PROYECTO QUÍMICA ORT DEL GENOMA HUMANO
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- Francisca María Jesús Martín Vázquez
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1 ESCUELA TÉCNICA ORT - SEDE ALMAGRO PROYECTO QUÍMICA ORT DEL GENOMA HUMANO Subsidios a la Investigación en Bioquímica Molecular y Genética Año 2015 INVESTIGADOR RESPONSABLE: Lic. Alejandra Paez LUGAR DE TRABAJO: Laboratorio de Mecanismos Moleculares del cáncer, IQUBICEN CONICET - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires TITULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACION: ABORDAJE PROTEOMICO, BIOINFORMÁTICO Y TECNOLOGIA DE MICROARRAY DE TEJIDOS PARA EL ESTUDIO DE BIOMARCADORES EN CÁNCER DE PRÓSTATA RESUMEN (DIVULGACIÓN) El principal desafío en la investigación del cáncer de próstata es identificar biomarcadores que permitan la detección temprana de los tumores agresivos que desarrollarán metástasis óseas y en consecuencia el diseño de mejores estrategias terapéuticas. Considerando la heterogeneidad de los tumores de próstata, es poco probable que un solo marcador sea suficiente para discriminar entre los diversos estadios de la enfermedad y la eficacia de los tratamientos. Así, este proyecto busca detectar, mediante la utilización de herramientas proteómicas, bioinformáticas y microarray de tejidos, las improntas moleculares que gobiernan la progresión del cáncer de próstata hacia la metástasis. RESUMEN (TÉCNICO) La medicina molecular del cáncer se está direccionando desde la genómica hacia la proteómica. Las interacciones proteína-proteína pueden ser caracterizadas como corrientes de información fluctuante dentro de la célula y la caracterización del circuito proteico dentro y fuera de la célula impacta en la biología tumoral. Nuestra hipótesis se basa en que HO-1, una proteína anti-inflamatoria, y sus interactores pueden reprogramar a la célula del cáncer de próstata modificando el microambiente tumoral y favoreciendo el establecimiento de un fenotipo menos agresivo. En este proyecto utilizaremos un abordaje proteómico y bioinformático para identificar biomarcadores predictivos de la carcinogénesis prostática. RELEVANCIA DEL PROBLEMA Y OBJETIVO GENERAL 1
2 El cáncer de próstata (PCa) es una de las principales causas de muerte en los hombres occidentales. La incidencia aumenta con la edad y representa uno de los factores de riesgo más importantes. El PCa localizado puede curarse en la mayoría de los casos, pero cuando la enfermedad escapa los confines de la glándula, la perspectiva de cura decrece drásticamente. La ablación de andrógenos es la terapia más efectiva para frenar el desarrollo del PCa, pero en algunos casos la enfermedad se convierte en resistente a la castración (CRPC). Esta resistencia requiere cambios consecutivos en el tratamiento. Por lo tanto, surge la necesidad de un sistema confiable para seleccionar la mejor opción terapéutica para cada paciente en el tiempo adecuado. Los factores genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo del PCa, y evidencias crecientes sugieren la participación de la inflamación crónica en la progresión de la enfermedad. La presencia de mediadores inflamatorios en el microambiente tumoral, nos hacen preguntar si los eventos genéticos que participan en el desarrollo del cáncer y su progresión son responsables del medio inflamatorio dentro y alrededor del tumor. Los oncogenes activados, las citoquinas, quimioquinas y sus receptores, y el estrés oxidativo sostenido comparten la capacidad de orquestar programas pro-inflamatorios; sin embargo, la diversidad de los componentes inflamatorios celulares determinará la respuesta final en el tejido prostático. En nuestra opinión, es necesario identificar aquellos eventos bioquímicos y moleculares que controlan la adquisición de un fenotipo resistente a la castración, para así desarrollar abordajes terapéuticos más efectivos y nóveles, que implican modificadores de la respuesta del tejido hospedador como medio para controlar el crecimiento metastásico del PCa. La isoforma inducible de la hemo oxigenasa (HO-1) confiere citoprotección contra el estrés oxidativo y la inflamación en varios modelos animales. Esta proteína ejerce funciones metabólicas vitales manteniendo la homeostasis celular. Previamente nuestro laboratorio documentó por primera vez que HO-1 se expresa en carcinomas primarios prostáticos humanos y su localización en el núcleo. En líneas celulares de PCa comprobamos que la inducción farmacológica y genética de su expresión induce su localización nuclear e inhibe la proliferación, migración e invasión y modula negativamente la expresión de genes pro-inflamatorios y pro-angiogénicos. Adicionalmente, HO-1 retarda el crecimiento de tumores in vivo y disminuye la angiogénesis. Comprobamos que HO-1 reprime la vía de NF-κB e inhibe la señalización de STAT3, interrumpiendo su asociación con el receptor de andrógenos (AR) y en consecuencia la actividad transcripcional de AR. HO-1 reprime la actividad del promotor del antígeno prostático específico (PSA) en presencia de hormona y se asocia a promotores génicos adjudicándole un rol como co-regulador de la transcripción. Estos datos junto con los resultados preliminares presentados en este proyecto, sugieren claramente que HO-1 cumple una función celular, más allá de la degradación del hemo. Nuestra hipótesis se basa en que HO-1 y sus partners moleculares pueden reprogramar las células del PCa y modificar el microambiente tumoral, favoreciendo así un fenotipo menos agresivo. El objetivo general de este proyecto es identificar los interactores moleculares de HO-1 responsables de impedir los procesos biológicos que promueven la progresión tumoral de las células prostáticas. Estos interactores pueden ser potenciales biomarcadores y ser seleccionados para definir un subtipo de pacientes con PCa que requieran una terapia alternativa. Estos abordajes experimentales permitirán determinar el interactoma humano de HO-1 brindando información crítica sobre los mecanismos y los caminos de señalización involucrados en la función antitumoral de esta proteína, así como un marco estructural para el nuevo diseño de drogas. TIPO DE DISEÑO DE INVESTIGACIÓN Base Racional: Teniendo en cuenta que la expresión de HO-1 es regulada principalmente a nivel transcripcional y que está bien documentada su translocación nuclear nuestra hipótesis se basa en que HO-1 y sus interactores moleculares pueden reprogramar a las células del PCa y modificar el microambiente tumoral, favoreciendo un fenotipo menos agresivo. Mediante ensayos de pull-down realizados bajo condiciones inflamatorias (IL-6: 10ng/ml durante 24h; H 2O 2: 200µM durante 1 h) se aislarán los complejos proteicos y se analizarán por MALDI-TOF/TOF (Bruker Ultraflex II) y bioinformática (Esquema 1). 2
3 Pull&Down&Assay& Ensayo de Pull-Down Mixture&of&HO& Mezcla de Interac3ng proteinas & proteins& intractoras de SDS&PAGE& HO-1 In&gel Digestión & diges3on& in-gel Pep3des& Péptidos MALDI&TOF& TOF/TOF& MS/&MSMS& Espectros &Spectra& MS/ MSMS Búsqueda Mascot & Mascot Search& Lista& & Protein(1( ( Protein(2( & Protein(3( ( Protein(4( List&of&probable& Lista de HO&Interac3ng& proteínas diferenciales proteins& Bioinformatics Análisis Bioinformático Analysis Esquema 1. Estrategia global de las acciones programadas. La lista de interactores será verificada y en combinación con meta-data biológica, construiremos el interactoma humano de HO-1. Para este grupo de candidatos (interactoma de HO-1) realizaremos un análisis de interacción de proteínas y un análisis ontológico para identificar las subcategorías (procesos biológicos, componentes celulares, funciones moleculares) de ontologia génica (GO) enriquecidas significativamente. Metodología : Líneas celulares. Se usará las líneas tumorales humanas de próstata PC3 ( insensible a andrógenos). Cultivo celular y clonado. Para identificar las proteínas que interactúan con HO-1 se llevarán adelante ensayos de GST pull-down Análisis por espectrometría de masa. Las proteínas asociadas a HO-1 se analizarán por MALDI-TOF/TOF (Bruker Ultraflex II) y tecnología Orbitrap (Thermo scientific Q Exactive). Se realizará la fragmentación de varios péptidos para verificar las secuencias aminoacídicas y para determinar las modificaciones post-traduccionales. Los espectros MALDI MS y MSMS serán analizados con Flex Analysis y Biotools Software (Bruker Daltonics). La listas de picos obtenidas serán procesadas y comparadas con las bases de NCBI utilizando Protein Prospector y/o Mascot Software. Las búsquedas se realizarán contra el genoma humano permitiendo una tolerancia de 200ppm y una tolerancia de fragmento de 0,7 Da. Se contemplarán las alteraciones de masa producidas por las modificaciones esperadas como la carbamidometilación, la oxidación de metionina y la acetilación N-terminal. - Validación de proteínas interactoras de HO-1 PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) Western Blot. Inmunocitoquímica Inmunofluorescencia. Bioinformática Una vez que la lista de proteínas que interactúan con HO-1 este verificada, utilizaremos esta información en combinación con la información disponible en bases de datos públicas (Biogrid, DAVID, HRPD, IntAct, Human protein atlas, Peptide Atlas, Uniprot, Oncomine, Gene Expression Omnibus (GEO), PFAM, Gene Ontology (GO) y KEGG) para identificar el interactoma de HO-1. El mismo consistirá en una base de datos relacional construída a partir de los datos mencionados utilizando software de tipo 3
4 MySQL. La plataformas Cytoscape y GeneMania se usarán para la visualización y el análisis del interactoma. - Analisis del interactoma por tecnologia de microarray de tejidos Tissue microarray. Los TMAs proveen un gran número de especímenes en un mismo portaobjetos. La tecnología de los TMAs permite estimar y comparar la prevalencia de los marcadores tumorales en estudio a través de grupos de pacientes. Adicionalmente permiten evaluar la expresión coordinada entre dos o más marcadores y examinar la asociación entre los mismos. Los TMAs (54) incluyen tejido normal, maligno y metastático que pueden ser utilizados para validar la relevancia clínica de los potenciales targets terapéuticos en el diagnóstico, terapéutica y permitir el estudio de nuevos biomarcadores. Los TMAs proveen de una plataforma high-throughput para el análisis rápido de marcadores moleculares asociados al diagnóstico y pronóstico del PCa. Contiene múltiples çores (muestras) para poder considerar la alta heterogeneidad celular del tejido. Adicionalmente posee los correspondientes controles. Estos TMAs se obtendrán de manera comercial (US Biomax Inc). EJEMPLO DE RESULTADOS PRELIMINARES Y APORTES DEL GRUPO AL ESTUDIO DEL PROBLEMA EN CUESTIÓN. Identificación de proteínas asociadas a HO-1 por análisis proteómico Para purificar los complejos proteicos asociados a HO-1, subclonamos la secuencia codificante de HO-1 en un vector de expresión eucariota (pebg) fusionado por su extremo amino terminal a un tag de glutatión S-transferasa (GST) para permitir la purificación por columna de afinidad. Células PC3 fueron transfectadas con esta construcción, y cultivadas en presencia/ausencia de agentes inflamatorios y oxidantes. Los complejos proteicos obtenidos fueron digeridos en solución y luego se realizaron macro purificaciones para optimizar la detección de péptidos por espectrometría de masas (LC-MS/MS). Las masas peptídicas obtenidas (huellas peptídicas) se volcaron en el programa Mascot y solo proteínas diferenciales unidas a GSTHO-1 fueron consideras para el análisis. Se obtuvieron 46 proteínas diferenciales, potencialmente asociadas a HO-1, que definimos como el interactoma preliminar de HO- 1. Para este set de proteínas realizamos un análisis de red de interacciones y un análisis de ontologías como se muestra en la figura a continuación. 4
5 Los resultados revelaron un enriquecimiento de proteínas asociadas a varias subcategorías relacionadas entre las cuales se destacan, proteínas relacionadas con el proceso de transcripción e interacción con el DNA (rojo), proteínas relacionadas al procesamiento post-transcripcional del RNA (azul), proteínas relacionadas al transporte en el citoesqueleto actina (amarillo) y otras proteínas (verde). La detección de proteínas nucleares asociadas a HO-1, principalmente relacionadas con los procesos de transcripción y procesamiento del RNA sugieren que el interactoma de HO-1 funciona como una maquinaria tanscripcional y/o de procesamiento del RNA, que sería responsable de la modulación de los genes efectores de HO-1. LUGAR DE TRABAJO El presente plan de trabajo se realizará en el Laboratorio de Mecanismos Moleculares del cáncer, ubicado en el IQUIBICEN-CONICET, Ciudad Universitaria, Pabellón 2, Piso 2, CM1, Labratorio 2, FCEyN, UBA. Dentro de dicho laboratorio disponemos de todo el equipamiento necesario para el desarrollo del presente plan. Las determinaciones de espectrometría de masa se harán utilizando el Servicio del Centro de Estudios Químicos y Biológicos por Espectrometría de Masa UV/MALDI-TOF-TOF (CEQUIBIEM), ubicado en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires. Mi laboratorio cuenta con financiamiento propio provenientes de subsidios otorgados (Prostate Cancer Foundation, PICT , PIP CO) lo cual permitirá el financiamiento necesario para el desarrollo del presente plan. SUBSIDIOS PICT jóvenes PIP Grupo Investigación CO
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