ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREA. Dra. Elena Campos Chacón Centro Nacional de Referencia en Bacteriología - INCIENSA

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1 ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREA Dra. Elena Campos Chacón Centro Nacional de Referencia en Bacteriología - INCIENSA

2 ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREA IMPORTANCIA Variedad de agentes que se transmiten por alimentos Variedad de signos y síntomas inespecíficos Gastroenteritis (diarrea) Enfermedades febriles Otros síntomas de intoxicación (vómitos, neurológicos...) Entre las ETAS las enfermedades diarreicas son problema de salud pública Morbilidad Secuelas Mortalidad Brotes, epidemias o pandemias Para la prevención y control de estas enfermedades es indispensable conocer Agentes etiológicos causantes de las enfermedades diarreicas En cada contexto en particular (local, regional, nacional, internacional etc.) Identificar de la manera más precisa posible los vehículos de transmisión (aguas, alimentos, directa) Causas y fuentes de su contaminación

3 VIGILANCIA DE LAS ETAS Diarrea Artritis Cáncer Meningitis Meningitis Parálisis Par lisis Falla múltiple m de órganos Hepatitis Campyloacter Ulcera péptica ptica Shigella Salmonella Norovirus Vibrio cholerae Rotavirus Rotavirus Hepatitis

4 AGENTES CAUSANTES DE ETAS / DIARREA BACTERIAS Infecciones Shigella Escherichia coli Salmonella Aeromonas Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Otros vibrios Campylobacter Yersinia enterocolitica (Listeria monocitogenes) Toxi-infecciones Clostridium perfringens Intoxicaciones Staphylococcus aureus Bacillus cereus VIRUS: Hepatitis, Rota, Noro y Adenovirus PARASITOS: Cyclospora, Microsporidium..

5 VARIEDADE DE ALIMENTOS Y LAS MULTIPLES FORMAS DE CONTAMINARLOS

6 Demostración de la transmisión fecal realizada por Taylor, epidemiólogo de Londres

7 ACTIVIDADES DE LOS LABORATORIOS CUANDO HAY UN BROTE O EPIDEMIA Laboratorio nivel local Procesamiento iniciales Comunicación con las autoridades de salud del nivel local y el CNRB Recolección de muestras e información para procesar localmente y para enviar al CNRB Preparación y empaque de las muestras que se transportaran al CNRB Coordinación con el CNRB para el envío de las muestras Centro Nacional de Referencia (CNRB) Apoyo diagnóstico al nivel local Investigación por otros patógenos Confirmación y tipificación de patógenos Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos Apoyo logístico Coordinación con el CNRB para la devolución de resultados al expediente clínico

8 Centro Nacional de Referencia en Bacteriología Red Nacional de Laboratorios de Bacteriología CNRB TOTAL RNLB : 71 Nicaragua Públicos...63 CCSS (humanos)...58 AyA (aguas)...1 MAG (alimentos)...1 MAG (animales)...1 ITCR (alimentos)...1 UNA (veterinaria)....1 Morgue Judicial OIJ Privados Costa Rica P a n a m á

9 IDENTIFICACION DE PATOGENOS SEGUN TIPO DE MUESTRAS Clínicas humanas Clínicas animales (ídem. anterior ) Ambiente (aguas y alimentos, superficies) Para el Aislamiento primario se deben seguir los métodos aprobados USDA, AOAC, ISO, FDA,(Curso Nicaragua) Dependen de tipo y estado del alimento (matriz) Cantidad y condición del patógeno y flora contaminante y tipo de alimento dificulta la recuperación de patógenos como Salmonella, Shigella y Vibrio

10 BUSQUEDA DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS Dificultades Consume más tiempo Más difícil la recuperación del patógeno Matrices complejas Flora bacteriana normal competitiva Procesamiento del alimento (stress) Volumen de materiales Volumen de trabajo Encontrar restos del alimento implicado Selección de muestras y patógenos a analizar

11 Boleta de Diagnóstico Datos Demográficos Brote Signos Síntomas Fechas Antibióticos ticos

12 BOLETA DE SOLICITUD DE EXAMEN Nombre del paciente Edad Signos y síntomas Fecha y hora de inicio de síntomas Antibiótico terapia previa a la toma de muestra Alimento sospechoso Lugar de consumo de alimentos Dirección vivienda Casos asociados Nombre y teléfono del que solicita el análisis Permita el uso racional de los recursos de laboratorio y emitir un reporte de utilidad para el epidemiólogo BOLETA DE DIAGNOSTICO

13 CONSIDERACIONES GENERALES Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica Que investigarsa partir de una muestra de heces? Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA Uso de los resultados Establecer protocolo de análisis Los signos y síntomas clínicos del paciente Características de las heces El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a la obtención de la muestra Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar patógenos

14 CONSIDERACIONES GENERALES Basado en el protocolo y acorde a lo investigado el microbiólogo debe establecer las hojas de Solicitud de Examen por Enfermedad Diarreica Formato para rechazo de muestras Registro Resultados de las pruebas de laboratorio Resultados del Diagnóstico de Laboratorio. Comentarios o sugerencias acordes al mismo, las cuales podrían servir de mecanismo de actualización y divulgación de la información afín al hallazgo. Se deben reportar resultados negativos y positivos según lo investigado Se deben aclarar imitaciones del resultado ej. calidad de la muestra, los diagnósticos positivos por enteropatógenos, no sólo son de importancia para el clínico, sino también para alertar los sistemas de vigilancia epidemiológica

15 TIPOS DE MUESTRA PARA ESTUDIO DE BROTES Origen de muestra Pacientes con diarrea Manipuladores de alimentos Tipo de muestra Heces frescas, hisopado fecal o rectal en Medio Cary Blair Sangre (por solicitud del laboratorio) Post-mortem: contenido intestinal, hisopado rectal, sangre Heces, hisopado fecal o rectal en Medio Cary Blair Frotis faríngeo, lesiones de piel, uñas Sangre (a solicitud del laboratorio) Transporte Cada muestra identificada con el nombre y fecha de recolección y con su respectiva boleta Transportar al laboratorio lo más pronto posible en nevera con gel refrigerante, asegurando que no se congelen

16 CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA CLINICAS La muestra para cultivo debe ser recolectada: A partir del sitio infectado (heces, vómito, sangre) En la etapa aguda de la enfermedad Previo al inicio de antibióticos En cantidad suficiente y evitando la contaminación Con etiquetado apropiado: nombre, tipo de muestra, fecha de recolección, iniciales de quien recolectó la muestra Debe ser transportada al laboratorio en el menor tiempo posible, en condiciones de que garanticen la integridad de la muestra y del que la manipula

17 Equipo básico para recolección de muestras clínicas Sangre Heces Frascos estériles, boca ancha, con tapa hermética Hisopos estériles Medio de transporte Cary Blair Tubos vacutainer (tapón rojo) Agujas para vacutainer Torniquete Gradilla para tubos Algodón Alcohol 70 C Boletas de solicitud de análisis

18 EC CNRB MUESTRAS CLINICAS Paciente con diarrea muestra óptima (1 semana, sin tratamiento, recién recolectada) Paciente con diarrea muestra no óptima Paciente sin diarrea muestra no óptima (portadores asintomático etc.)

19 Diagnóstico de laboratorio MUESTRAS PARA SEROLOGÍA Humanos (pruebas febriles) Enfermos Portadores? Suero agudo Suero convaleciente Suero día 1 Suero día 15 5/5/2009 Interpretación: De utilidad en el diagnóstico de fiebre tifoidea y paratifoidea, no en salmonelosis. Basada en la seroconversión y/o puntos de corte de la población

20 PROCESAMIENTO INICIAL Normas laboratorio de Bioseguridad Nivel II. Incluyendo bata de laboratorio, guantes y lentes Atención al destapar por primera vez una muestra clínica Antes de iniciar el procesamiento de la muestra Leer la información clínico-epidemiológica que la acompaña (especialmente edad, días de evolución, la presencia o no de signos como la fiebre y/o vómito, el volumen y consistencia de las heces, otros enfermos asociados, viajes, etc.) Determinar la calidad y tipo de muestra

21 ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO Observar y anotar las características macroscópicas de la muestra (por ej. consistencia, color, olor así como la presencia de sangre, moco o de formas adultas de helmintos) Preparaciones para observar directamente al fresco la presencia de quistes y huevecillos de parásitos (obj. 10x y 40X) y empleando el 100X buscar la presencia de leucocitos, eritrocitos y la cantidad, morfología y tipo de motilidad de la flora bacteriana presente. Gram (100 x) morfología y características tintoriales de las bacterias proporción entre la flora Gram positiva y Gram negativa Búsqueda de morfotipos característicos de Campylobacter, Serpulina, esporulados, etc. Ziehl Nielsen (100 x) estructuras semejantes a Cryptosporidium y Cyclospora Con base a los resultados e información antes mencionada, el microbiólogo debe valorar los resultados obtenidos y determinar si la diarrea puede ser o no de origen parasitaria (mixtos). Valorar emitir reporte preliminar o definitivo

22 Centro Nacional de Referencia en Bacteriología Tóxico-infección n por C. perfringens (tipo A) Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA Sólo precedida por Salmonella Aparición repentina de cólicos, diarrea y náusea (generalmente sin vómitos ni fiebre) PI: 7 a 15 hr. Corta duración (menos de 24 hr) Productos cárnicos Aislamiento de al menos 10 5 cél/g alimento o 10 6 /g en heces Enterotoxina en heces o en cepas aisladas Toxinas: 13 toxinas diferentes* (tox A) Enterotoxina se libera cuando las bacterias se lisan durante la esporulación en el intestino

23 Diagnóstico de laboratorio MUESTRAS PARA CULTIVO Humanos (previo al inicio de la antibioticoterapia) Enfermos Portadores Agua Heces, hisopados rectales* Sangre (durante pico febril), Tejidos, orina, LCR, bilis, pus de abscesos Heces Enjuagues de manos 5/5/2009 Alimentos, ambiente (cantidad suficiente) Utensilios Materias primas Alimentos preparados * Transporte en medio Cary Blair

24 Coprocultivo Diferencias en cuanto al número y tipo de patógenos que se investigan Coprocultivo Básico aquel en el que al menos se investigó la presencia de Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae Incorporación progresiva de nuevos patógenos en los laboratorios, dependiendo de su nivel de complejidad, disponibilidad de recursos y características epidemiológicas propias del nivel y área respectiva de atención De acuerdo a las consideraciones anteriores en esta primera versión de los procedimientos de laboratorio, estaremos dando el énfasis al aislamiento y caracterización para Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. (Literatura adicional

25 Coprocultivo básico Aislamiento primario Primera fase del coprocultivo Recuperar los componentes que conforman la flora bacteriana de la muestra de heces, especialmente aquellos que presenten características semejantes a los enteropatógenos más reconocidos

26 Coprocultivo básico Aislamiento primario Obtener cultivos puros de cada uno de los organismos sospechosos enriquecimiento selectivo tiempos y temperaturas estrictas dilución por rayado recuperación de Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. medios adicionales para la recuperación de otros patógenos dependiendo de información Escherichia. coli enterohemorrágica (McConkey Sorbitol) Campylobacter (Skirrow) (Manual incluido en el CD) Salmonella Typhi (Agar Ssulfito Bismuto) Asigne a cada colonia aislada, además del código de muestra, un código de cepa en forma consecutiva (cepa 1,cepa 2,cepa 3,etc) que le permita reconocerla

27 F R O T IS Y C O P R O C U L T IV O B A S IC O R E D N A C IO N A L D E L A B O R A T O R IO S P A R A E L D IA G N O S T IC O D E L A S E D A S / C O L E R A. HECES LIQUIDAS HISOPADO RECTAL O HECES FORMADAS EXAMEN DIRECTO FROTIS SALINA LUGOL GRAM ZIEHL-NEELSEN 1 Resultado p reliminar ENRIQUECIMIENTO APA 6-18 H TETRATIONATO 18 H. G N 4-6 H * AISLAMIENTO PRIMARIO TCBS A. SANGRE TERGITOL-7 MAC-LACTOSA MAC-SOR BITO L INCUBAR C/18-24 H * EXAMINAR CRECIMIENTO EN PLACAS TCBS A. SANGRE MAC-LACTOSA TERGITOL-7 MAC-SORBITOL * PURIFICAR COLONIAS EN BHI ó ATS * OPCIONAL SMART MOTILIDAD 2 Pruebas BQ. CNREC-Inciensa, C.R. 01/05/00

28 AISLAMIENTO Y PRUEBAS BIOQUIMICAS BASICAS PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONELLA, SHIGELLA, ESCHERICHIA COLI Y YERSINIA MAC LACTOSA A TS Escherichia coli C itrobacter sp. Enterobacter sp. Klebsiella sp. S alm o n ella arizo n a Tablas 4 y 5 V ib rio vuln ificu s V. m etschnikovii Tablas 1 y 2 Aerom onas caviae A. hydrophila Tabla 3 CNREC- Inciensa, C.R OXIDASA TSI / KIA MOTILIDAD INDOL R.M. V.P. CITRATO ACETATO UREA LIA ONPG PRUEBAS ADICIONALES A R G IN IN A LISINA ORNITINA CORDON TN-0% NaCl TN-1% NaCl TN-8% NaCl S h ig ella sp. Escherichia sp. Salm onella sp. Citrobacter sp. Klebsiella sp. Y ersin ia sp. Edwardsiella sp. Proteus sp. M o rg an ella m o rg an ii Otros, Tablas 4 y 5 Vibrio cholerae V mimicus V. m etschnikovii V. cincinatiensis V. h ollisae V. dam sela V. flu vialis V. fu rn issii V. alginolyticus V. parahaem olyticus V. carchariae Tablas 1 y 2 Plesiom onas shigelloides Tabla 3 Aeromonas sobria A. schubertii A. veronii A. caviae A. hydrophila Tabla 3

29 Bacilos Gram negativos Oxidasa positivos Géneros: Sacarosa (+) V. V. cholerae Sacarosa (-) (-) V. V. mimicus V. V. parahaemolyticus Vibrio Aeromonas Plesiomonas Agar TCBS

30 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BIOQUIMICA BASICA PARA SALMONELLA, SHIGELLA Y ESCHERICHIA COLI TERGITOL-7 + TTC A TS PRUEBAS BIOQUIMICAS OXIDASA TSI / KIA MOTILIDAD IN DO L Shigella Salmonella Tablas 4 y 5 E. coli Tablas 4 y 5 Fermentadoras de lactosa diferentes a E. coli Tablas 4 y 5 R.M. V.P. CITRATO ACETATO UREA LIA ONPG CNREC-Inciensa - SEROTIPIFICACIÓN - BIOTIPIFICACION - FACTORES DE VIRULENCIA - RESISTENCIA ANTIBIOTICOS CNREC- Inciensa, C.R

31 Diagnóstico de laboratorio Pruebas bioquímicas básicas b para la identificación n del GéneroG Convencional Laboratorios 5/5/2009 Nivel 1

32 Diagnóstico de laboratorio Identificación n del GéneroG API VITEK Convencionales Confirmación n serológica Salmonella O antisera poly A-I y Vi Otros serogrupos O (no comprendidos en el polivalente anterior) 5/5/2009

33 SEROTIPIFICACIÓN

34 CAMPYLOBACTER

35 Fecas A 1 directo Medio de Skirrow Medio de Butzler Campy- bap Medio de Skirrow modificado 48 h, ºC Examen directo A 2 indirecto Medio selectivo Campy thio u otro (4 ºC, 18 h) (42ºC) 48 h, ºC

36 Método de filtración n en sangre

37 CAMPYLOBACTER: FILTRACIÓN

38

39 Campylobacter Colonias en Agar Sangre

40 Escherichia coli enteropatógena asociada a cuadros diarreicos, Costa Rica, 2004

41 Diarreas por Escherichia coli enteropatógena*, confirmadas en el CNRB, 2004 Virotipos de Escherichia coli Positivas / total % Enterotoxigénica (ETEC-ST, ETEC-LT) 118 / Enteroinvasiva (EIEC) 4 / Enteropatógena (EPEC) 2 / 32 6 Enterohemorrágica (EHEC) 0 / 49 - Enteroagregativa (EAggEC) 0 / 13 - Fuente: Centro Nacional de Referencia en Bacteriología-INCIENSA y Red Nacional de Laboratorios de Bacteriología

42 CONSIDERACIONES GENERALES Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica Que investigar a partir de una muestra de heces Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA Uso de los resultados Establecer protocolo de análisis Los signos y síntomas clínicos del paciente Características de las heces El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a la obtención de la muestra Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar patógenos.

43 Comunicación n de resultados Notificación n obligatoria de la enfermedad diarreica Reportes colectivos por semana epidemiológica de los episodios de diarrea Responsable de notificación: médico Notificación n de casos de diarrea por agentes de notificación obligatoria (ej. cólera, salmonelosis, shigelosis) Reporte individual inmediato Responsable de notificación: microbiólogo, médico

44 EC CNRB Participación n del CNRB en Evaluaciones Externas Internacionales EQAS MALBRAN RIILA

45 La contaminación n del alimento puede ocurrir en cualquier punto de la cadena Acuacultura Servicios de alimentación al público Entrega Ganadería Transporte Proceso Transporte y distribución Hogar Detallistas CONSUMIDOR Agricultura Malas prácticas agrícolas. Emisiones de vehículos y fábricas, aguas negras Fallas en Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), Fallas en el control de puntos críticos (HACCP)

46 BROTES DE FUENTE COMUN

47 TIPOS DE ALIMENTOS A RECOLECTAR EN BROTES ETA Origen de muestra Tipo de muestra Transporte Alimentos Sobras de los alimentos servidos (mínimo 100g) Sobras del alimento en su envase original Alimentos líquidos Mezcle para homogenizar Transfiera una porción a un envase estéril Alimentos sólidas Muestra rotulada, sellada y empacada individualmente de manera que el envase no se abra e introduzca contaminación externa Transportar en frío (4 C, gel refrigerante), lo más pronto posible al laboratorio Cada muestra requiere de una boleta Transfiera porciones de diferentes sitios para asegurar una muestra representativa Alimentos congelados No los descongele

48 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Guantes Lavado de manos con agua, jabón n y alcohol 70 Usar guantes, gabacha u otros implementos necesarios, dependiendo del agente sospechoso y del cuadro clínico Gabacha bozal Bolsas para material contaminado Usar tubos o frascos con tapas herméticas irrompibles No enviar elementos punzantes o cortantes No envolver los frascos de las muestras en las boletas de solicitud de análisis