TEMA 5 SEROLOGÍA I. PRUEBAS SEROLÓGICAS. CONCEPTO Y UTILIDAD II. PROPIEDADES DE LA PRUEBA SEROLÓGICA III. CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES SEROLÓGICAS

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1 TEMA 5 SEROLOGÍA I. PRUEBAS SEROLÓGICAS. CONCEPTO Y UTILIDAD II. PROPIEDADES DE LA PRUEBA SEROLÓGICA III. CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES SEROLÓGICAS 1. REACCIÓN DE PRECIPITACIÓN 2. REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN 2.1 AGLUTINACIÓN DIRECTA 2.2 AGLUTINACIÓN PASIVA - VARIOS ENSAYOS. AGLUTINACIÓN CON LATEX 2.3 AGLUTINACIÓN CUANTITATIVA: TÍTULO DE SEROAGLUTINACIÓN 3. REACCIÓN DE INMUNOFLUORESCENCIA 3.1 IFD 3.2 IFI 3.3 TÉCNICA TRACE 4. ENZIMOINMUNOANÁLISIS. EIA 4.1 ELISA ELISA SANDWICH PARA DETERMINACIÓN DE ANTÍGENO ELISA INDIRECTO PARA DETERMINACIÓN DE AC ELISA OTROS ENSAYOS: DIRECTO,COMPETITIVO,CAPTURA. 4.2 ELFA 4.3 MEIA 5. INMUNOCROMATOGRAFÍA (ICT) DE FLUJO LATERAL- LATERAL FLOW 6. WESTERN-BLOT 7. QUIMIOLUMINISCENCIA 7.1 REACCIÓN DE QUIMIOLUMINISCENCIA 7.2 CLIA, CMIA Y CLEIA 8. NUEVA GENERACIÓN DE INMUNOENSAYOS, MFI: MULTIPLE FLOW INMUNOASSAY, MULTIPLEX FLUORESCENT IMMUNOASSAY Ó ENSAYO DE FLUJO MÚLTIPLE (ENSAYO DE MICROPARTÍCULAS + CITOMETRÍA DE FLUJO) 1

2 I. PRUEBAS SEROLÓGICAS. CONCEPTO Y UTILIDAD Las Pruebas serológicas son Técnicas de diagnóstico de laboratorio con fundamento inmunológico basadas en la detección de una reacción Antígeno- Anticuerpo. Son muy útiles porque nos permiten identificar Antígenos (Ag) en una muestra disponiendo de Anticuerpos (Ac) conocidos y viceversa En Microbiología ó Serología de Enfermedades Infecciosas las Pruebas de determinación de Anticuerpos permiten el diagnóstico microbiológico indirecto, que se refiere a que el diagnóstico no se hace por aislamiento e identificación del microorganismo causante de la infección, sino a través de la respuesta inmune del huésped, es decir, de forma indirecta. Las pruebas serológicas también permiten diagnóstico directo si lo que se determina es Antígeno del microorganismo ej. El Ag p24 de VIH ó el HBs Ag que es el Ag de superficie del VHB (Virus de Hepatitis B) Se utilizan con fines: Cualitativos: demostrar si el paciente tiene o no antígenos ó anticuerpos frente a un/unos patógenos determinados Cuantitativos: qué concentración o tasa de ellos tiene. En la determinación de Ac esto es útil ya que para muchas infecciones es posible correlacionar la concentración de Ac con la situación clínica, ya que una determinada tasa de Ac se asocia con el estado de enfermedad ó permite decidir si aquella ha sido una respuesta eficiente como resultado de una vacunación ó por el contrario es una concentración ó tasa baja y dicha vacunación no ha aportado protección. Permiten determinar Patrones de infección como el Patrón de infección aguda ya que como norma general se considera que hay infección aguda: con la demostración de Ac de clase IgM específica para el microorganismo. con la observación de un incremento en la concentración de IgG específica en dos muestras separadas en el tiempo, habitualmente dos semanas, que nos indica la presencia de un estímulo antigénico en ese momento, o lo que es lo mismo, la existencia de una infección aguda. (Se suele considerar significativa la obtención de un aumento entre las dos muestras de al menos cuatro veces el Título de anticuerpos, cuádruple del Título inicial) Esta interpretación se basa en la Evolución la Respuesta inmune (RI): Cuando un individuo se pone en contacto con un antígeno por primera vez ó RESPUESTA INMUNE PRIMARIA (RI 1ª) ocurren los siguientes fenómenos que se relacionan con el diagnóstico serológico: 2

3 1. La Respuesta se produce tras un periodo de latencia. Hay una Aparición precoz de anticuerpo específico de clase IgM que es por tanto el 1º en aparecer (M, al Momento ) La concentración de este anticuerpo no es muy alta y su persistencia es generalmente corta. Por eso la detección de IgM específica a unas concentraciones determinadas y dada la brevedad de su duración nos faculta para realizar un probable diagnóstico de la infección aguda. 2. Aparición algo más tardía de anticuerpo específico de clase IgG. La concentración de este anticuerpo va creciendo hasta alcanzar, en 3-6 semanas, una meseta que muy lentamente desciende. Su persistencia suele ser muy prolongada, mucho mas allá de la curación del enfermo y en ocasiones es detectable durante toda la vida. Una nueva exposición al Ag ó RESPUESTA INMUNE SECUNDARIA 2ª induce una respuesta de Ac reforzada. La activación de linfocitos memoria preformados da lugar a una producción de Ac mucho más rápida sin periodo de latencia, más intensa alcanzando un título más alto, más duradera y con mayor predominio de IgG y de Ac de mayor afinidad RI 2ª - MÁS RÁPIDA, NO LATENCIA - MÁS INTESA, MAYOR CONCENTRACIÓN DE Ac - MÁS DURADERA - PREDOMINIO DE IgG - Ac DE ALTA AFINIDAD La IgG se relaciona con Infecciones crónicas ó Infecciones pasadas. II. PROPIEDADES DE LA PRUEBA SEROLÓGICA Especificidad: Capacidad que presenta un antisuero para reaccionar con un antígeno específico que es el que se quiere determinar, discriminando entre antígenos (ó haptenos) de estructura similar (ó viceversa) Los errores: Falsos + (FP) por detectar antígenos/ac que no son los específicos que se quieren determinar Se puede definir como el porcentaje de verdaderos negativos que serán detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas con especificidades casi del 100%. Sensibilidad: Cantidad mínima de anticuerpo o antígeno que es capaz de detectar. Cuanto menor cantidad de Ag/Ac detecte, mayor es la sensibilidad. Los errores: Falsos (FN) por no detectar Ag ó Ac presentes en el ensayo. La medida de sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que están en la situación que queremos diagnosticar. Cuantos más resultados positivos produzca en este grupo de enfermos mas sensibilidad tendrá la prueba y menos resultados falsos negativos (FN) obtendremos; se puede definir pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en 3

4 individuos con esa enfermedad y esa técnica. En serología es difícil tener pruebas con el 100% de sensibilidad III. CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES SEROLÓGICAS 1. REACCIÓN DE PRECIPITACIÓN Es la más simple de la reacciones antígeno- anticuerpo Definición: Consiste en la aparición de una PRECIPITADO VISIBLE cuando se enfrenta un ANTÍGENO SOLUBLE con su inmunosuero correspondiente. Participan por tanto Ag y Ac solubles que van a formar inmunocomplejos que precipitan cuando están en proporción equivalente. La reacción de precipitación tiene lugar en la zona de equivalencia que es aquella en que Ag y Ac se encuentran en proporciones óptimas y se puede formar una red ó complejo de moléculas de Ag y Ac de gran tamaño que pierde solubilidad y precipita. ANTIGENOS SOLUBLES, MOLÉCULAS 4

5 Precipitación en medio líquido Precisa de una proporción adecuada de antígeno y anticuerpo para que la precipitación sea visible Cualitativa y cuantitativa La reacción cualitativa recibe el nombre de prueba del anillo o precipitación de la interfase Permite identificar antígeno disponiendo de los antisueros correspondientes Necesitamos tubos de pequeño diámetro Se deposita en el fondo el antisuero El Ag se deja resbalar por las paredes del tubo En la interfase de ambos líquidos aparecerá un disco de precipitación blanquecino Precipitación en medio sólido Los antígenos y anticuerpos son incorporados a un medio gelificado donde difundirán En el lugar donde se encuentren en sus respectivas proporciones óptimas aparecerá una línea ó área de precipitación blanquecina Ejemplo de precipitación en gel cuantitativa mediante Técnica de IDR ó Inmuno difusión Radial simple de Mancini En el agar impregnado con Ac se practican pocillos donde se dispensa la muestra con el Ag a estudiar. El Ag difunde en el agar hasta alcanzar la zona de equivalencia donde los complejos Ag-Ac precipitan formando un anillo cuyo diámetro (ó área) es proporcional a la concentración de Ag presente en la muestra. En una curva de calibración ó estándar se extrapolan las medidas de los problemas y se obtienen los valores de sus concentraciones. 5

6 2. REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN Definición: Fenómeno que se observa cuando se mezclan ANTÍGENOS PARTICULADOS en suspensión con suero que contenga Ac frente a ellos El resultado de la unión Ag-Ac es la FORMACIÓN DE AGREGADOS Ó AGLUTINADO DE PARTÍCULAS DETECTABLE (BACTERIAS, CÉLULAS, PARTÍCULAS INERTES) Los antígenos más frecuentes implicados forman parte de bacterias, células como hematíes (hemaglutinación) u otras partículas como en el caso de antígenos unidos a partículas inertes. Los Ac IgM son los más eficaces en la aglutinación. La agitación (manual ó con un agitador mecánico) facilita la formación de agregados aumentando la velocidad de aglutinación ANTÍGENOS PARTICULADOS, PARTÍCULAS CLASIFICACIÓN: Aglutinación directa Aglutinación indirecta ó pasiva 2.1 REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN DIRECTA Se caracteriza porque el antígeno forma parte de forma natural de la partícula aglutinada. Se enfrenta un antisuero conocido a una suspensión de antígeno desconocido ó viceversa. Cualitativa o cuantitativa Se realiza en tubo o portaobjeto Se utiliza para la detección de bacterias. Una utilidad importante en Microbiología es la de realizar la serotipificación de bacterias. Por ejemplo para diagnóstico de Salmonelosis hay Pruebas de aglutinación con antisueros específicos que permiten determinar los antígenos de salmonella(ag O, Ag H) y diagnosticar el grupo y tipo de Salmonella causante de la infección. Pro-Lab Diagnostics Vision* Salmonella Slide Agglutination Antisera 6

7 2.2 AGLUTINACIÓN PASIVA Ó INDIRECTA Se basa en que los antígenos solubles pueden fijarse por diversos procedimientos sobre partículas inertes: Hematíes, colesterol, partículas de látex de poliestireno Las partículas recubiertas de Ag reaccionaran con los Ac de la muestra. Su característica diferencial con respecto a la aglutinación directa es que el antígeno no forma parte natural de la partícula aglutinada sino que ha sido fijado ó adsorbido a ella. Se dice que las partículas están sensibilizadas con el Ag. Hay también ensayos de aglutinación pasiva en los que se fijan anticuerpos sobre las partículas inertes, en este caso las partículas recubiertas de Ac reaccionaran con Ag de la muestra. Estas partículas a las que se fija el antígeno ó el anticuerpo no intervienen en la reacción inmunológica específica, se utilizan como soporte para hacer visible la reacción específica Ag-Ac mediante el agregado de partículas formado. Si se utilizan hematíes: Hemaglutinación pasiva Alta sensibilidad Varios tipos de Ensayos de Aglutinación pasiva: Ensayo de Aglutinación pasiva de Hemaglutinación porque usa como partícula de soporte hematíes a los que se fija antígeno. Aglutinación pasiva El Ag, por ejemplo de Treponema palidum, (cuadrado verde) de fija a hematíes y se enfrenta a suero del paciente. Si el suero presenta Ac contra el Treponema se producirá aglutinación y podrá cuantificarse. Esta prueba es la de Hemaglutinación para Treponema pallidum ó TPHA ( T. Pallidum Haemaglutination Assay) Ensayo de Aglutinación pasiva con partículas de colesterol como soporte de antígenos Partículas de Colesterol (círculos amarillos) sensibilizadas con cardiolipina ( cuadrados verdes) para el diagnóstico de la sífilis. Es una prueba no treponémica porque se usa un Ag que es la cardiolipina que no es del treponema, pero los Ac de los pacientes denominados Reaginas reaccionan con éste Ag usado para el Dg serológico (Prueba VDRL). Hay una variante que usa partículas de carbón como soporte para Antígeno cardiolipinacolesterol-lectina, se denomina RPR-carbón y es una Prueba rápida de reaginas 7

8 plasmáticas que permite ver la aglutinación macroscópicamente en una tarjeta gracias a las partículas de carbón con Ag que aglutinaran formando grumos si en la muestra hay reaginas, Ac. Aglutinación pasiva Ensayos de Aglutinación con Látex: Es un tipo de Prueba muy utilizada. Partículas de látex de poliestireno de 0,25-0,8 µm de diámetro se usan para la fijación tanto de antígenos como de anticuerpos y sirven de base para ensayos de determinación de anticuerpos ó de antígenos respectivamente. Si los Ag ó Ac están presentes en la muestra y reaccionan Con las partículas de látex (con ac ó ag fijados) se producirá la aglutinación de las partículas formando grumos y perdiendo la suspensión el aspecto homogéneo Hay una gran variedad de Pruebas rápidas en Microbiología con fundamento de aglutinación con látex. Pruebas rápidas de Antígeno: Látex recubierto de Ac Sobre una tarjeta de reacción se mezclan la muestra clínica que alberga al antígeno con el reactivo que contiene a los anticuerpos específicos. Al entrar en contacto los anticuerpos mediante los dos puntos de unión con el antígeno establecen entramados de muchas moléculas de antígeno y de anticuerpos. Esta aglutinación de partículas antigénicas forma grumos (Figuras 2a y 2b). Para que estos grumos sean fácilmente visibles macroscópicamente, los anticuerpos están unidos por el fragmento Fc a partículas inertes de mayor tamaño, partículas de látex. 8

9 Determinación de Rotavirus: Test rápido para la determinación de Rotavirus grupo A en heces que es una de las principales causas de Diarrea infantil severa ( de 6 a 24 meses) El test contiene Ac. Polivalentes de conejo contra Rotavirus Grupo A, ligados a partículas de látex Diagnóstico de Meningitis: Test de Látex para detección de antígenos de bacterias causantes de meningitis. El test contiene anticuerpos para la detección de polisacáridos capsulares (antígenos) en LCR, suero y orina. Detección de los siguientes agente etiológicos Haemophilus influeza b Streptococcus pneumoniae Streptococcus grupo B Neisseria meningitidis (A,B,C,Y,W135) Escherichia coli K1 Meningitis Combo Test Kit Visible agglutination occurs when a sample containing any of these bacterial antigens is reacted with its respective antibody-coated latex beads. Pruebas rápidas de Anticuerpo: Látex recubierto de Ag Determinación de Anticuerpos de Mononucleosis infecciosa: Prueba de Paul- Bunnell, MONOGEN R Mononucleosis Latex Test: partículas de latex recubiertas de antígeno de Paul Bunnell de eritrocitos bovinos altamente purificado permiten la detección de anticuerpos heterófilos de MI en suero ó plasma Determinación de ASLO (anticuerpos antiestreptolisina O) con ASLO- Látex partículas de látex recubiertas de estreptolisina permiten detectar y semicuantificar anticuerpos en suero en niveles clínicamente significativos 9

10 2.3 LA REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN CUANTITATIVA permite una estimación de los anticuerpos presentes en el suero mediante: Título de seroaglutinación Se realiza con una batería de tubos ó pocillos, diluciones crecientes del suero problema y suspensión constante de la suspensión antigénica Título: inversa de la máxima dilución del suero que presenta reacción de aglutinación. Se puede expresar así ó con la dilución misma. Por ej. Si un suero a dilución 1/8 aglutina y a 1/16 no aglutina, el Título sería 8 ó bien 1/8 En la placa de Hemaglutinación se colocan diluciones seriadas del suero problema (hileras 1 a 10). Se incluyen controles positivos (hilera 11) y negativos (hilera 12). Se añade a cada pocillo una suspensión de eritrocitos (conteniendo una proteína para evitar que se aglutinen inespecíficamente) Si hay aglutinación las células se hunden y se depositan como una alfombra en el fondo del pocillo. En la parte superior izquierda del esquema vemos aglutinación directa ya que el antígeno forma parte natural de la partícula, en éste caso un eritrocito. En la derecha vemos aglutinación indirecta ó pasiva en la el antígeno ha sido fijado a la partícula por diversos procedimientos y en el ensayo intervienen partículas sensibilizadas, en éste caso eritrocitos ó hematíes. Repasando: Aglutinación Precipitación 10

11 3. INMUNOFLUORESCENCIA LOS ENSAYOS DE IF UTILIZAN ANTICUERPOS MARCADOS Ó CONJUGADOS CON FLUOROCROMO Para marcar los anticuerpos: se purifican las Ig del inmunosuero por precipitación y se conjugan en frío con el fluorocromo, se elimina el sobrenadante por diálisis Inmunofluorescencia Los más utilizados son el ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEINA y la RODAMINA FLUOROCROMOS: Sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben luz de una determinada longitud de onda y emiten una radiación luminosa de onda mayor Microscopio de fluorescencia consta de: Lámpara de vapor de mercurio fuente de los rayos UV Filtro excitador, situado antes del objeto, que permite pasar los UV y detiene la luz visible Filtro de detección, entre el ocular y el objetivo, que detiene los rayos UV y permite el paso de la luz fluorescente emitida Reacción de inmunofluorescencia CLASIFICACIÓN: Inmunofluorescencia directa (IFD) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Tienen alta SENSIBILIDAD 11

12 3.1 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD) Se basa en la utilización de un Anticuerpo primario específico marcado con fluorocromo Se utiliza para la detección de antígenos en los microorganismos o los tejidos utilizando el anticuerpo primario marcado La muestra problema donde se quiere determinar el microorganismo, bacteria, o tejido se extiende en un porta, se añade el anticuerpo marcado y tras lavado, se observa al microscopio de fluorescencia Se utiliza por ej. para el diagnóstico de: - Bacterias patógenas en heces - Virus de la rabia en cortes histológicos del cerebro - Virus en secreciones respiratorias 3.2 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Se basa en la utilización de un Anticuerpo secundario anti Ig marcado con fluorocromo Se usa para la detección de anticuerpos en suero 1. Basado en la reacción de los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie del portaobjeto ó soporte. En un primer paso los anticuerpos específicos presentes en la muestra (problema) reaccionan con el antígeno del soporte (conocido, para los Ac a determinar). Las inmunoglobulinas no unidas son eliminadas en el proceso de lavado 2. El complejo antígeno-anticuerpo es revelado mediante globulina antihumana ó Ac Anti-inmunoglobulina humana marcados con fluoresceína visualizable mediante microscopio de fluorescencia. La detección tiene mayor sensibilidad (que la directa) por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos ó más Ac 2º por cada 1º Se utiliza por ej.para el diagnóstico de: -Treponema pallidum (FTA-ABS) -Toxoplasma gondii -Coxiella burnetii -Rickettsia conorii -Leishmania 12

13 3.3 TÉCNICA TRACE Tecnica inmunofluorescente basada en la Tecnología TRACE: Time-Resolved Amplified Cryptate Emission, Tecnología de emisión amplificada de Criptato. Se basa en una Transferencia de energía sin radiación ó no radiante de una molécula donante, criptato de Eu, a una molécula receptora: aceptor XL 665, ambos fluorescentes, como resultado de una respuesta inmunitaria completa. Criptato: Es un Complejo de estructura macromolecular tridimensional grande. Jean-Marie Lehn recibió el Nobel de Química 1987 por el diseño de la molécula de criptando, familia de compuestos de síntesis inventados por él. Cuando forma un complejo se llama criptato Eu: Europio, Elemento químico, símbolo Eu, miembro del grupo de las tierras raras. El analizador Kriptor utiliza este tipo de ensayo, completamente automatizado Se emplea para la Determinación de Procalcitonina. Donante y aceptor quedan próximos cuando hay reacción Ag (PCT) Ac (Ac conjugados con los fluorocromos), se transfiere energía (del donante al aceptor) y se amplifica la señal del aceptor, de larga duración, proporcional a la concentración de la sustancia 4. ENZIMOINMUNOANÁLISIS Ó EIA Ó ENZYME IMMUNE ASSAY Técnicas basadas en la detección de los complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimas unidas a antígeno o a anticuerpo: Ag ó Ac marcados ó conjugados con enzima. La enzima más frecuentemente utilizada es la peroxidasa Otras enzimas: fosfatasa alcalina, b-galactosidasa En el ensayo ELISA la presencia de una enzima en un complejo es detectada por una reacción coloreada que se produce al añadir un sustrato que es cromogénico. La lectura de la reacción puede realizarse a simple vista o por espectrofotometría. Otros ensayos que se comentarán posteriormente son: ELFA" Enzyme-linked fluorescent assay Ensayo de fluorescencia ligado a enzimas y MEIA ó Enzimoinmunoanálisis de micropartículas. También se ha diseñado un ensayo enzimático de quimioluminiscencia llamado CLEIA que se comentará con la QL 13

14 Su uso es amplísimo actualmente Cualitativo y cuantitativo Permite determinación de antígenos y anticuerpos Los Ac y los Ag pueden marcarse ó conjugarse con enzimas sin perder su capacidad de reacción. Sensibilidad muy alta 4.1 El enzimoinmunoanálisis más generalizado es el ELISA : ENZYME LINKED INMUNOSORBENT ASSAY Ó ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMA. Las 4 fases de un ensayo ELISA son, en general, las siguientes: a) Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.): el anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Ag ó Ac marcado=conjugado b) Unión del antígeno o del anticuerpo a los pocillos: la unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. c) Formación de una o más capas de inmunocomplejo d) Revelado de la reacción enzimática: después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. En el ELISA hay un sustrato cromogénico, que al degradarse por la enzima genera un producto coloreado. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) de la solución mediante espectrofotometría (en otros EIA cambiará el tipo de sustrato empleado por ej. sustrato fluorescente en el ELFA) Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno ó Ac buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno ó Ac buscado) Se utilizan numerosas modificaciones, variaciones ó Tipos de ELISA Veremos los Ensayos básicos de ELISA de determinación de Ag y de Ac: 14

15 4.1.1 ELISA PARA DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS: ELISA SÁNDWICH (Ó ENSAYO DE CAPTURA DE ANTÍGENO Y DETECCIÓN MEDIANTE INMUNOCOMPLEJOS) ELISA Determinación de antígenos Reacción en sandwich Producto coloreado Sustrato Ac específico unido a soporte Adición y captación de Ag problemaa Adición de Ac específico marcado Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo específico anti-antígeno. Se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo ANTICUERPO ESPECÍFICO anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. El anticuerpo marcado con enzima también se denomina CONJUGADO. Al añadir el SUSTRATO DE LA ENZIMA, la degradación de las moléculas de sustrato se acompaña de un cambio de color cuya intensidad es proporcional a la concentración de antígeno que existiera en la muestra problema. El color se mide por espectrofotometría. 15

16 4.1.2 ELISA PARA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS: ELISA INDIRECTO ELISA Determinación de anticuerpos Reacción indirecta Producto coloreado Sustrato Ag unido a soporte Adición del suero problema Adición de Ac anti Ig marcado con enzima El antígeno se adsorbe a la superficie del pocillo (en los Kits ya viene fijado). Se añade el suero a ensayar y si contiene anticuerpo específico se fijará al antígeno. Tras lavado, se añade el conjugado de Ac ANTI-INMUNOGLOBULINA marcados con enzima que se uniran a los Ac que hubieran reaccionado previamente. Al añadir el SUSTRATO de la enzima la degradación de las moléculas de sustrato se acompaña de un cambio de color cuya intensidad será proporcional a la concentración de anticuerpo existente en la muestra problema. En el sistema reaccionan dos anticuerpos(2 capas de reacción ): uno primario contra el antígeno, y uno secundario, el Anti-Ig. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran cantidad de antígenos. De igual forma aquí hay un CONJUGADO pero formado por Ac ANTI-Ig marcado, en vez de Ac específico marcado Esquema de los dos ensayos: 16

17 4.1.3 OTROS TIPOS DE ENSAYOS ELISA Se han desarrollado muchas variantes y múltiples tipos de ensayos, entre ellos: ELISA DIRECTO (Ensayo ELISA simple, una sola reacción Ag-Ac, por ej. Con un Ac 1º específico marcado) ELISA DE COMPETICIÓN ó COMPETITIVO (Competición de Ag, Intervienen Ag sin marcar que es el problema y el mismo Ag marcado, ambos compiten por el Ac. Competición de Ac, al contrario. En estos ensayos la intensidad de la señal colorimétrica es inversamente proporcional a la concentración de analito en la muestra) ELISA DE CAPTURA (Con una molécula de captura. Por ej. Ac de captura para lo que se quiera determinar, ej. Captura de clases de Ig como IgM, utilizara Ac anti IgM para determinar selectivamente en la muestra de suero esa clase de Ac Ig M de una infección aguda) 17

18 Cuanto más Ag no marcado (muestra problema) ->Menos color Cuanto menos Ag no marcado( muestra problema -> Más color 4.2 ELFA"ENZYME-LINKED FLUORESCENT ASSAY ENSAYO DE FLUORESCENCIA LIGADO A ENZIMAS EL principio de la determinación asocia el MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO DEL ELISA A UNA DETECCIÓN FINAL POR FLUORESCENCIA Se desarrolla igual que el ELISA pero durante la etapa final de revelado no hay una reacción colorimétrica porque el substrato de la enzima (4-metil-umbeliferil fosfato) utilizado es en este ensayo es diferente, es productor de fluorescencia; El enzima del conjugado cataliza la reacción de hidrólisis de este substrato en un producto (4-metil-umbeliferona) que emite fluorescencia que es medida a 450 nanómetros. El valor de la señal de fluorescencia es proporcional a la concentración de anticuerpos presentes en la muestra. Al finalizar la prueba, los resultados se calculan automáticamente por el sistema respecto a una curva de calibración memorizada, después se imprimen. Por ej. Para la infección por VIH se utiliza un ELFA de 3ª generación de determinación de anticuerpos 4.3 MEIA ó ENZIMOINMUNOANÁLISIS DE MICROPARTÍCULAS La técnica MEIA es un enzimoinmunoanálisis de Micropartículas porque utiliza micropartículas de Látex como soporte para Ag ó Ac y usa un conjugado marcado con enzima pero con sustrato fluorescente, es decir un ensayo ELFA. (Posteriormente veremos ensayos de Quimioluminiscencia CMIA que utilizan también micro partículas que son magnéticas) Por ej. Para Diagnóstico de Infección por VIH se están realizando EIA ó Inmunoensayo de 4ª generación MEIA para screening con detección cualitativa simultánea de Anticuerpos para el VIH tipo 1 y/o tipo 2 y Antígeno p24 del VIH en plasma ó suero humano. Esta determinación acorta el periodo ventana. 18

19 5. INMUNOCROMATOGRAFÍA DE FLUJO LATERAL ó LATERAL FLOW Técnicas que han tenido un gran desarrollo. No requieren mayor equipamiento ni entrenamiento y dan resultados rápidos. Se utilizan para detectar Ag y Ac. El dispositivo es una membrana de nitrocelulosa ó nylon a modo de tira ó en un cassette de reacción. Sobre la membrana se encuentran absorbidos Anticuerpos ó Antígenos. La muestra (S= Sample) se aplica en un extremo y fluye lateralmente por la membrana por capilaridad. Ej: DG de faringitis bacteriana por Streptococo grupo A mediante detección de Ag polisacáridos del Streptococo a partir de una muestra obtenida con hisopo de faringe Veamos Esquema de Técnica de Inmunocromatografía ó ICT para detección de Ag Sobre la membrana de nitrocelulosa o nylon se encuentran absorbidos en la línea de reacción anticuerpos contra el antígeno que buscamos y sobre la línea control anticuerpos anti-conjugado, de forma que cuando la muestra contiene antígeno, este fluye por la membrana quedando retenido en la línea de reacción. El conjugado, que también es un anticuerpo específico frente al antígeno que buscamos, está marcado con una molécula de *oro coloidal (u otro sistema fluorocromo ) que también fluye por la membrana, es retenido por el Ag en la línea de reacción y por el anticuerpo en la línea control (Fig. 3a y 3b). En el caso de muestras negativas que no contienen antígeno, el conjugado es retenido únicamente en la línea control. Estás técnicas son rápidas, obteniéndose resultados en minutos. * El oro coloidal (nanopartículas de oro) es una solución de intenso color rubí 19

20 Prueba rápida de Ac: Ac VIH 1/2 En la Técnica de ICT para detección de Ac, en la membrana, en la línea de Test hay Ag para retener los Ac de la muestra. Ej. Pr rápida Ac VIH ½ en cassete (Foto superior dcha) ó más recientemente ICT de flujo lateral en Tarjeta (abajo) 20

21 6. WESTERN-BLOT Es un ensayo de Inmunoblotting ó Inmuno-transferencia sobre membranas para proteínas. Otros ensayos de Blotting ó transferencia sobre membranas son Southern Blot para ADN y Northern Blot para ARN pero en ellos la detección NO es inmunológica. La denominación se debe a Southern, creador de la primera Técnica de Blotting para ADN, posteriormente se usaron, en un juego de palabras, los términos Western y Northern para las demás. Ensayo de confirmación más utilizado para la detección de anticuerpos Confirmación HIV, HCV, Borrelia, Treponema Menos sensible que el Screening pero más específico Son membranas ó tiras de nitrocelulosa que contienen Antígenos Proteícos que han sido separados en bandas por electroforesis en gel (PAGE ó electroforesis en gel de poliacrilamida) según su peso molecular y luego transferidos a éste soporte. (Las proteínas se transfieren mediante el uso de otra electroforesis o por capilaridad a la membrana) Se incuban las tiras con muestras y reactivos Si en la muestra a analizar existen anticuerpos específicos se unen a sus antígenos correspondientes. Tras la adición de un conjugado y sustrato la bandas se colorean 21

22 7. LA QUIMIOLUMINISCENCIA Fundamentos de la QL La QL se define como la emisión de radiación electromagnética, ó de luz, producida por una reacción química.en los ensayos QL la reacción QL resultante se mide en URL que significa unidades relativas de luz. La QL forma parte de un fenómeno más general denominado Luminiscencia. La luminiscencia es definida como la emisión de luz asociada con una sustancia electrónicamente excitada. La Fluorescencia que hemos considerado en las técnicas anteriores de IF, es también una emisión luminiscente, en qué se diferencian ambas? En el mecanismo que causa el estado de excitación electrónica que, posteriormente, al volver al estado fundamental lleva a la emisión de luz: En fluorescencia, la sustancia fluorescente es estimulada por fotones de luz, pasando así al estado excitado. En quimioluminiscencia, una reacción química es responsable de la excitación electrónica de la sustancia quimioluminiscente 7.1 REACCIÓN QL En quimioluminiscencia, la emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica química, que implica generalmente: un sustrato ó agente QL ó precursor QL, un oxidante y un producto que es la molécula en estado electrónicamente excitado, que al pasar al estado fundamental emite un fotón. Veamos dos casos: El Luminol es un agente ó sustancia QL que al sufrir una reacción química de Oxidación se convierte en un producto ó molécula excitada que emite luz. El ester de Acridina también llamado Acridinio es un agente QL usado en los inmunoanálisis QL automatizados. Este ester de acridinio sufre una reacción de oxidación dando lugar a un producto en estado excitado que emite luz. Mecanismos de las reacciones QL En general, una reacción QL puede generarse mediante dos mecanismos básicos (Fig 1) En una reacción directa, dos reactivos, normalmente un substrato y un oxidante en presencia de algunos cofactores, reaccionan para formar un producto o intermedio de la reacción, algunas veces en presencia de un catalizador. El producto o intermedio pasa a un estado electrónicamente excitado, que puede a continuación relajarse hasta el estado fundamental con emisión de un fotón. El substrato es el precursor QL, que se convierte en el producto que es la molécula excitada electrónicamente, responsable de la emisión de luz Los cofactores son necesarios para que la reacción tenga lugar. A veces interviene un catalizador, enzima o ion metálico, reduce la energía de activación y proporciona el ambiente adecuado para la producción de una alta eficiencia QL durante el proceso. (Por el contrario, la QL indirecta o sensibilizada se basa en un proceso de transferencia de energía de la especie excitada a un fluoróforo. En el caso de moléculas que no pueden emitir directamente QL, este proceso permite transferir su exceso de energía a un fluoróforo que a su vez es excitado, volviendo a su estado fundamental con la emisión de un fotón. No lo tratamos aquí) 22

23 En los análisis se involucran determinadas sustancias según el sistema automatizado que sea utilizado, por ejemplo: éster de acridina, peróxido de hidrógeno, hidróxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de esta reacción el agente quimioluminiscente es el éster de acridina El peróxido de hidrógeno provee el agente oxidante para el éster de acridina.el hidróxido de sodio, proporciona el cambio de ph necesario para que la reacción de oxidación ocurra. La Fosfatasa alcalina es el catalizador. 7.2 INMUNOANÁLISIS QUIMIOLUMINISCENTE (Chemiluminescent) (CLIA) Es la cuantificación de una sustancia, utilizando una reacción antígeno anticuerpo y un marcador como indicador de la reacción que es un agente QL, puede ser el éster de acridina (acridinio) u otro. Tambien puede llamarse CMIA ó tecnología de Inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas cuando se utilizan pequeñas partículas paramagéticas como soporte para los antígenos ó anticuerpos. Es decir que en éstos ensayos se utiliza un conjugado que será: Antígeno marcado con agente QL ó Anticuerpo marcado con agente QL ( Comparar con ELISA o MEIA donde el conjugado era Ac ó Ag marcado con enzima ) CMIA para Determinación de Anticuerpos: Técnica CMIA para determinación de Anti-HBs ó anticuerpos frente al antígeno de superficie del VHB( virus de la hepatitis B). En un primer paso se combinan la muestra y las micropartículas recubiertas de HBsAg ó antígeno del VHB, obtenido de tecnología recombinante ( r HBs Ag ). El antihbs presente en la muestra se une a las partículas recubiertas de HBag. Se hace un Lavado, y después del Lavado: En un segundo paso se añade el conjugado de rhbsag marcado con acridinio.se hace Lavado. Se añaden las soluciones preactivadoa y activadora que contienen el oxidante ó peróxido de hidrógeno, e Hidróxido de sodio respectivamente.la reacció QL resultante se mide en URL 23

24 Determinación de Antígenos El ensayo CLIA ó CMIA es de tipo sándwich, en el cual el antígeno en la muestra del paciente es sometido en la reacción sándwich, entre el anticuerpo covalentemente unido a las partículas paramagnéticas y el anticuerpo marcado con éster de acridina. Hay una relación directa entre la concentración de antígeno en el muestra del paciente y la cantidad de luz emitida durante la oxidación de el éster de acridina en la cubeta. Para cuantificar el antígeno en la muestra, el sistema inyecta automatizado un reactivo 1 y después el reactivo 2 en las cubetas conteniendo la mezcla de reacción. Esto dispara la reacción que resulta en la emisión de fotones de luz. El fotomultiplicador (PMT), un fotodetector, detecta los fotones de luz emitida y los convierte en pulsos eléctricos. Los sistemas cuentan estos pulsos eléctricos, leen y los resultados comparando con una curva maestra definida para cada ensayo, calculando la concentración. Utilidad de el CLIA. Los sistemas que la llevan a cabo esta reacción fueron especialmente diseñados para realizar inmunoensayos de una forma automatizada con tecnología de vanguardia La gama de pruebas que conforman su menú permite realizar diferentes perfiles de casi todas las áreas del laboratorio clínico. En el caso de Enfermedades infecciosas por ej.: Toxoplasma IgG e IgM, Rubéola IgG e Ig, Chlamydia Ag, Virus sanguíneos HIV 1+2, HBs Ag, AntiHBs Etc. (Tener en cuenta su aplicación en otras áreas del laboratoro clínico como determinación de Hormonas, Perfil de anemia, Drogas terapéuticas, Perfil Diabetes, Perfil Cardiovascular...éstas pruebas están en contínuo crecimiento y varían de un sistema a otro) 24

25 CLEIA ó CELIA Inmunoensayo enzimático por quimiolouminiscencia Es una combinación de ensayo enzimático y quimioluminiscencia en el que se utilizan enzimas y sustratos que producen emisión quimioluminiscente. Pueden usarse enzimas diversas como Fosfatasa alcalina, Peroxidasa, Galactosidasa y como sustratos que corresponden a las mismas adamantilmetoxifenilfosforildioxetano (AMPPD) para la fosfatasa alcalina, luminol/peróxido para la peroxidada y adamantilmetoxifenil-ß-d-galactosildioxetano (AMPGD) para la galactosidasa. 8. MFI Multiplex Flow Immunoassays ó Multiplex Fluorescent Immunoassay. Inmunoensayos de flujo múltiple ó Inmunoensayo fluorescente múltiple Parece que constituye la siguiente generación en los Test Serológicos Es una Tecnología basada en la combinación de Inmunoensayo de microesferas ó micropartículas y Citometría de flujo. Parece ser más sensible y específico que ELISA ó CLIA, requiere muy poca cantidad de muestra (suero) El fundamento es similar al EIA pero La novedad es que permite la determinación de múltiple analitos en un solo ensayo. Se puede hacer: la detección simultánea de varios Anticuerpos para múltiples Antígenos en un solo ensayo ó detección simultánea de varios Antígenos en nuestro caso infecciosos ( pero pueden ser otros, proteínas como factores del complemento, anafilotoxinas, citocinas..) en un solo ensayo Por ejemplo: Determinación simultánea de Anticuerpos IgG frente a Virus Herpes simple Tipo 1 y Tipo 2 ( El EIA requiere diferentes ensayos para VHS tipo 1 y tipo 2) Estos ensayos utilizan MICROESFERAS de poliestireno de 5-6 micras que varían ligeramente de color porque están impregnadas con un colorante fluorescente (gamas rojo e infrarrojo) y que sirven de soporte para una molécula de captura como Anticuerpos ó Antígenos (para detectar como analitos en la muestra Ag ó Ac respectivamente). Para la detección y cuantificación del analito se utiliza un conjugado marcado con un fluorocromo, PE phycoerythrin ó ficoeritrina La detección tanto del color de la microesfera como de la intensidad del fluorocromo PE se realiza con un CITÓMETRO DE FLUJO que tiene un Láser dual MFI PARA ANTÍGENOS Es un Inmunensayo basado en el uso de varias poblaciones de MICROESFERAS que varían ligeramente de color, marcadas con múltiples Ac para detección de Antígenos diversos en la muestra; Si en el suero hay Antígeno se unirá al Ac de la microesfera específica y será detectado por un conjugado de Ac específico marcado con un fluorocromo (PE phycoerythrin ó ficoeritrina) La detección se realiza mediante Citometría de flujo, con un Laser dual y cuatro detectores. Se hacen pasar las microesferas alineadas en una sola fila ( en fila india ) en la celda de flujo y se incide en cada microesfera con el Laser doble ó dual con detección simultánea tanto del color de la microesfera específica como de la intensidad de fluoresencia(pe) asociada a ella. 25

26 Multiplex Detection of Pathogens Using a Microsphere Immunoassay Technology El laser rojo 635 nm excita el color de la microesfera y el laser verde 532 nm excita el fluorocromo del conjugado PE (phycoerythrin ó Ficoeritrina) capturado durante el ensayo MFI PARA ANTICUERPOS: Es un Inmunensayo basado en el uso de varias poblaciones de microesferas de poliestireno, que varían ligeramente de color, marcadas con múltiples Ag para detección de Anticuerpos en la muestra; Si en el suero hay Ac para un determinado Antígeno se unirá al Ag de la microesfera específica y será detectado por un conjugado de Ac anti Ig marcado con un fluorocromo (ficoeritrina) 26

27 Imágenes, repaso de: Antígenos con Determinante antigénico ó Epitopo y Anticuerpos 5 Clases. Estructura del Ac con Sitio de unión al Ag ó Parátopo (2 por Ig, antigen bindig site) formado por dominios VH y VL del fragmento Fab (antigen binding Fragment); Tanto en VH como en VL hay 3 zonas Hipervariables ó CDR= Regiones Determinantes Complementarias responsables de la especificidad de unión al antígeno y 4 zonas FR ó secuencias Marco de soporte estructural 27