.H. Martín GULARTE T.H. Mariana LÓPEZ Presentación: Dr. Andrew MILLER Dra. Lourdes Viano T.H. Danielle WIKMAN 2

2 PRÓLOGO La microtécnica de aglutinación en gel representó un avance cuántico en cuanto a la inmunohematología. En una época en la cual las enfermedades transmisibles dominaban el interés de quienes trabajaban en Medicina Transfusional, ésta técnica vino a centrar nuevamente la atención en la inmunohematología: centro focal de la transfusión de sangre. La rapidez, facilidad de empleo y sensibilidad de la microtécnica de aglutinación en gel permiten resolver las complejas situaciones planteadas en pacientes que presentan aloinmunización antieritrocitaria y requieren soporte transfusional o cursan un embarazo. No obstante, la microtécnica en gel requiere aplicar cuidadosamente los procedimientos recomendados a los efectos de obtener resultados confiables y reproducibles. El autor proporciona rica información de la microtécnica en gel, recogida de su práctica de largos años utilizando la misma y aporta la valiosa experiencia de numerosos autores y especialistas tanto nacionales como internacionales. El lector encontrará en ésta publicación un material de lectura muy interesante para el aprendizaje y para usar como referencia obligada en la práctica diaria. Felicitamos a Jorge Golffed por el esfuerzo desplegado y su preocupación por compartir con los demás colegas del medio los secretos del arte de una actividad tan fascinante como lo es la inmunohematología. Dr. Andrew MILLER Jefe del Laboratorio de Inmunohematología Servicio Nacional de Sangre Administración de Servicios de Salud del Estado Montevideo - Uruguay 3

3 En memoria de mi querido viejo: José Golffed. ( ) 4

4 PREFACIO El presente trabajo es un material de divulgación científica de la microtécnica de aglutinación en gel de DiaMed (MTS: Micro Typing System) realizado sin fines de lucro para el autor. Se trata de una técnica revolucionaria para el trabajo diario en los Servicios de Inmunohematología y Bancos de Sangre. Sencillez, comodidad, rapidez y exactitud son algunos de los tantos atributos que merece este método de trabajo. Casualmente el próximo año, Saiden S.A. (importador para nuestro país) cumple 20 años de representación de DiaMed ID en Uruguay. Este material lleva dormido algunos años en mi escritorio. Escribir es apasionante, pero consume algo muy valioso: el tiempo. Tiempo que se le quita a la familia, y aún consciente de ese delito, seguí adelante con este proyecto. El Laboratorio de Inmunohematología del Servicio Nacional de Sangre realiza más de 3000 estudios por microtécnica de aglutinación en gel por año, habiendo comenzado a trabajar en ella en el año 1995, lo cual lo convierte sin lugar a duda en el Centro Nacional de Referencia. Nada de este material que llega a la colectividad técnica de Hemoterapia sería posible sin el apoyo que me brindaron la Dirección del Servicio Nacional de Sangre en la persona de la Dra. Lourdes Viano, el Jefe del Laboratorio de Inmunohematología, Dr. Andrew Miller; la tolerancia y paciencia de tres notables técnicos como los son T.H. Martín Gularte, Mariana López y Danielle Wikman quienes no escatimaron de su valioso tiempo y conocimientos para conmigo. Mi reconocimiento al Sr. Gustavo Buela (por Saiden S.A.) por su apoyo en este proyecto y al Sr. Ricardo Mendillo (representante de DiaMed ID 5

5 Argentina por permitirme nombrar la marca del producto y autorizarme a reproducir fotografías de insumos y aplicación de las técnicas. No por último y menos importante, deseo agradecer de corazón a mi esposa, por haberme acompañado en este emprendimiento literario. Fue en el año 1992 cuando escribí el Manual de Técnicas Básicas en Hemoterapia el cual comprenderá el lector, trataba de técnicas convencionales en el material de esa época, vigentes aún. En ese año nacía mi primera hija, Natalie a quien le dediqué el libro y quien hoy con 22 años de edad es quien ha compaginado, editado y traducido del inglés al español buena parte del material que se presenta en este trabajo. Lo más sorprendente para mí fueron los tropiezos de pasar de una máquina de escribir a un ordenador personal, pero con ayuda de Lucía (mi segunda hija de 10 años) y sus conocimientos de computación, todo fue mucho más ameno y sencillo. A ambas cómplices : gracias por su constante apoyo. A todos ellos y a ustedes, gracias por el tiempo dispensado. T.H. Jorge GOLFFED Montevideo Julio

6 Un libro abierto es un cerebro que habla; cerrado, un amigo que espera; olvidado, un alma que perdona; destruido, un corazón que llora. Proverbio hindú. 7

7 MICROTÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN GEL. FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS BÁSICAS. INTRODUCCIÓN. El método tradicional de evidenciar la interacción entre anticuerpos de grupos sanguíneos y sus respectivos antígenos en los hematíes es la reacción de aglutinación, sea esta en medio salino, macromolecular, de baja fuerza iónica, a diferentes temperaturas con hematíes tratados o no por enzimas proteolíticas y por pruebas con el suero antiglobulina humana. Durante décadas y hasta nuestros días, estos ensayos se realizaron en tubos de vidrio o de material plástico descartable. El punto cúlmine de aquellas pruebas radica en la lectura e interpretación de las mismas. Más aún, en caso de pruebas débiles la interpretación es de apreciación subjetiva aún en manos de profesionales expertos. La lectura de una prueba que para un técnico era calificada como débil, para otros era interpretada como negativa. Ahora bien: qué ocurre a la hora de dificultades en la interpretación? Fue así que en la década de los 80, el Dr. Yves Lapierre desarrolla y patenta el método de hemaglutinación en gel, el cual fue comercializado por la empresa Diamed-Suiza a partir del año DiaMed Suiza fue fundada en 1977 por un pequeño grupo de expertos en diagnóstico de laboratorio para el desarrollo y fabricación de sistemas de prueba destinada a proporcionar a los laboratorios la facilidad de uso, seguridad y fiabilidad. En el año 2007 Bio-Rad Laboratories, una empresa multinacional vinculada a la investigación biológica fundada en 1952, adquiere el paquete accionario de DiaMed Holding AG. En el Uruguay DiaMed hizo su arribo en el año 1995 a través de su representante Saiden S.A. 8

8 El Sistema DiaMed de Micro Tipificación en Gel revolucionó el trabajo en los laboratorios de inmunohematología de los grupos sanguíneos. Ha sido desarrollado tanto para la determinación de grupo sanguíneo, investigación, identificación, titulación de anticuerpos irregulares y pruebas de compatibilidad sanguínea pretransfusionales en un nuevo formato cuya lectura no admite dudas de interpretación y más aún permite nuevas lecturas hasta 48 horas después de la ejecución de la prueba. El catálogo ID-System de Bio-Rad reúne 65 variedades de tarjetas de gel con una gama que abarca la determinación de grupos sanguíneos ABO y Rh D para donantes, pacientes y recién nacidos, prueba inversa, fenotipo Rh, Kell, antígenos simples, test de coombs directo, investigación e identificación de anticuerpos irregulares, pruebas de compatibilidad y estudios en medio enzimático entre otras aplicaciones. 9

9 PRINCIPIO DEL MÉTODO. La prueba se basa en la exclusión en base al tamaño de los elementos reactantes que tiene lugar en el seno de una matriz inmunológicamente inerte. El ID MICROTYPING SYSTEM DE DIAMED incorpora dentro de la columna de gel el reactivo conteniendo: un anticuerpo específico, NaCl o suero antiglobulina humana. Los hematíes sensibilizados reaccionan con el antisuero específico durante la centrifugación dejando los líquidos reactantes (incluyendo cualquier globulina no fijada) en la cámara de reacción. Solamente los hematíes ingresan en la matriz de gel. Los hematíes no sensibilizados, en la fase de centrifugación de la prueba, forman un punto o botón en la base del microtubo en tanto que aquellos que hayan sido aglutinados se distribuirán a lo largo de la columna de gel. Según sea la intensidad de la reacción, los hematíes podrán ocupar la parte superior de la columna de gel o dispersarse a lo largo de la misma. A continuación se presenta una microfotografía de reacciones de aglutinación de hematíes en gel de Sephadex (cortesía de DiaMed-ID). 10

10 FORMA DE LOS MICROTUBOS. Los microtubos están incorporados en una pieza integral de 70 milímetros de largo por 53 milímetros de alto, denominada tarjeta (ID-Card). La extremidad superior de los mismos es ancha (4 milímetros de diámetro) de manera tal de permitir en él la incubación de los reactantes. Al extremo superior se lo conoce también como CÁMARA DE REACCION. La parte intermedia o COLUMNA, es larga y estrecha, lo cual permite en la fase de centrifugación un contacto prolongado de los hematíes con el gel. 11

11 El fondo del microtubo tiene aspecto CÓNICO. Cuando los hematíes atraviesan la columna de gel durante la fase de centrifugación forman un punto en el fondo del mismo según sea el gradiente de aglutinación. ASPECTO DE LA TARJETA COMPOSICIÓN DEL GEL. El gel utilizado es el SEPADEX G ultra fino y se presenta en tres modalidades básicas: GGGGGGG GEL NEUTRO. GEL ESPECÍFICO. GEL ANTIGLOBULINA HUMANA. 12

12 COMPOSICION DEL GEL NEUTRO Sin antisuero específico. Contiene NaCl. ESPECÍFICO Mezcla de gel y antisuero específico. GEL ANTIGLOBULINA HUMANA Mezcla de gel y suero antiglobulina humana. 13

13 VOLÚMENES A DISPENSAR ID-PIPETOR FP-4 Se trata de volúmenes de suspensiones de hematíes y plasma (o suero) muy pequeños dispensados por pipetas que descargan volúmenes prefijados. 50 µl de suspensión de hematíes y 25 µl de suero o plasma. En las tradicionales pruebas en tubo, el volumen de suero o plasma a utilizar es de 2 gotas dispensadas por pipeta Pasteur (lo que equivale a 100 µl), en tanto que para esta microtécnica se necesitan solamente 25 µl. En el sistema ID es importante la máxima precisión en el pipeteo. Se respetará rigurosamente el orden para dispensar los reactantes: en primer lugar sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45 y con el puntero apuntando a la pared lateral del microtubo, se verterán 50µl de la suspensión de hematíes (previamente preparada en el diluyente que corresponda) y en segundo lugar, manteniendo la pipeta en posición vertical y próximo a la boca del microtubo, se verterán 25 µl del suero o plasma en estudio. 14

14 CONDICIONES DE INCUBACIÓN. Aquí se aprecia el incubador seco de tarjetas, en el cual las ubicamos cuando la temperatura requerida de la reacción sea de 37 Celsius. El tiempo de incubación es de 15 minutos. CONDICIONES DE CENTRIFUGACIÓN. La centrifugación debe ser constante a 85g durante 10 minutos, siendo éste un paso crítico en la técnica. 15

15 Una vez finalizada la misma, la lectura macroscópica permite distinguir todo el rango de aglutinaciones: desde los resultados negativos (-) hasta toda la variedad de resultados positivos que se expresan en forma de cruces según su intensidad en: 1+,2+,3+,4+ y dp (doble población). Un exceso o un defecto en la fuerza g aplicada arrojará resultados falso negativo o falso positivo respectivamente. Dado que la fuerza g se expresa en rpm (revoluciones por minuto) y que disponemos de centrífugas con cabezales para 6,12 y 24 tarjetas, las rpm varían para cada equipo, a saber: EQUIPO CABEZAL RPM ID-CENTRIFUGE 6 S 6 TARJETAS 1175 ID-CENTRIFUGE 12 II 12 TARJETAS 1030 ID-CENTRIFUGE 24 S 24 TARJETAS 910 VENTAJAS DE LA MICROTECNICA ID-Card Se trata de una técnica estandarizada en sus procedimientos lo cual conduce a reacciones e interpretación de los resultados en forma OBJETIVA. La prueba de Coombs, sin necesidad de realizar los lavados (que si requiere si se hiciera en la clásica prueba en tubo ) disminuye las posibilidades de errores técnicos y aumenta la sensibilidad de la prueba. Por qué no se lavan los eritrocitos, previo a la fase de Coombs? La técnica de gel tiene la capacidad de separar los hematíes del fluido que lo rodea. Durante la centrifugación de la tarjeta, los hematíes son removidos fuera de la suspensión por acción de la fuerza centrífuga e ingresan al gel, en tanto que las inmunoglobulinas no conjugadas permanecen sobre el gel. En forma simultánea se pueden procesar gran cantidad de muestras y por tratarse de una microtécnica se utilizan pequeños volúmenes de reactantes. La lectura de las pruebas se realiza en forma MACROSCÓPICA y también pueden ser leídas por lectores automáticos. 16

16 Cada tarjeta de gel tiene en su reverso un código de barras para su identificación. Si bien la macrolectura es posible, un lector automático y con un software especial, permite visualizar en pantalla los resultados y también transcribirlos a una impresora con lo cual acotamos los errores administrativos. Banjo ID- Reader Este equipo permite leer e interpretar las reacciones de las tarjetas ID-Cards proyectando imágenes claras de los resultados de las pruebas en el monitor. A su vez los resultados pueden ser validados, almacenados, imprimirse y enviarse a la computadora. 17

17 PATRONES DE LECTURA REACCIÓN 4+ Las células rojas aglutinadas forman una banda sólida en la parte superior del gel. REACCIÓN 3+ Las células rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y se concentran en el tercio superior de la columna de gel. REACCIÓN 2+ Las células rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y se las observa ocupando toda su longitud. REACCIÓN 1+ Las células rojas aglutinadas se dispersan por el gel y se concentran en el tercio inferior del microtubo. 18

18 REACCIÓN NEGATIVA Todas las células rojas atraviesan el gel y forman un botón celular bien definido en la base del microtubo. DOBLE POBLACIÓN. La reacción de doble población también conocida como campo mixto se caracteriza por una banda de células rojas aglutinadas en la parte superior de la columna de gel en tanto que las células no aglutinadas se depositan en el fondo del microtubo. Un ejemplo de doble población se observa en detalle en la tarjeta de la página 22. A continuación presentamos una fotografía tomada a una tarjeta, capturando algunos de los diferentes patrones de lectura arriba detallados. En la tarjeta apreciamos de izquierda a derecha las siguientes lecturas: Microtubo #1: reacción 4+ Microtubo #2: reacción 3+. Microtubo #3: reacción 2+ Microtubo #4: reacción

19 Microtubo #5: reacción negativa Microtubo #6: reacción negativa. OTRAS CONSIDERACIONES. Coágulos, fibrina, detritus y otros artefactos pueden atrapar hematíes en la parte superior del gel, induciendo a lecturas e interpretaciones erróneas. Por tal motivo se solicita que las muestras a analizar sean extraídas mediante una correcta técnica (exenta de hemólisis) en tubos con EDTA (de preferencia). El EDTA es una solución de sales sódicas y potásicas que se comportan como poderosos anticoagulantes ya que inhiben la participación del ión Ca++ en la cascada de la coagulación de la sangre. También se lo conoce como secuestreno dado que actúa secuestrando al ión Ca++. PLASMA O SUERO? : IMPORTANCIA DEL COMPLEMENTO. Si bien las instrucciones de trabajo impartidas en los insertos de las diferentes ID-Cards dan por indistinto el uso de suero o plasma, sabido es que el Complemento es necesario para la reacción de algunos anticuerpos poco frecuentes. El Complemento se conserva en cantidades suficientes cuando la muestra de suero es mantenida a 4 C durante dos semanas, pero en pacientes, la conservación es variable y debe considerarse siempre inferior. Por lo general se recomienda un tiempo que no exceda las 72 horas de extraída la muestra (habiendo separado hematíes del suero por centrifugación) y si el estudio se realizare más allá de ese tiempo, la muestra de suero debe congelarse en alícuotas a -30 C durante un plazo no superior a los tres meses. Se debe utilizar suero en lugar de plasma por el hecho de que se requieren iones Ca++ y Mg++ para que intervengan como catalizadores de la cascada de activación del Complemento. La lisis inmunológica de los hematíes es signo de la presencia de aloanticuerpos, por lo tanto el suero a analizar ha de estar libre de hemoglobina. En caso de que la presencia de hemoglobina libre en el suero en estudio sea inevitable, se debe comparar el color sobrenadante de la prueba con el color presente en el suero problema separado inicialmente de los hematíes. 20

20 Se desaconseja la congelación y descongelación de sueros, dado que durante esa práctica, se destruyen proteínas e inmunoglobulinas. Por tal motivo, se sugiere conservar los sueros en estudio en forma de alícuotas congeladas. DILUYENTES. Diluyente 1: ID-Diluent 1 es una solución de bromelina modificada, con actividad enzimática estabilizada por un prolongado período. Se la utiliza para preparar suspensiones de hematíes destinadas a la determinación de grupos sanguíneos en tarjetas de gel con reactivo de origen humano y como aditivo para pruebas enzimáticas con hematíes no tratados para detección de anticuerpos y pruebas de compatibilidad. Las enzimas proteolíticas modifican los antígenos eritrocitarios con lo que aumentan la reactividad de algunos sistemas de grupo sanguíneo (en especial los del sistema Rh), aunque suprimen otros como los antígenos de los sistemas MNSs, Duffy y Xg. Las enzimas más utilizadas en la serología de grupos sanguíneos son la papaína y la bromelina. 21

21 La papaína suele emplearse para el tratamiento enzimático de los hematíes antes de su uso, en tanto que la bromelina se utiliza además como reactivo aditivo. Diluyente 2: Liss modificada para suspensiones de hematíes. La solución de baja fuerza iónica (Liss) aumenta la tasa de asociación de anticuerpos, con lo que potencia las reacciones antígeno anticuerpo. ID-Diluent 2 es una solución modificada de baja fuerza iónica destinada a preparar suspensiones de hematíes al 5% para determinación de grupos sanguíneos en tarjetas de gel con reactivo de origen monoclonal así como suspensiones de hematíes al 0,8% para pruebas de compatibilidad, pruebas de la antiglobulina humana, y hematíes de prueba preparados en el laboratorio. 22

22 El elefante muerto deja sus colmillos; el tigre su piel, y el hombre, su nombre. Anónimo. 23

23 REACCIÓN SEROLÓGICA DE AGLUTINACIÓN La interacción antígeno eritrocitario y anticuerpo puede ser detectada por distintas técnicas serológicas. Las técnicas utilizadas con mayor frecuencia en los laboratorios de inmunohematología tienen como resultante la hemólisis o aglutinación de los hematíes. La hemólisis se produce si se activa la secuencia completa del complemento después que interactúan antígeno y anticuerpo. Muchos anticuerpos de grupo sanguíneo activan el sistema de complemento, pero la secuencia suele interrumpirse a nivel del componente C3 y por ello la lisis in vitro no siempre se produce. La aglutinación de los hematíes es el indicador de la reacción antígeno anticuerpo más comúnmente usada en los Servicios de Hemoterapia. La aglutinación es una reacción serológica que se produce en dos etapas: Primera etapa: SENSIBILIZACIÓN Es el proceso mediante el cual el anticuerpo y su correspondiente antígeno se unen en la superficie del hematíe. En ésta fase influyen varios factores: a) Temperatura óptima de reacción para cada anticuerpo. 24

24 Las reacciones antígeno - anticuerpo son exotérmicas, por tanto a temperaturas más bajas la velocidad de reacción disminuye y existe menor fijación de anticuerpo. La temperatura también puede afectar la accesibilidad del antígeno situado en la superficie de la membrana del hematíe, dado que dependiendo de la misma, se producen cambios morfológicos en el antígeno. A temperaturas bajas en el orden de los 4 C, quedan expuestos más lugares antigénicos permitiendo un aumento de la fijación de anticuerpos de tipo IgM al hematíe. Sin embargo la mayoría de estos anticuerpos no tienen significación clínica. Con objeto de evitar la interferencia de estos anticuerpos, las pruebas de compatibilidad pre-transfusionales se realizan a 37 C permitiendo evidenciar los anticuerpos clínicamente significativos. Para cada reacción de grupo sanguíneo existen márgenes óptimos de temperatura. Básicamente se clasifica a los anticuerpos de grupo sanguíneo en dos categorías: los que reaccionan en frío en rango de 4 a 25 C, en su mayoría de tipo IgM y los que reaccionan en caliente en temperaturas que oscilan los 30 a 37 C, mayoritariamente de tipo IgG. La mayoría de los anticuerpos de grupo sanguíneo reaccionan en rangos térmicos restringidos. No obstante hoy se admite que la temperatura de la reacción óptima entre antígeno y anticuerpo, se vincula más con la naturaleza química del antígeno, que con la clase de anticuerpo. Los antígenos de tipo carbohidrato suelen relacionarse con anticuerpos reactivos en frío (ej: antígenos A,B,Lewis y P) y los proteicos con anticuerpos reactivos en caliente (ej: antígenos Rh,M,N). 25

25 Efecto de la temperatura en la morfología del antígeno. b) ph Las modificaciones de ph pueden afectar las uniones electrostáticas. Se desconoce el ph óptimo de la mayoría de los anticuerpos de grupo sanguíneo, pero se presume que se aproxima al rango fisiológico. Ciertos anticuerpos como ser los anti M, reaccionan mejor a ph por debajo de 7. 26

26 A un ph inferior al punto isoeléctrico, el anticuerpo tiene carga positiva. Esto facilita la unión con los hematíes (que tienen carga superficial negativa), por tanto el ph óptimo para la fase de sensibilización estaría entre 6,5 y 7. Un marcado descenso en el ph, incrementa la disociación de los complejos antígeno anticuerpo. La solución salina fisiológica tiene un ph que oscila entre 5 y 6. La solución salina amortiguada (PBS o Solución Salina Buffer Fosfato por su sigla en inglés) asegura óptimas condiciones de trabajo para los estudios serológicos. c) Concentración de antígeno y anticuerpo Exceso de anticuerpos Zona de equivalencia Fenómeno PROZONA Exceso de antígenos Fenómeno POSTZONA Para cada reacción antígeno anticuerpo existe una proporción óptima de antígeno a anticuerpo: zona de equivalencia. Cuando estas condicionantes se dan, resultan reacciones completas y claramente visibles. 27

27 Es más probable que se produzca la sensibilización cuando el anticuerpo se presente en una concentración elevada. Esto puede lograrse aumentando la proporción de suero en relación a la de hematíes. A tener en cuenta: En la mayoría de los estudios eritrocitarios, el exceso de antígenos reduce el número de moléculas de anticuerpo unidos a cada glóbulo rojo, limitando su capacidad de aglutinación. Por lo tanto, en la mayoría de los procedimientos de rutina es preferible contar con anticuerpos en exceso. Si los anticuerpos a investigar y/o a identificar son débilmente reactivos, el aumento de la concentración de los mismos puede acrecentar la sensibilidad de la prueba. Muy rara vez el exceso de anticuerpos puede inhibir la aglutinación y provocar un fenómeno de Prozona. No obstante el aumento de la concentración de anticuerpos incrementa la sensibilidad de las pruebas de aglutinación. En el Laboratorio de Inmunohematología del Servicio Nacional de Sangre y con el fin de enriquecer y acrecentar la sensibilidad de las pruebas de investigación e identificación de anticuerpos irregulares en medio liss/coombs a temperatura ambiente (22 C exclusivamente), se considera apropiado duplicar la cantidad de suero a analizar: 50µl en lugar de los habituales 25µl. Para las mismas técnicas de investigación e identificación de anticuerpos irregulares ensayadas en medio liss/coombs a 37 C, el aumento de la concentración de anticuerpos, no ha mostrado incrementar la sensibilidad de la prueba. Si la proporción de antígeno excede en demasía a la de anticuerpos, también podría obtenerse una reacción negativa, fenómeno conocido como postzona. d) Potencial iónico del medio Los eritrocitos tienen carga negativa en su superficie y dado que las cargas iguales se rechazan, éste fenómeno logra mantener separados los hematíes entre sí. Cuando los hematíes se hayan suspendidos en solución salina fisiológica los iones Na+ y Cl- forman una doble capa eléctrica alrededor de cada célula. 28

28 Los iones Na+ (con carga positiva) de la solución salina fisiológica son atraídos por la carga negativa de los hematíes y forman la capa interna y los iones Cl- (con carga negativa) forman la capa externa. El potencial eléctrico que se desarrolla entre la carga negativa de los hematíes y las capas iónicas es lo que se conoce con el nombre de potencial Z. Este debe ser superado para que se produzca la aglutinación. Cuando los hematíes están suspendidos en una solución de baja fuerza iónica, la nube de cationes (iones con carga positiva) que rodea a los hematíes es menos densa que si éstos estuvieran suspendidos en solución salina fisiológica. Esa concentración disminuida de cationes alrededor de los hematíes permite a las moléculas de anticuerpo tener más fácil acceso a los sitios antigénicos de la membrana eritrocitaria, aumentando así la tasa de sensibilización. e) Tiempo de incubación El intervalo necesario para alcanzar el equilibrio depende del anticuerpo de grupo sanguíneo del que se trate. Las variables significativas incluyen requerimientos térmicos, clase de inmunoglobulina e interacciones específicas entre la configuración antigénica y el sitio Fab de los anticuerpos. En los sistemas salinos que utilizan suero antiglobulínico para demostrar la fijación del anticuerpo, la incubación en tubo a 37 C durante minutos permite detectar la mayoría de los anticuerpos clínicamente significativos. Cuando se usa solución salina de baja fuerza iónica (Liss) el tiempo de incubación a 37 C se reduce a 10 minutos. Prolongar el tiempo de incubación podría deteriorar la sensibilidad de la prueba. 29

29 Segunda etapa: AGLUTINACIÓN Esta etapa es el resultado de puentes entre los hematíes adyacentes formando un complejo fácilmente apreciable. Una vez que los anticuerpos se han unido a los antígenos de la superficie eritrocitaria, las células sensibilizadas conforman una red y este hecho permite visualizar la reacción. Hematíes aglutinados. (Prueba realizada en lámina). 30

30 Cuando la reacción antígeno anticuerpo es mediada por anticuerpos de tipo IgM, las dos etapas (sensibilización y aglutinación) se superponen y se observa fácilmente la aglutinación resultante. Los anticuerpos de tipo Ig M son moléculas grandes (pentámeros de inmunoglobulinas) de elevado peso molecular y de gran carga neta, lo que les posibilita cubrir la distancia adyacente entre un hematíe y otro, estableciendo puentes de unión entre ellos. Cuando la reacción de aglutinación es mediada por anticuerpos de tipo IgG, se produce solo la primera fase (sensibilización), es decir la unión del anticuerpo con su correspondiente antígeno. La molécula de IgG es un monómero de inmunoglobulina, de poco peso molecular y de poca carga neta, incapaz de cubrir la distancia entre dos hematíes y por ende de provocar la aglutinación. En ésta fase influyen varios factores: a) Potencial iónico del medio y potencial Z. Cuando los hematíes se encuentran en suspensión en una solución electrolítica conteniendo iones libres (aniones y cationes +), su carga negativa de membrana atraerá a los cationes de la suspensión, formándose una envoltura o nube de cargas positivas alrededor de aquellos, convirtiéndolos en partículas cargadas de electricidad del mismo signo que experimentan fuerzas de repulsión entre ellas. A esa fuerza de repulsión se la denomina POTENCIAL Z. El potencial Z puede ser alterado por variación de la carga electrostática de los hematíes y por la variación en la concentración de cationes libres en el medio de la suspensión hemática. Reduciendo la densidad de la nube de cationes, los anticuerpos pueden acercarse más fácilmente a la superficie de los hematíes favoreciendo la sensibilización y posterior aglutinación. Para eliminar la repulsión y potenciar la aglutinación se usan varias estrategias como ser la reducción de la carga negativa de los hematíes por el uso de enzimas proteolíticas, introducción de macromoléculas como la albúmina y polietilenglicol y el uso de soluciones de baja fuerza iónica (LISS). 31

31 Tratamiento enzimático de los hematíes. Los anticuerpos de grupo sanguíneo de molécula pequeña tipo IgG, pueden aglutinar los hematíes si estos se tratan con soluciones tamponadas de enzimas proteolíticas. El mecanismo de acción de las enzimas puede interpretarse como una disminución de la repulsión electrostática entre los hematíes. Las enzimas proteolíticas actúan mediante la digestión superficial de la membrana de los hematíes con separación del ácido siálico disminuyendo el número de cargas electrostáticas negativas de aquella y en consecuencia disminuye el potencial Z lo cual redunda en un mayor acercamiento entre los hematíes. En otras palabras: al reducir la fuerza de repulsión entre los hematíes, se facilita su aglutinación en medio salino mediada por anticuerpos de tipo IgG. Las enzimas proteolíticas más utilizadas en inmunohematología son la bromelina (extraída del tronco del ananá), la ficina (extraída de la higuera, de aplicación limitada por ser tóxica, aunque es la enzima que produce mayor disminución del potencial Z), la papaína (extraída de la fruta de la papaya) y la tripsina (extraída del páncreas de origen animal). Aunque todas ellas potencian la aglutinación mediada por algunos anticuerpos, desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en especial los M, N, S, s, Fy a, Fy b y Xg. 32

32 CUADRO COMPARATIVO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS SISTEMAS EXPRESIÓN ANTIGÉNICA Rhesus Lewis Kidd Kell Duffy MNSs Xg a Expresión aumentada por el uso de enzimas. Expresión aumentada en particular por la Tripsina y Ficina. Expresión aumentada en particular por la Tripsina y Papaína. Expresión no aumentada por el uso de enzimas. Sus antígenos son destruídos por el uso de enzimas. Expresión anulada en los antígenos M,N,S y muy debilitada en el antígeno s. Expresión anulada por el uso de la Papaína. Otra consideración a tener en cuenta y muy importante es que las enzimas proteolíticas potencian la reacción de las autoaglutininas frías normales presentes en los sueros y por ello es que las reacciones en las cuales las utilizamos no deben ser nunca a temperaturas inferiores a 37 C. Otro dato importante es que la presencia de un autoanticuerpo puede producir una aglutinación espontánea en los hematíes tratados con enzimas. Existen otros métodos que facilitan el acercamiento entre los hematíes en suspensión, como ser el agregado de moléculas grandes bipolares como ser la albúmina bovina. Si bien fue un método muy utilizado durante décadas, en la actualidad ha quedado en desuso. Su efectividad radica en dispersar algunas de las cargas positivas situadas alrededor de los hematíes y por ende logra una reducción del potencial Z. El polietilenglicol (PEG) es un polímero lineal hidrosoluble que se usa como aditivo para incrementar la reacción antígeno anticuerpo. La molécula de PEG excluye moléculas de agua del medio y logra mayor captación de anticuerpos. 33

33 La solución de baja fuerza iónica (LISS: Low Ionic Strength Solution) aumenta notablemente la velocidad de sensibilización de los hematíes y sus respectivos anticuerpos. En comparación con la solución salina normal (0,17 M) la solución LISS tiene una molaridad de 0,03 M. b) Temperatura. La mayoría de las pruebas que se basan en reacciones entre antígenos y anticuerpos eritrocitarios se efectúan a a 37 C mayoritariamente, a temperatura ambiente y ocasionalmente a 4 C. c) Densidad del antígeno. Cuanto mayor es el número de antígenos en la superficie del hematíe, mayor será el grado de sensibilización y se aumentan las posibilidades que al anticuerpo pueda establecer puentes entre aquellos. La fijación de moléculas de anticuerpos disminuye el potencial Z y aumenta la aglutinación. d) Agrupación y movilidad de los antígenos. La situación próxima de los antígenos en la membrana del hematíe facilita la aglutinación ya que supone mayor número de probabilidades para la fijación del anticuerpo en el lugar antigénico determinado. Algunos antígenos del sistema Rh solamente están agrupados luego del tratamiento enzimático en tanto que otros antígenos pueden ser 34

34 arrastrados a través de la membrana por la acción de anticuerpos pasando así a formar agrupaciones. e) Características del anticuerpo. La capacidad de un anticuerpo para aglutinar hematíes depende de la clase de inmunoglobulina a la que pertenezca. Así, la molécula de IgM tiene un mayor tamaño que la de IgG siendo más efectiva para producir aglutinación. De todos modos se puede modificar químicamente la molécula de IgG mediante la reducción permanente de los puentes disulfuro que unen las dos cadenas H (pesadas), permitiendo su elongación para que cubra la distancia entre dos hematíes adyacentes sin necesidad de agregar suero anti-igg a la prueba. 35

35 PRUEBA ANTIGLOBULÍNICA HUMANA El principio de esta prueba fue descrito por Moreschi en 1908 pero fue en el año 1945 cuando Coombs, Mourant y Race la aplicaron para detectar la fijación de anticuerpos que no provocan el fenómeno de aglutinación. Esta prueba emplea anticuerpos contra globulinas humanas y se denomina Prueba Antiglobulina Humana. Todas las moléculas de anticuerpo son globulinas. En inmunohematología, las pruebas antiglobulínicas producen aglutinación visible de los hematíes sensibilizados. La prueba antiglobulínica directa (PAD) se usa para demostrar la sensibilización eritrocitaria in vivo mediada por anticuerpos o fracciones del complemento, en particular IgG y C3d unidos en la superficie de los hematíes. Esta prueba se aplica para: Diagnóstico de la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido. Investigación da Anemia Hemolítica Autoinmune. Investigación de hematíes sensibilizados por medicamentos. Investigación de reacciones transfusionales. 36

36 Test Antiglobulina Humana Directo practicado en ID-Card La prueba antiglobulínica indirecta (PAI) pone de manifiesto las reacciones in vitro entre los hematíes y los anticuerpos libres presentes en el suero, que sensibilizan, pero no aglutinan. 37

37 Esta prueba se aplica, entre otros, para: Investigación e identificación de anticuerpos empleando antígenos conocidos. Test de compatibilidad transfusional. Control de aloinmunización durante el período de embarazo. Fenotipar hematíes en ciertos sistemas antigénicos. Test Antiglobulina Humana practicado en ID-Card Liss/Coombs 38

38 REACTIVOS ANTIGLOBULÍNICOS HUMANOS. Anti-IgG, C3d; Poliespecífico. Contiene anti-igg y anti C3d. Puede incluir otros anticuerpos anticomplemento y anti-inmunoglobulina). Anti-IgG. Contiene anti-igg sin actividad anti-complemento (no necesariamente específico para cadenas gamma). Anti-IgG, cadenas pesadas. Sólo contiene anticuerpos reactivos contra las cadenas gamma humanas. Anti-C3b. Sólo contiene anticuerpos anti-c3b sin actividad antiinmunoglobulínica. NOTA: el anticuerpo que se produce en respuesta a la inmunización generalmente se dirige contra el determinante antigénico que se encuentra en la sub-unidad C3c; algunos profesionales lo denominan anti-c3c pero en el rótulo del envase se debe designar como anti- C3b. Anti-C3d. Sólo contiene anticuerpos anti-c3d sin actividad-inmunoglobulínica. Anti-C4b. Sólo contiene anticuerpos anti-c4b sin actividad antiinmunoglobulínica. Anti-C4d. Sólo contiene anticuerpos anti-c4d sin actividad antiinmunoglobulínica. Existen antisueros específicos para otras inmunoglobulinas (IgA, IgM) y subclases (IgG1, IgG3). 39

39 MECANISMO DE SENSIBILIZACIÓN DE ERITROCITOS CON COMPLEMENTO. a) Activación del Complemento por anticuerpos de grupo sanguíneo. Ciertos anticuerpos de grupo sanguíneo tienen la capacidad de fijar el Complemento a la membrana eritrocitaria. Algunos los hacen eficientemente y se manifiestan por causar la lisis de los eritrocitos normales que presentan los antígenos respectivos. Claro ejemplo lo constituyen los anticuerpos anti-a, Anti-B mientras que anticuerpos de otras especificidades pueden sensibilizar eritrocitos sin causar hemólisis, caso de anticuerpos anti-lewis, anti-kidd, anti- Duffy, anti-s, anti-s,anti-i, anti-i y anti-p1. Se desconoce el motivo por el cual algunos anticuerpos son capaces de fijar abundante C3 a la membrana eritrocitaria, lo cual se manifiesta en en una Prueba Antiglobulina Directa fuertemente positiva sin llegar a la etapa de hemólisis. Algunos de estos anticuerpos son de tipo IgM y además de lograr aglutinación, sensibilizan con C3 (algunos anti-a, anti-b, anti-i, anti- Lewis). Otros anticuerpos menos frecuentes de tipo IgM, no logran la aglutinación en condiciones normales, pero sensibilizan los hematíes de modo tal que son detectables con la Prueba Antiglobulina Humana Directa (algunos anti-lewis, anti-kell, anti-duffy y anti-kidd). Otros anticuerpos son de tipo IgG y sensibilizan hematíes con fracciones del Complemento de modo tal que si se usa antiglobulina monoespecífica anti IgG se obtiene un resultado débil, pero si se usa un reactivo conteniendo anti C3 se obtendrá un resultado fuerte (algunos anti-kell, anti-kidd y anti Duffy). b) Activación del Complemento por Complejos Inmunes. En algunas circunstancias los complejos inmunes pueden adherirse inespecíficamente a los eritrocitos mientras que en otras circunstancias se encuentran en solución en el plasma. Un ejemplo de ello lo constituyen la acción de ciertos medicamentos, de manera tal que se forman complejos medicamento-anti-medicamento que se adhieren a la membrana del hematíe en forma inespecífica, activan el Complemento y fijan las fracciones a la misma. 40

40 Mecanismo de adsorción. La droga se fija a las proteínas de la membrana eritrocitaria. Si el paciente desarrolla anticuerpos antidroga potentes, éstos reaccionan con el fármaco fijado. En consecuencia la prueba de Coombs Directa con reactivos anti-igg es positiva. En general el complemento no se activa y la lisis es sobre todo extravascular. La droga prototípica es la penicilina. 41

41 Mecanismo de acción del reactivo antiglobulina humana. En suma: la adición de medios macromoleculares, enzimas proteolíticas, solución de baja fuerza iónica, suero antiglobulina humana y centrifugación constituyen estrategias para detectar la sensibilización de los hematíes por anticuerpos de tipo IgG, que generalmente no producen aglutinación. 42

42 Un experto es una persona que ha cometido todos los errores que se pueden cometer en un determinado campo. Niels Bohr. Físico danés

43 Pruebas en ID-Card Liss/Coombs Para un resultado óptimo, las determinaciones deben realizarse con muestras que cumplan la normativa local del laboratorio en cuanto a criterios de aceptabilidad de las mismas. Deben ser extraídas mediante una correcta venopunción en anticoagulante EDTA. Cuando sea necesario emplear el suero de la misma, se sugiere centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1500g para evitar la presencia de residuos de fibrina que podrían interferir con el patrón de reacción. Preparación de la muestra de sangre: Deje que el diluyente 2 alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo. Para preparar: * Autocontrol * Test de Coombs Directo (PAD) * Prueba de Compatibilidad Transfusional Prepare una suspensión de los hematíes a utilizar, al 0.8% en ID- Diluent 2 de la siguiente manera: ID-Diluyente ml Hematíes concentrados 10µl o Sangre total / Segmento de la tubuladura (*) 20µl 44

44 (*) En caso de utilizar sangre tomada del segmento de tubuladura se aconseja realizar un lavado con solución salina fisiológica previo a su suspensión en el diluyente 2. Antes de utilizar una ID-Card, verifique su fecha de caducidad e inspecciónela en busca de signos de desecación, burbujas en el gel, y sellado defectuoso. I) PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA. 1. Marque el/los microtubo(s) a utilizar de la tarjeta con el nombre del/ los paciente/s o número de muestra a analizar. 2. Retire la lámina de sellado sólo de los microtubos que vaya a utilizar manteniendo la ID-Card en posición vertical. 3. Pipetee 50µl de la suspensión de hematíes en el/los microtubos correspondiente/s. 4. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID- Centrifuge. 5. Lea y registre los resultados. Una reacción negativa indica la ausencia de anticuerpos IgG o componente del complemento C3d detectable en los hematíes. Una reacción positiva (sea cual fuere el patrón de aglutinación) indica que los hematíes analizados se encuentran sensibilizados (por anticuerpos IgG, C3d o ambos). 45

45 A continuación se muestra un ejemplo: II) PRUEBA DE COMPATIBILIDAD TRANSFUSIONAL. 1. Identifique los microtubos correspondientes en la tarjeta ID- Card LISS/Coombs con el nombre o número del receptor y de la muestra a compatibilizar. 2. Retire la lámina de sellado sólo de aquellos microtubos que vaya a utilizar, manteniendo la ID-Card en posición vertical. 3. Pipetee 50 µl de la suspensión de hematíes en el o los microtubos correspondientes. 4. Para el AUTOCONTROL, pipetee 50 µl de la propia suspensión de hematíes del paciente en el microtubo correspondiente y claramente identificado. 5. Agregue 25 µl del plasma del paciente a cada microtubo. 6. Incube la tarjeta ID-Card Liss/Coombs por espacio de 15 minutos en el ID-Incubator. 7. Centrifugue la tarjeta durante 10 minutos en la ID- Centrifugue. 8. Lea y registre los resultados. 46

46 Ejemplo: Las pruebas de compatibilidad en los microtubos 1,2,3,7 y 11 son positivas. Los números detallados en la parte inferior de la tarjeta indican la intensidad acuerdo a los patrones de reacción (ver páginas 9 y 10). Las pruebas de compatibilidad en los microtubos 4,5,6,8,9 y 10 son negativas al igual que el autocontrol. Una reacción negativa, indica compatibilidad entre la sangre seleccionada para transfundir y el receptor de la misma. Una reacción positiva indica la incompatibilidad debido a la presencia de un anticuerpo (o más) en el receptor, dirigidos contra antígenos presentes en los hematíes del dador. Deben ampliarse los estudios para identificar la especificidad del o los anticuerpos involucrados. 47

47 III) INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (SCREENING o TAMIZAJE) El Reglamento Técnico de Medicina Transfusional (Decreto del Poder Ejecutivo N 385/000 del 26 de diciembre del año 2000, con entrada en vigencia el 9 de enero del año 2001) ordena que el suero de todos los donantes, pacientes y embarazadas sea estudiado para descartar la presencia de aloanticuerpos aglutinantes, hemolizantes o sensibilizantes de la membrana eritrocitaria. Detallaremos en éste apartado el escrutinio de anticuerpos irregulares en medio liss/coombs y a continuación en medio enzimático. ESCRUTINIO DE ANTICUERPOS IRREGULARES EN TARJETA LISS-COOMBS Emplee para esta prueba eritrocitos ID-DiaCell I-II ó I-II-III, ampliamente fenotipados por el fabricante. Los requerimientos de configuración antigénica de los eritrocitos de prueba son rigurosos: de modo tal de asegurar la detección de todos los anticuerpos clínicamente significativos. 48

48 Para los sistemas Rh, MNSs, Duffy y Kidd la dotación antigénica debe estar presente en forma homocigota. También han de estar presentes los antígenos Lewis y el raro antígeno Kpa. Deje que los hematíes de prueba y las muestras a analizar alcancen la temperatura ambiente antes de usarlos. 1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta ID-Card Liss/Coombs con el nombre o número de la muestra a analizar (sea de un receptor o de un donante). 2. Retirar la lámina de sellado sólo de los microtubos que se vayan a utilizar manteniendo la ID-tarjeta en posición vertical. 3. Pipetee 50µl de cada reactivo de hematíes (vial I y II ó I-II y III) en el microtubo correspondiente. 4. Si va a incluirse un AUTOCONTROL, pipetee 50µl de la propia suspensión de hematíes de la muestra en el correspondiente microtubo. 5. Añada 25µl del plasma o suero del receptor o donante (según corresponda) a cada microtubo. 6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37 C en el ID- Incubator. 49

49 7. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID- Centrifugue. 8. Lea y registre los resultados. Una reacción negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares detectables en el suero o plasma del paciente o donante estudiado. Una reacción positiva indica la presencia de anticuerpo (s) irregular (es). Las reacciones obtenidas deben trasladarse a la tabla de antígenos. Compruebe que el número de lote de los hematíes reactivo I-II o I-II-III corresponde con el número de lote indicado en la tabla de antígenos. 50

50 51

51 Según sea el patrón de reacciones y la configuración de antígenos, puede llegarse a dilucidar el o los anticuerpos involucrados. Un autocontrol negativo y una reacción positiva a uno o más tipos de hematíes, sugieren la presencia de un anticuerpo específico, en tanto que un autocontrol positivo y reacciones positivas a todos los hematíes puedan vincularse a reacciones no específicas. Si existe una reacción positiva a todos los hematíes que conforman el panel, un autocontrol positivo, pero uno o más hematíes que muestren una reacción positiva más intensa que el autocontrol, deben cumplirse pruebas adicionales en la muestra para estudiar la posibilidad de un aloanticuerpo subyacente. IV) IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES. Emplee los hematíes reactivo listos para usar ID-DiaPanel. Deje que los viales y las muestras alcancen la temperatura ambiente antes de usarlos. 1. Marque dos tarjetas ID-Cards Liss/Coombs con el nombre o número del paciente o donantes en quien queremos identificar el anticuerpo irregular. 2. Numere del 1 al 6 la primera tarjeta y del 7 al 11 y AC (autocontrol) en la segunda tarjeta. 3. Retirar la lámina de sellado solo de los microtubos que se vayan a utilizar manteniendo la ID-Card en posición vertical. 52

52 4. Transfiera de cada vial numerado del 1 al 11, una gota (50µl) a cada microtubo igualmente numerado. 5. En el último microtubo (número 12) destinado a autocontrol (AC), pipetee 50µl de la propia suspensión de hematíes. 6. Agregue a todos los microtubos 25µl del plasma o suero del paciente o donante en estudio. 7. Incube ambas tarjetas durante 15 minutos a 37 C en el ID-Incubator. 8. Centrifugue ambas tarjetas durante 10 minutos en la ID-Centrifuge. 9. Lea y registre los resultados en la tabla de antígenos. EFECTO de DOSIS Al momento de leer y registrar los resultados en la tabla de antígenos, resulta frecuente de observar que ciertos antígenos de los sistemas Rh- Hr, MNSs, Kidd, Kell y Duffy entre otros, se expresan serológicamente con mayor intensidad si el individuo es homocigoto para el gen que codifica el antígeno. Vale decir que heredó de sus dos progenitores los genes que codifican el mismo antígeno. Por el contrario, quienes son heterocigotos para un determinado antígeno, presentan una intensidad de aglutinación menor. Esto se debe a que el número de sitios antigénicos del individuo homocigoto es casi el doble que el que presenta un sujeto heterocigoto. El efecto de dosis contribuye a la determinación de la especificidad de los aloanticuerpos. Ejemplo de efecto de dosis 53

53 54

54 Según el patrón de las reacciones y la configuración de los antígenos, el tipo de anticuerpo presente puede identificarse en la mayoría de los casos, tenga presente que la reacción del microtubo de autocontrol debe dar resultado negativo. Una reacción positiva con todos los hematíes ID-DiaPanel y un autocontrol negativo, puede deberse a reacciones no específicas o bien indicar la presencia de un aloanticuerpo dirigido contra un antígeno de alta incidencia. Una reacción positiva con todos los hematíes ID-DiaPanel y un autocontrol positivo, puede deberse a reacciones no específicas. Compare el patrón de reacción entre el autocontrol y el resto de los microtubos. Si estos últimos arrojan reacciones más intensas que el autocontrol, puede que estemos frente a un aloanticuerpo subyacente, por lo que se requerirán estudios adicionales. No resulta infrecuente que coexistan auto y aloanticuerpos. Recuerde que los anticuerpos frente a antígenos de los sistemas MNSs y Duffy no se detectan en medio enzimático ya que al tratarse de antígenos de naturaleza proteica; son destruidos por aquellas. Nos puede ayudar para la identificación del anticuerpo, conocer el fenotipo de los hematíes del paciente, ya que los antígenos correspondientes a los aloanticuerpos detectados en el suero deben estar ausentes en los mismos. En el caso de autoanticuerpos o estudio de un eluído, por el contrario el antígeno debe estar presente. Cuando se ha identificado un aloanticuerpo, debe procederse a la determinación en los eritrocitos del paciente del antígeno específico para comprobar su ausencia. Tener en cuenta que si el paciente ha sido transfundido recientemente, el estudio de su fenotipo puede darnos resultados erróneos. Por último y a modo de orientación, cuando se detecta un anticuerpo de especificidad anti-d en mujeres en edad reproductiva, asegurarse de que no se trate de un anticuerpo pasivo resultante de la profilaxis con inmunoglobulina anti Rh D. 55

55 Pruebas en ID-Card NaCl Enzime Test and Cold Agglutinins Esta tarjeta es apta para la detección de anticuerpos reactivos en técnica salina y enzimática, a saber: pruebas séricas inversas detección de anticuerpos irregulares identificación de anticuerpos irregulares pruebas de compatibilidad en medio salino y/o enzimático. Introducción: Las técnicas salinas se emplean para detectar anticuerpos que reaccionan fundamentalmente a 4 C o a C (temperatura ambiente), tales como anti M, anti N, anti P1, anti Le a y anti Le b. También se la utiliza para definir la anemia hemolítica por anticuerpos fríos. Las técnicas enzimáticas son de utilidad cuando se busca una mayor sensibilidad en la detección de anticuerpos. Las enzimas potencian las reacciones de determinados anticuerpos en particular en los sistemas Rh, Kell y Kidd pero destruyen algunos antígenos como ser el M,N,S, Fy a y Fy b, por tanto nunca debe emplearse una técnica enzimática como único método. 56

56 No se considera necesario incluir la prueba salina a temperatura ambiente en las pruebas de rutina de detección de anticuerpos, pero la prueba salina a 4 C puede emplearse para detectar aglutininas frías. Preparación de la muestra de sangre Deje que el diluyente 2 alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo. Para: Autocontrol y pruebas de compatibilidad en medio salino y enzimático, proceda a preparar una suspensión de hematíes al 08% en ID-Diluent 2 de la siguiente manera: ID-Diluent 2 1.0ml + Hematíes concentrados 10µl o Sangre total / Segmento de tubuladura (*) 20µl (*) En caso de utilizar sangre tomada del segmento de tubuladura se aconseja realizar un lavado con solución salina fisiológica previo a su suspensión en diluyente 2. La suspensión preparada puede utilizarse inmediatamente. Antes de utilizar una ID-Card, verifique su fecha de caducidad e inspecciónela en busca de signos de desecación, burbujas en el gel, y sellado defectuoso. Antes de su uso, deje que los reactivos de eritrocitos de prueba ID, los diluyentes ID, y las muestras de suero o plasma alcancen la temperatura ambiente (salvo para aglutininas frías). 57

57 A continuación describiremos el procedimiento de las pruebas. Prueba de compatibilidad en medio enzimático (Papaína o Bromelina) 1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta ID-Card NaCl, enzime test and cold agglutinins con el nombre o número de paciente y quite el papel aluminio de todos los microtubos que vaya a utilizar. 2. Pipetee 50µl de la suspensión de eritrocitos del donante en los microtubos correspondientes. 3. Si se va a incluir un autocontrol, pipetee 50µl de la propia suspensión de eritrocitos del paciente en el correspondiente microtubo. 4. Añada 25µl del plasma o suero del paciente a cada microtubo. 5. Añada 25µl de ID-Diluent 1 (Solución de Bromelina modificada) o lo que es igual de ID-Papain a cada microtubo. 6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37 C en el ID- Incubator. 7. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en el ID-Centrifuge. 8. Lea y registre los resultados. Prueba de compatibilidad en medio salino. Proceda exactamente igual a lo descripto en al apartado anterior (prueba de compatibilidad en medio enzimático) pero no realice el paso número 5 (no agregue la Solución de Bromelina ni el ID-Papain) e incube a temperatura ambiente (18 25 C). Posteriormente continúe con los pasos 7 y 8. Prueba Sèrica Inversa. ( ID-DiaCell ABO ) 1. Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso. 2. Marque los correspondientes microtubos de la tarjeta ID-Card NaCl, enzime test and cold agglutinins con el nombre o número del paciente o donante e indique los microtubos que contendrán los hematíes 58

58 reactivo A1, A2, B y O. Quite el papel aluminio de todos los microtubos identificados. 3. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaCell ABO (A1, A2, B y O) en los microtubos identificados a tales efectos. 4. Añada 50µl de plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo. 5. Incube la tarjeta ID-Card durante 10 minutos a temperatura ambiente, entre 18 y 25 C. 6. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID- Centrifugue. 7. Lea y registre los resultados obtenidos. Prueba Sérica Inversa Interpretación. Hematíes A1 Hematíes A2 Hematíes B Hematíes 0 Interpretación negativo negativo + a ++++ negativo Grupo A + a ++++ ± a ++++ negativo negativo Grupo B negativo negativo negativo negativo Grupo AB + a ++++ ± a a ++++ negativo Grupo 0 Observación: Si la muestra no estuviese hemolizada, pero se observare hemólisis en la parte superior del microtubo, el resultado debe interpretarse como POSITIVO. En caso de discrepancia entre la prueba directa ABO la prueba sérica, inclúyase un autocontrol. Investigación de anticuerpos irregulares. I) Prueba enzimática con eritrocitos papaínizados (*) (ID-DiaCell I-II-III P ) Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso. 59

59 1. Marque los microtubos correspondientes de la ID-Card NaCl, enzime test and cold agglutinins con el nombre o número del paciente o donante en estudio. 2. Quite el papel aluminio de todos los microtubo que vaya a utilizar. 3. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel I-II-III P papainizados en los microtubos correspondientes identificados como I, II y III. 4. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la propia suspensión de eritrocitos del paciente en el microtubo destinado como AC (Auto Control) y agregue 25µl de ID-Papaín (**). 5. Añada 25µl de plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo. 6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37 C en el ID- Incubator. 7. Centrifugue la tarjeta ID-card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue. 8. Lea y registre los resultados obtenidos. (*) Si no se dispone de hematíes papaínizados, puede utilizar hematíes de prueba ID-Cell I-II-III y agregar 25µl de solución 1 (bromelina modificada). (**) Si no dispone de ID-Papaín, puede utilizar 25µl de solución 1 (bromelina modificada). II) Prueba en salino a 4 C con ID-Cell I-II-III Antes de su uso coloque las tarjetas ID-Card NaCl,enzime test and cold agglutinins en la heladera (4 C ±2) durante dos horas. Mantenga refrigerados hasta el momento de la prueba tanto los hematíes ID- Cell I-II-III como el suero o plasma a analizar. 1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta con el nombre o número del paciente y quite el papel de aluminio de todos los microtubos que vaya a analizar. 2. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel I-II-III en los microtubos correspondientes identificados como I, II y III. 60

60 3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la propia suspensión de eritrocitos del paciente en el correspondiente microtubo. 4. Añada 25µl de plasma o suero del paciente a cada microtubo. 5. Incube la tarjeta ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4 C±2). 6. Centrifugue la ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue. 7. Lea y registre los resultados obtenidos. INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (*) *Importante: leer el comentario ampliado en el recuadro de la página 28. Tarjeta Liss/Coombs + Enzime Test (Id-n :50581) Esta tarjeta combina en una sola presentación la investigación de anticuerpos irregulares en medio liss/coombs y en medio enzimático. 61

61 Identificación de Anticuerpos. I) Prueba enzimática con eritrocitos papainizados (ID-Diapanel P). 1. Marque 2 tarjetas ID-Card NaCl, enzime test and cold agglutinins con el nombre o número del paciente o donante y numere los microtubos del 1 al 11 (12 en caso de incluir autocontrol). Quite el papel de aluminio que cubre los micritubos. 2. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel P papainizados en los microtubos correspondientes marcados del 1 al Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la suspensión de eritrocitos del paciente en el microtubo número Añada 25µl del plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo. 5. Para el autocontrol, agregue 25µl de ID-Papain al microtubo número Incube las tarjetas ID-Card durante 15 minutos a 37 C en el ID- Incubator. 7. Centrifugue las tarjetas ID-Card durante 10 minutos en la ID- Centrfugue. 8. Lea y registre los resultados obtenidos en la cartilla de antígenos. II) Prueba Salina a 4 C (ID-DiaPanel) Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso. Mantenga las tarjetas ID-Card en la heladera (4 C ±2) por espacio de dos horas. Utilice reactivos de eritrocitos de prueba y muestras a analizar refrigerados. 1. Marque dos tarjetas ID-Card, enzime test ando cold agglutinins con el nombre o número del paciente o donante y numere los microtubos del 1 al 11 (12 en caso de incluir autocontrol). Quite el papel de aluminio. 2. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel en los microtubos correspondientes marcados del 1 al Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la suspensión de eritrocitos del paciente en el microtubo número Añada 25µl de plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo. 5. Incube las tarjetas ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4 C±2). 62

62 6. Centrifugue las tarjetas ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue. 7. Lea y registre los resultados en la cartilla de antígenos. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. En la detección de anticuerpos: Principios y consideraciones generales Una reacción negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares detectables en el suero o plasma del paciente o donante. Una reacción positiva indica la presencia de anticuerpos irregulares. Introduzca las reacciones obtenidas en la cartilla de antígenos y verifique que el número de lote de los eritrocitos de prueba corresponde al número de lote indicado en la tabla de antígenos. El patrón de reacciones y la configuración de antígenos puede indicar el tipo de anticuerpo presente. Una reacción positiva a algunos eritrocitos de prueba y un autocontrol negativo, sugieren la presencia de un anticuerpo específico. Si existe una reacción positiva a todos los eritrocitos de prueba y un autocontrol positivo, focalice su atención en los patrones de reacción de las muestras. Si las reacciones fuesen más intensas que el autocontrol, podría sugerir la presencia de un aloanticuerpo subyacente. 63

63 En la identificación de anticuerpos: El patrón de reacciones y la configuración de antígenos permiten en la mayoría de los casos identificar el tipo de anticuerpo presente (el autocontrol debe arrojar resultado negativo). Una reacción positiva a TODOS los eritrocitos de prueba y un autocontrol negativo, puede deberse a reacciones no específicas o bien indicar la presencia de un aloanticuerpo contra un antígeno de elevada frecuencia. Una reacción positiva a todos los eritrocitos de prueba y un autocontrol positivo, se debe probablemente a un autoanticuerpo. El que exista una reacción positiva a todos los eritrocitos de prueba ID-DiaPanel y un autocontrol positivo, pero uno o más tipos de eritrocitos de prueba muestren reacciones más intensas que el autocontrol, puede indicar la existencia de un aloanticuerpo subyacente, por lo que se deberán ampliar los estudios. Los anticuerpos fríos potentes pueden dar lugar a reacciones positivas, principalmente en la técnica enzimática. El anticuerpo anti I se especifica frecuentemente en la enfermedad de aglutinina fría, pudiendo realizarse su confirmación con el ID-I Negative Cell (células carentes del antígeno I). En la prueba de compatibilidad: Una reacción positiva indica una incompatibilidad debida a la presencia de anticuerpos irregulares en el suero o plasma del receptor. Una reacción negativa indica que la técnica empleada no ha detectado anticuerpos en el suero o plasma del receptor dirigidos contra antígenos presentes en los eritrocitos del donante. 64

64 IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (*) *Importante: leer el comentario ampliado en el recuadro de la página

José Antonio Paredes Arrascue

José Antonio Paredes Arrascue José Antonio Paredes Arrascue Dr. (c), Mg., Lic. en Tecnología Médica Profesor Asociado de la Facultad de Medicina U.N.M.S.M. Tecnólogo Médico del Servicio de Medicina Transfusional H.N.E.R.M. - EsSalud

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