Análisis de la apo A-II como gen candidato para la hiperlipemia familiar combinada

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1 [Index FAC] [Index CCVC] Cardiología Pediátrica/Pediatric Cardiology Análisis de la apo A-II como gen candidato para la hiperlipemia familiar combinada Gloria Rodríguez Pedregosa Carlos Díaz Medina Jesús Martín Campos Francisco Blanco Vaca Servicio de Bioquímica, Instituto de Investigación, Hospital de la Santa Cruz y San Pablo, Barcelona. En el estudio de las enfermedades, es imprescindible conocer las posibles variantes que puede tener el ADN en las poblaciones humanas. De esta manera se pueden formular y contrastar modelos que relacionan estas variantes con las diferencias entre individuos respecto al riesgo a padecer ciertas enfermedades. Con técnicas de biología molecular se han estudiado genes candidato involucrados en la patogenia bioquímica, fisiológica o molecular de una enfermedad. Pero estos estudios se han realizado en casos

2 clínicos, lo cual introduce un sesgo hacia alelos asociados con grandes efectos fenotípicos. Esta forma de trabajo es efectiva en enfermedades con pedigree, pero para enfermedades de etiología multifactorial compleja, el problema es explicar la razón de la aparición de diversos factores genéticos y ambientales. El primer paso para conseguir dicho objetivo es identificar la variabilidad genética presente en poblaciones humanas, para después estudiar la interacción del genotipo con el ambiente y poder determinar el peso que tiene cada una de estas variantes respecto a un fenotipo concreto. Entre las enfermedades de etiología multifactorial compleja, tenemos a la hiperlipemia familiar combinada (HFC). Figura 2 En la figura 2 podemos observar algunas características de esta enfermedad. La HFC es la dislipemia hereditaria oligogénica más común, con una prevalencia de aproximadamente 0,5 a 2% en la población general, constituyendo entre un 10 y un 20% de los supervivientes de infarto prematuro de miocardio [1]. Los individuos afectos presentan un fenotipo complejo, influido por factores genéticos, metabólicos y ambientales. La hiperlipemia se caracteriza por concentraciones elevadas de CT y/o TG, asociadas frecuentemente a bajas concentraciones de lipoproteínas de alta densidad (HDL), concentraciones de apolipoproteína B (apob) aumentadas e incremento de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) pequeñas y densas [2-4]. La característica metabólica mas sobresaliente de la HFC es la sobreproducción hepática de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) debido a un aumento en sangre de ácidos grasos libres (AGL), y puesta de manifiesto mediante estudios cinéticos [5-8]. La posterior eficacia en la lipólisis de estas partículas determinará el fenotipo hiperlipémico de cada paciente. Una mayor actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) consigue contrarrestar el aumento de VLDL, generando un mayor flujo de partículas remanentes que dará lugar a la formación de LDL y a hipercolesterolemia. Éstas suelen ser densas, pequeñas, aterogénicas y propensas a la oxidación [9,10]. Aunque originalmente se asumió como un desorden autosómico dominante [11], análisis posteriores de los datos originales del trabajo de Goldstein junto con un gran número de estudios de segregación en familias, han puesto de manifiesto que se trata de una enfermedad de herencia compleja en la que interviene más de un gen.

3 Características como la presencia de obesidad central [12-14] y resistencia a la insulina [14,15] acostumbran a estar asociadas a la enfermedad. Muchas de sus características son compartidas por otros síndromes como la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y el síndrome metabólico (sobreproducción de partículas de VLDL y/o catabolismo defectuoso de las mismas [16,17]). Figura 3 El hecho de que comparta algunos aspectos del fenotipo con los síndromes mencionados, es uno de los factores que dificulta el diagnóstico, pero no el único. La principal característica de la enfermedad se encuentra en la variabilidad de los patrones lipídicos y lipoproteicos entre diferentes miembros de la familia e incluso en el mismo individuo a lo largo del tiempo. Es decir, el individuo afecto puede manifestar hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia o ambos fenotipos en diferentes momentos, e incluso estadios de normolipemia [18]. Por esta razón, la caracterización genética resulta complicada e hipótesis biológicamente correctas pueden ser rechazadas equivocadamente debido a un mal diagnóstico. Recientemente se están presentando criterios de diagnóstico alternativos, que pretenden no solo simplificar, sino también detectar de una forma más consistente a los individuos afectos [19-23]. En la Figura 3 se representa un modelo de desarrollo de la HFC, según el cual uno o diversos genes con herencia autosómica dominante, aumentan la tasa de secreción de las VLDL aproximadamente al doble. Este hecho incrementa el flujo de partículas lipoproteicas a través de la cascada lipolítica. Las concentraciones de cvldl, cidl y cldl plasmáticas se pueden ver afectadas significativamente por otros genes modificadores que expresan diferentes apolipoproteínas o enzimas involucrados en el aclaramiento de estas lipoproteínas. Así pues, esta enfermedad puede ser debida a varias combinaciones de genes en diferentes familias. Por otra parte, no todos los individuos con predisposición genética desarrollan la enfermedad, ya que pueden presentar factores genéticos y/o ambientales (ejercicio físico, nutrición y otros) tanto protectores como

4 desencadenantes. Una manera de enfocar el estudio genético de este tipo de desorden es encontrar alelos marcadores que se hereden conjuntamente con el gen o genes que originan la enfermedad. Siguiendo los principios mendelianos, usando para ello el desequilibrio de ligamiento y empleando como parámetro estadístico el LOD score, se pueden localizar regiones del genoma que incluyen uno o más genes involucrados en la enfermedad [24-26]. Mediante estudios de ligamiento (en familias) o asociación (en individuos no emparentados) se analiza la variabilidad de dichos genes con los polimorfismos encontrados y/o los haplotipos resultantes y la enfermedad. Figura 4 Estudios de ligamiento realizados con marcadores repartidos a lo largo de todo el genoma apuntan a diversas regiones cromosómicas involucradas en el desarrollo de la HFC. Entre éstas destacan 1q21-q24, 11p14.1-q12.1 y 16q22-q24. Otros loci, menos importantes en términos de LOD score se encontrarían en 1p31, 6q y 8p [27]. La región 1q21-q24 parece ser la región más consistentemente relacionada no sólo con la HFC (Tabla 1), sinó también con la DM2, la disminución de chdl y el aumento plasmático de TG, tal y como se representa en la Figura 4. Tabla 1: Estudios de asociación entre la región 1q21-q24 y HFC. Muestra (familias HFC) Marcador/es LOD score Ref. 31 familias finlandesas D1S104 - D1S1677 5,93 [28] 24 familias alemanas D1S194 1,4 [29] 12 familias chinas D1S194 1,52 [29] 71 familias norte-americanas D1S104 - D1S1677 2,52 [30] 7 familias mejicanas D1S [31] La región comprendida entre las bandas q21.1 y q24.3 del cromosoma 1 tiene una longitud aproximada de 20 Mb y contiene alrededor de 450 secuencias que se transcriben. De éstas, aproximadamente un 65% corresponde a genes de función conocida o probable por homología con otros genes, mientras que del 35% restante aún se desconoce la función. Allí se encuentra el gen de la apoaii.

5 La apolipoproteína A-II (apoaii) es la segunda apoproteína más abundante de las partículas de HDL, representando el 20% de su contenido apoproteico. Se sintetiza principalmente en el hígado y en pequeñas cantidades en el intestino delgado. Su función aún es desconocida [32-35], pero se sabe que influye en la remodelación y el metabolismo de las partículas de HDL [36,37]. Su relación con la HFC está demostrada mediante extensos estudios realizados en animales de laboratorio. Se ha descrito que la sobreexpresión de apoaii humana o murínica en ratones aumenta la susceptibilidad a desarrollar arteriosclerosis [34,38,39], induce hipertrigliceridemia, aumenta la concentración de AGL y en algunos casos induce resistencia a la insulina [34,39-42]. Por otra parte en ratones deficientes de la apoproteína AII se dan fenotipos opuestos: aumento de la sensibilidad a la insulina y disminución de AGL y VLDL [43]. La sobreexpresión de apoaii en ratones deficientes en apolipoproteína E (apoe) ha servido como modelo de HFC, apoyando la idea de que esta proteína puede tener un papel destacado en el desarrollo de HFC [40]. Además, se ha observado que las concentraciones de apoaii plasmáticas son superiores en los individuos afectos que en los no afectos en familias con HFC [44]. El gen APOA2 se localiza en 1q23.3, tiene una longitud aproximada de 3 Kilobases (Kb) y está formado por 4 exones ( EnsembleDatabase:ENSG ). La heredabilidad (h²) de los niveles plasmáticos de apoaii, es decir, el efecto del gen sobre dichos niveles, es variable: se ha observado desde un valor de 0,48 en gemelos australianos hasta un valor de 0,82 en gemelos daneses [45]. A partir de diversos estudios poblacionales sobre el gen, se han descrito un total de 16 polimorfismos (frecuencia superior al 1%), 1 microsatélite y 4 mutaciones (encontradas en fenotipos alterados y cuya frecuencia es inferior al 1%) [46-52]; en la Figura 15 [53] se representa la localización de éstos a lo largo del gen. Figura 5 El objetivo principal de este trabajo es determinar la posible asociación entre la variabilidad existente en el gen APOA2 en una población española, y los caracteres fenotípicos de la HFC asociados al perfil lipídico y resistencia a la insulina. Los objetivos secundarios parciales son: Análisis de la variabilidad nucleotídica en el gen APOA2 por secuenciación: determinación de las posiciones polimórficas y de la estructura haplotípica. Comparación con los resultados de otros estudios en otras poblaciones. Estudio de posibles diferencias en las frecuencias génicas y haplotípicas entre casos y controles. Caracterización bioquímica y clínica de dos poblaciones españolas: una de enfermos de HFC y otra de controles sanos. Relación con el perfil lipídico y resistencia a la insulina.

6 Análisis estadístico de la posible asociación entre genotipo y fenotipo. Figura 6 La población de estudio se dividió de la siguiente manera: El grupo de controles está formado por 56 individuos sin dislipemia, hipertensión y/o diabetes y sin antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular; 36 son hombres y 20 son mujeres. El grupo de pacientes está formado por 56 individuos (20 mujeres y 36 hombres) diagnosticados con hiperlipemia familiar combinada en base a: Presencia en la familia de dos o más miembros de primer grado afectos de hiperlipemia mixta o de combinaciones de fenotipos, entre hipercolesterolemia pura (IIa), hiperlipemia mixta (IIb) o hipertrigliceridemia (IV). En adultos, colesterol total (CT) por encima de 240 mg/dl (o cldl>160 mg/dl) y/o triglicéridos (Tg) por encima de 200 mg/dl. En menores de 20 años, CT>200 mg/dl (o cldl>130 mg/dl) y/o Tg>120 mg/dl

7 Figura 7 Criterios de exclusión del estudio: a. Presencia de xantomas tendinosos en la familia b. cldl>300 mg/dl en dos o más familiares de primer grado con fenotipo IIa c. Índice de masa corporal (IMC) >35 Kg/m² d. HbA1C>10% (en individuos con hiperlipemia mixta o hipertrigliceridemia) e. Hipotiroidismo no controlado (TSH>5 mui/l) f. Consumo de alcohol >40g/dia g. Consumo de fármacos (corticoides, antipsicóticos de nueva generación) h. Enfermedad hepática, insuficiencia renal, procesos inflamatorios agudos, transplantes, infecciones en fase aguda, neoplasias y procesos crónicos en general. i. Genotipo APOE E2/E2 (la mayoría de pacientes con disbetalipoproteinemia o hiperlipoproteinemia tipo III son portadores de este genotipo). Figura 8 Las muestras de suero se recogieron tras 10 h de ayuno, en el caso de los pacientes llevaban alrededor de 2 meses sin tomar medicación hipolipemiante.

8 Figura 9 El grupo de pacientes está formado por 20 individuos con hipercolesterolemia, 8 con hipertrigliceridemia, 23 con hiperlipemia mixta y 5 aparentemente normolipémicos. Una información más amplia de la muestra HFC se presenta en la Figura 9. Nótese que más de la mitad de los pacientes con HFC presentan un IMC mayor de lo normal, y casi la tercera parte de este grupo presenta insulino resistencia y está con tto. antidiabético y/o hiperglicemia. La obesidad abdominal, visceral, central, centrípeta, androide o tipo manzana, que es clave para la génesis del síndrome metabólico, se evalúa desde el punto de vista clínico, midiendo la circunferencia de la cintura a la altura del ombligo, en la línea media entre el reborde costal y las crestas ilíacas. Se consideran valores normales de < 94 cm en el hombre y < 80 cm en la mujer [54,55]. En el presente estudio el promedio del grupo HFC fue de 95 cm. Tanto para hombres como para mujeres. Figura 10 Los resultados de la comparación del perfil bioquímico entre la muestra control y la muestra HFC se presentan en la Figura 10; los dos grupos tienen el mismo número de individuos e igual número de

9 hombres y mujeres (36:20) y no hay diferencias significativas en cuanto a la edad. Se encuentran diferencias significativas en todos los parámetros medidos, a excepción de LpAI, LpAI:AII, apoaii y ApoAI/ApoAII. Figura 11 En la Figura 11 se muestran las variables que están correlacionadas, tanto en la muestra control como en la HFC, así como si la correlación es positiva o negativa, y como se puede observar, en los dos grupos las variables tienen el mismo comportamiento. Figura 12

10 En la muestra de HFC se han obtenido resultados que demuestran el nivel de alteración del metabolismo lipídico de estos pacientes, presumiblemente originados a través de una sobreproducción de VLDL. Esta alteración, además, se manifiesta con hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y un fenotipo proaterogénico caracterizado por una disminución de chdl y un aumento de VLDL y LDL, siendo además estas últimas más pequeñas y densas [4]. Las apolipoproteínas C3, E y B, probablemente aumentan como consecuencia del aumento de las VLDL y LDL. En la figura 12 se observa que entre mujeres y hombres en cuanto a edad y colesterol total no hay diferencias, pero en triglicéridos totales, colesterol HDL y colesterol VLDL sí. Esto es debido a que en hombres la concentración de triglicéridos es mayor, en cambio en mujeres la concentracion de colesterol HDL es mayor. Cabe señalar que el perfil proaterogénico en mujeres fisiológicamente debe ser mayor debido a su sistema hormonal, que es distinto al de los hombres [56]. Figura 13 En individuos con HFC se ha descrito un aumento de la concentración plasmática de apoaii y una correlación positiva entre apoaii y niveles de TG y apob [44]. En individuos sanos, se ha encontrado correlación de la apoaii con NEFA [57]. Sin embargo, en el grupo de pacientes de este estudio no se ha encontrado ni aumento de apoaii ni las correlaciones descritas. En cambio, las partículas de HDL en los individuos con HFC están empobrecidas en colesterol respecto al grupo control. De ahí que se haya observado una correlación positiva entre la proporción de apoai/chdl y apoaii/chdl con TG, VLDL, NEFA y apob en el caso de apoaii/chdl. Nuestros resultados sugieren que más que la variación en la concentración plasmática de apoaii, es la relación apoaii/chdl la que podría estar asociada a ciertas características bioquímicas de la HFC, aunque no se puede inferir una relación causal entre niveles de apoaii y las variables señaladas. Esta alteración en la proporción lípido-proteína de las HDL podría influir en el proceso de esterificación del colesterol y, consecuentemente, en una alteración funcional en el transporte reverso de colesterol en pacientes. Esto es consistente con las correlaciones observadas entre el porcentaje de CL y apoaii/chdl.

11 Figura 14 En la figura 14 se presentan en forma resumida algunos resultados obtenidos en el presente estudio. Figura 15 En este estudio, los análisis estadísticos demuestran que los polimorfismos estudiados del gen APOA2 se mantienen en el equilibrio de Hardy-Weinber para genética de poblaciones.

12 Figura 16 Asimismo, no se han detectado polimorfismos que afecten a la composición aminoacídica de la proteína, pero sí dos SNPs situados en la región promotora del gen. No se han encontrado diferencias en la frecuencia de los polimorfismos entre el grupo control y el grupo HFC. El polimorfismo 365 (C>T) situado en la región promotora no está descrito en la base de datos, pero por su localización no parece afectar a ningún elemento regulador de la transcripción aunque no se han realizado estudios funcionales, ni tiene relación con niveles diferentes de apoaii. En la muestra sólo 3 individuos son heterocigotos en esta posición, 2 de ellos controles, y por este motivo no se han hecho los análisis estadísticos. En cuanto al segundo polimorfismo encontrado en la región promotora (el 265 (T>C)), en diversos estudios se le relaciona con una disminución en los niveles de apoaii en plasma [47] y de cldl y CT en familias con HF [58]. En este trabajo no se confirman estas relaciones, aunque en HFC la asociación entre el alelo C y concentraciones disminuidas de apoaii se acerca a la significación con un valor de p de 0,072.

13 Figura 17 Únicamente se han obtenido asociaciones significativas dentro del grupo control para 4 polimorfismos no funcionales: 904 (G>C), 1685 (C>T), 1860 (C>T) y 1894 (T>C), que constituyen el haplotipo 3, asociados en presencia del alelo menos frecuente con valores elevados de CT, apob y CL, además de LDL y LpAI:AII en el último caso. El polimorfismo 1860 (C>T), que afecta a una diana para la enzima de restricción MspI, ha sido relacionado en individuos sanos con niveles de apoai, apoaii y TG, [59-62] aunque en este estudio no se ha confirmado tal asociación. Por tanto, es un polimorfismo que probablemente se encuentre en desequilibrio de ligamiento con una mutación funcional próxima que influye en el metabolismo lipídico. Figura 18 Sin embargo, los haplotipos en los cuales se encuentra dicho polimorfismo no contienen ningún polimorfismo funcional, con lo cual no parece que la variante responsable de la señal se encuentre en el

14 gen APOA2. En el grupo HFC no se ha encontrado ninguna asociación significativa, solamente en el caso de los polimorfismos: 904 (G>C), 1685 (C>T) y 1860 (C>T) se acercan a la significación con una valor de 0,053 en relación al diámetro de las partículas de LDL, aunque el tamaño muestral es demasiado pequeño, de solamente 4 individuos. Figura 19 El único polimorfismo funcional descrito en el gen APOA2, el polimorfismo 265 (T>C) localizado en la región promotora del gen, no influye significativamente en los niveles de apoaii en ninguno de los dos grupos de estudio. Estas variantes están en desequilibrio de ligamiento con variantes funcionales de otro gen cerca de APOA2 Cuatro de los 10 polimorfismos identificados en la secuencia están asociados a CT, apob, CL, cldl y LpAI:AII, únicamente en el grupo control. Estos resultados pueden ser indicadores de que existe cerca de esta región una o más mutaciones que influyen sobre estas variables, pero en el grupo de HFC son otros los factores que tienen más peso sobre el fenotipo lipídico de la enfermedad y, por tanto, enmascaran el efecto hallado en controles. Bibliografía 1. Brunzell, J.D., et al., Myocardial infarction in the familial forms of hypertriglyceridemia. Metabolism, (3): p Bredie, S.J., et al., Inherited susceptibility determines the distribution of dense low-density lipoprotein subfraction profiles in familial combined hyperlipidemia. Am J Hum Genet, (4): p Hokanson, J.E., et al., LDL physical and chemical properties in familial combined hyperlipidemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol, (4): p Ayyobi, A.F. and J.D. Brunzell, Lipoprotein distribution in the metabolic syndrome, type 2 diabetes mellitus, and familial combined hyperlipidemia. Am J Cardiol, (4A): p. 27J-33J 5. Janus, E.D., et al., Kinetic bases of the primary hyperlipidaemias: studies of apolipoprotein B turnover in genetically defined subjects. Eur J Clin Invest, (2 Pt 1): p Chait, A., J.J. Albers, and J.D. Brunzell, Very low density lipoprotein overproduction in genetic forms of hypertriglyceridaemia. Eur J Clin Invest, (1): p Venkatesan, S., et al., Stable isotopes show a direct relation between VLDL apob overproduction and serum triglyceride levels and indicate a metabolically and biochemically coherent basis for familial combined hyperlipidemia. Arterioscler Thromb, (7): p Aguilar-Salinas, C.A., et al., A familial combined hyperlipidemic kindred with impaired apolipoprotein B catabolism. Kinetics of apolipoprotein B during placebo and pravastatin therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol, (1): p Hokanson, J.E., et al., LDL physical and chemical properties in familial combined hyperlipidemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol, (4): p Dejager, S., E. Bruckert, and M.J. Chapman, Dense low density lipoprotein subspecies with diminished

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17 Pablo, Universidad Autónoma de Barcelona, auspiciado por la Fundación Carolina ( ) en Barcelona, España. - Miembro de la Sociedad Peruana de Pediatría (1993). Miembro de la Sociedad Peruana de Alergia e Inmunología (1997). - Miembro de la Sociedad Japonesa de Cardiología Pediátrica (2000). Miembro del Col legi Oficial de Metges de Barcelona (2004). - Licenciado (1988) en Biología, Universidad de Barcelona (UB). - Doctor en biología por la Universidad de Barcelona (UB), realizó la tesis en el campo de la Genética de Poblaciones y la Evolución Molecular, en el grupo de Genética Molecular Evolutiva del departamento de Genética de la UB, dirigido por la Dra. Montserrat Aguadé. - Profesor asociado en la UB, becario de investigación en el Hospital Clínico y Provincial de Barcelona y en el Instituto Municipal de Investigación Médica (IMIM) de Barcelona. - investigador del Institut de Recerca del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, y desde 2002 profesor asociado en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Autonoma de Barcelona (UAB). Director de 2 tesinas y autor de 15 publicaciones, 3 nacionales y 12 internacionales. - Director e investigador principal de un proyecto financiado por la industria farmaceútica y alimentaria. Su área de interés se centra en la genética de las enfermedades complejas, principalmente la hiperlipemia familiar combinada y la diabetes de tipo 2. - Licenciado -Sobresaliente- (1983) en Medicina y Cirugía, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). - Residente Bioquímica Clínica (via MIR), Hospital Santa Creu i Sant Pau (HCSSP) ( ). Especialista en Bioquímica Clínica (1987). Research Associate. Baylor College of Medicine and The Methodist Hospital. Division of Lipoprotein and Atherosclerosis Research. Houston, Texas ( ). - Doctor -Apto Cum Laude y Premio extraordinario- (1992) en Medicina y Cirugía, UAB. - Investigador, Institut de Recerca HSCSP (Bioquímica) desde 1993 hasta la actualidad. - Investigador nivel III (máxima categoría profesional). - Jefe de Laboratorio (máxima categoría Gestión). - Médico de guardias, Servei de Bioquímica HSCSP, Jefe de Sección de Metabolismo y Patología Molecular, Servei de Bioquímica HSCSP, desde Septiembre 2000 hasta la actualidad. - Investigador principal en tres proyectos financiados por la industria farmaceutica y alimentaria. - Codirector de curso de doctorado, puntualmente profesor de la UNED, de l'escola Universitària d'infermeria de l'hscsp - Profesor visitant, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, UAB. Publicación: Octubre 2005 Tope FORMULARIO DESACTIVADO A PARTIR DEL 1ero. de Diciembre de 2005 Preguntas, aportes y comentarios serán respondidos por el relator o por expertos en el tema a través de la lista de Cardiología Pediátrica Llene los campos del formulario y oprima el botón "Enviar"

18 5 Preguntas, aportes o comentarios: 6 Nombre y apellido: Dirección de País: Argentina 6 Enviar Borrar Dr. Diego Esandi Co-Presidente Comité Científico Correo electrónico Dra. Silvia Nanfara Co-Presidente Comité Científico Correo electrónico Prof. Dr. Armando Pacher Presidente Comité Técnico/Organizador Correo electrónico CETIFAC - Bioingeniería UNER Webmaster Actualización: 12-nov-10