SEMINARIO Microbiología de la Carne de Pollo Salmonella spp.

Transcripción

1 SEMINARIO Microbiología de la Carne de Pollo Salmonella spp. MATERIA: MICROBIOLOGIA INTEGRANTES : - RENART DAFNE - TERESA WAGNER - VALERIA VALENTINI 1

2 ÍNDICE Síntesis.. página 3-4 Objetivos...página 5 Fundamento.. página Materiales y Métodos...página 14- Resultados. págs Conclusión..página 21 Bibliografia. Página 22 Anexo de medios de cultivos..página 23 a 42 Cuestionario...página 43 2

3 SÍNTESIS En este trabajo se realizaron estudios para evaluar la calidad microbiológica de canales de pollo. Para ello se ha tomado una muestra de canal de pollo a la que se la incubó a 37 C en agua peptonada buferada al 1% como pre enriquecimiento, debido a que necesitamos que el microorganismo a investigar se encuentre en una concentración tal que nos permita determinar la presencia en el caso de que exista, o la ausencia de la Salmonella spp de la muestra (que es lo esperado según la reglamentación). Luego se repicó por agotamiento en superficie en placas que contengan Agar SS, Agar Verde Brillante y Agar Mc Conkey, se hizo una purificación en Agar nutritivo y se realiza tinción de Gram para confirmar características morfologicas. Se realizaron Pruebas Bioquimicas LIA y TSI para determinar la presencia de salmonella spp. y se realizaron Pruebas IMVIC para determinar que tipo existe. En la muestra recogida para evaluar, como resultado, se detecto la presencia de Salmonella spp al finalizar las pruebas vigentes en el protocolo. Ante el resultado positivo de Salmonella spp se piensa que los puntos críticos del proceso como el sacrificio, escaldado, el degollado, el desplumado y la evisceración son posibles puntos de contaminación que fueron no controlados o que las practicas de manejo de canales de pollo no son las adecuadas. Debido al alto grado de contaminantes que presentan los animales que llegan al matadero, el proceso productivo presenta un amplio riesgo si no se realizan prácticas a conciencia. Los resultados obtenidos, reflejan las posibles contaminaciones cruzadas en el pre-enfriamiento y enfriamiento de las canales, imposibilitando la eliminación de estos agentes en el producto final. La mala conservación térmica de las canales de pollo es un punto crítico posible ya que esta podría aumentar el número de microorganismos en el alimento permitiendo el aumento de la tasa de multiplicación e incluso la velocidad, aunque no así los tipos de microorganismos presentes. Es necesario decir que no solo las malas prácticas del matadero son las que afectan al producto, normalmente el matadero cumple con el protocolo, ya que este es exigido por la Ley y el pollo se contamina en la carnicería, por contacto con un cuchillo infectado o agua contaminada. De acuerdo con los resultados obtenidos se recomienda la aplicación de planes de vigilancia y control de Salmonella spp. en la producción primaria, revisar las condiciones sanitarias en las plantas sacrificadoras y carnicerias, así como la adopción de códigos de buenas prácticas en el personal responsable de las explotaciones, transporte y mataderos. Finalmente se 3

4 recomienda la revisión de la Ley de Inocuidad de Alimentos y del Código Alimentario Argentino (C.A.A) Cabe destacar que el proceso total de las canales de pollo, es muy amplio y muchos puntos del proceso pueden fallar, con que falle un punto crítico basta para que la inocuidad del alimento se pierda totalmente, debido a que el desarrollo de una sola bacteria de salmonella spp, haría que el alimento sea no apto para consumo. Mas allá de lo indicado para la planta donde se obtienen los canales de pollo, las acciones y las condiciones de los puntos finales de ventas minoristas como granjas, carnicerías o supermercados son de vital importancia para asegurar o mantener la calidad microbiológica del pollo con la que pudo haber venido de la planta faenadora. Las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) son fundamentales como herramientas para asegurar la inocuidad de los alimentos. 4

5 OBJETIVOS Objetivo Especifico del trabajo: Evaluar la calidad microbiológica de la carne de pollo con la determinación de Salmonella spp, informando presencia ausencia en 25 gramos de la muestra. Utilizar medios de cultivo con diferentes niveles de selectividad; observar el crecimiento en los mismos y plantear las diferencias entre ellos. Objetivos generales del trabajo: Conocer y aplicar la metodología utilizada en el Laboratorio de Microbiología. Preparar Medios de Cultivo. Esterilizar. Aislar. Realizar observaciones microscópicas. Identificar grupos microbianos por sus características culturales y por reacciones metabólicas Comprender artículos científicos referentes a la microbiología de la carne aviar y al procesamiento de la misma. 5

6 FUNDAMENTOS Frente a las pérdidas tanto poblacionales y sanitarias que se han desencadenado los últimos años, se encuentra necesario el cumplimiento de la ley de inocuidad alimentaria en canales de pollo, para la ausencia de salmonella spp. y manifestar la responsabilidad empresarial por brindar una mejor calidad de vida, y la producción libre de patógenos alimentarios. La razón por la que se realiza el trabajo es para verificar que se cumpla la reglamentación propuesta por la Ley, y además aprender a aplicar la Normativa. La contaminación microbiana en el pollo se inicia desde el huevo, en los oviductos o por una penetración de los microorganismos intestinales a través la cáscara cuando pasa por la cloaca. La contaminación original es potencialmente incrementada a medida que se ejecutan los pasos de procesamiento desde la producción de pollos hasta la obtención de las canales. Luego de la eclosión de huevos, los pollos son trasladados a plantas de engordes donde son ubicados en hacinamiento, en condiciones poco higiénicas, por ejemplo piso de concreto se recubre con una delgada capa de material absorbente, como virutas de madera, paja picada o aserrín y los pollos están parados o caminan constantemente sobre una capa creciente de excremento que es un potencial punto de contaminación de salmonella spp ya que esta bacteria se libera por la heces. El ácido úrico presente en los excrementos les causa quemaduras y ulceraciones en las patas y la pechuga y en estas ranuras o lastimaduras podrían alojarse las bacterias provenientes de excremento que posteriormente podrían afectar a la inocuidad del alimento. Una vez logrado el peso promedio para la comercialización se lo carga en camiones con destino a plantas de faena. Se describe a continuación el proceso de producción de carne de pollo para tener conocimiento de que practicas deben realizarse en la producción y cuales son los parámetros que deben ser respetados: -Flujo de producción de carne de pollo. 1-Playa de descarga: Es un área techada con ventilación y sombra. Debe alcanzarse un ayuno de 6 a 12 hs. en criadero. Las jaulas se apilan separadas para permitir su ventilación; se tendrá en cuenta la temperatura ambiente y el estado de bienestar. Se sacrifican las aves antes de las 24 hs. de su llegada a planta. Se hace la inspección ante-mortem y separa aves no aptas, para derivarlas al digestor u horno crematorio. Debe evitarse lesionar las aves al colgarlas de la noria. 6

7 2-Insensibilizacion: Se controla el adecuado voltaje del equipo para no matar al ave y permitir un buen sangrado; debe observarse que la sangre no discurra hacia de losdesagües de los efluentes.la forma de corroborar el buen funcionamiento del dispositivo insensibilizador, consiste en separar un ave inmediatamente después de pasar por dicho proceso, la misma debereaccionar en pocos minutos. 3-Sangrado: Es necesario esterilizar cuchillos frecuentemente a temperatura mayor a 82 C. El sangrado debe durar como mínimo 3 minutos y debe ser total antes de ingresar a la zona intermedia; esto influye en su calidad y clasificación. Hay que asegurar la muerte del ave antes del escaldado. 4-Escaldado: Inmersión en agua caliente durante 3 minutos (50 60 C). El agua debe circular en dirección contraria al movimiento del ave. Se renovará continuamente a razón de 0,2 litros/ave como mínimo. Se vaciará la escaldadora y se limpiará diariamente. 5-Pelado: Limpieza y calibración diarias de la peladora, reemplazo oportuno de dedos defectuosos, agrietados o desgastados. Plumas se derivan al digestor o zona de incomestibles. 6-Lavado: Ducha a presión que abarque toda la carcasa para eliminar coágulos, plumas, bacterias, etc.cantidad mínima de agua: 0,2 litros/ave. 7-Corte de patas y cabezas: Las patas deberán ser separadas por desarticulación o sección, a la altura de la articulación tibiometatársica. Las garras una vez escaldadas, peladas, enfriadas/congeladas podrán ser comercializadas como producto comestible. 8-Eviscerado: Evitar ruptura del aparato digestivo que pueda contaminar la carcasa (importante el dietado y ayuno previo de las aves). Esterilizar frecuentemente cuchillos y extractores. Lavarse frecuentemente las manos.evitar el acúmulo de carcasas sin eviscerar. 9-Inspeccion post mortem: El Servicio de Inspección Veterinaria procederá a lainspección global de la carcaza y los órganos, en forma visual y/o por palpación y ante cualquier patología obligará a remitir la res y todas las vísceras al área de re - inspección a los efectos de identificar la afección y proceder al decomiso total de la pieza, si corresponde. 10-Carcazas: Duchado interno y externo con agua a presión clorinada. Se usará como mínimo 1,5 litros/ave Prechiller enfriado: La corriente del agua será en dirección opuesta al movimiento del ave. Usar 1,5 litros/ave de agua con ppm de cloro, 30 minutos como máximo de permanencia. Renovación del agua: 2,5 litros/ave de 2,5 5 Kgs. de peso. Temperatura del agua no mayor a 16 C. Limpiar el prechiller una vez por día Chiller enfriado: Limpiar el chiller una vez por día. Temperatura del agua: se ubicará entre 0 a 4 C. Temperatura del ave a la salida del chiller: será menor a 10 C. 7

8 11-Viceras: Las vísceras comestibles deben ser emprolijadas (apertura y limpieza de molleja; eliminación de proventrículos y buche), lavadas (11a) y enfriadas (11b). 12 Pesaje-Clasificación-Rotulados: Las aves una vez faenadas son colocadas en envases primarios y secundarios efectuando la correspondiente clasificación y rotulado, de acuerdo a la legislación vigente. Evitar la acumulación de aves, líquido, etc. Ingresar lo más rápido posible a la cadena de frío. Bandejas y cajones no podrán estar en contacto directo con el piso. 13-Enteros sin menudos: El ave faenada entera sin menudos podrá ser trozado y/o deshuesado, o bien pasarlo a cámara de mantenimiento para su venta al público. 14-Enteros con menudos: El ave faenada entera con menudos será envasado y derivado a cámara de mantenimiento para su venta al público. 15-Trozado y deshuesado: Se puede despostar inmediatamente luego de la faena o esperar a que adquiera una temperatura de 2 C +/- 2 C. Sala de desposte: deberá poseer una temperatura menor a 10 C. Esterilizadores con agua a 82 C. 16-Envasado: Se realizará posteriormente al pesaje. Evitar acúmulo de aves en este sector. 17-Congelado: Temperatura en cámaras: -18 C. Temperatura de masa muscular: será menor a 4 C. No guardar enfriados por más de 72 hs. (controlar funcionamiento de los equipos de frío). 18- Mantenimiento: Temperatura en cámaras: -2 C a 2 C. Temperatura en masa muscular: menor a 2 C (tolerancia +/- 2 C) en un lapso no mayor a las 6 hs. de sacrificado. 19- Expendio: Deberá realizarse a la temperatura de almacenaje (refrigerado o congelado) con la documentación de amparo correspondiente -Posibles puntos de contaminación: Los posibles puntos de contaminación de Salmonella spp están dados principalmente en el proceso productivo en las etapas de SACRIFICIO, DESOLLADO, DESPLUMADO Y EVISCERACION, ESCALDADO. En el caso del sacrificio de los pollos, encontramos posible contaminación en que se utiliza el mismo cuchillo para sacrificar todas las aves, luego de que las aves pasen por la aturdidora, entonces ya que estas aún cuentan con las plumas podemos infectar la piel de otras al hacerlo. 8

9 En el caso del escaldado, encontramos posible la contaminación ya que las distintas canales comparten la inmersión en la misma pileta de agua caliente, debido a esto, la contaminación del agua por infección de una sola canal, podría poner en riesgo toda la producción. Además debido a la alta demanda de producto, la limpieza o higiene de la escaldadora podría ser mal realizada por realizarse con rapidez dejando restos de microorganismos que pueden multiplicarse rápidamente. En el caso del desollado se utilizan maquinas peladoras, la misma maquina se utiliza para todas las canales de pollo, razón por la que el peligro de contaminación es extremo, ya que uno de los principales focos de infección son las plumas que pueden encontrarse en contacto con materia fecal en la zona de hacinamiento. La mala higienización de las maquinas peladoras puede infectar a las demás canales. En el caso de la evisceración el tiempo en el que se retiran las vísceras y las condiciones en que se hacen son de extrema importancia, ya que el intestino y el hígado conforman la principal fuente de alojamiento de microorganismos provenientes del pollo, es necesario evitar cualquier ruptura de los órganos y la desinfección de las canales de pollo y de las vísceras en caso de comercializarse. En general las principales fuentes de contaminación se encuentran en la piel, patas, contenido estomacal e intestinal del animal (donde se encuentran la mayor cantidad de microorganismos naturales), equipos y manos de los operarios, agua de lavado de las canales y en el aire. No podemos echarle toda la culpa a los mataderos, en general los mataderos siguen la reglamentación, pero la contaminación puede producirse en la granja. En cuanto a la contaminación en la granja, la realidad indica que en las carnicerías del país hay presencia de enterobacterias y que las cuchillas, mesadas y picadoras de carne están contaminadas, los carniceros pueden no prestarle atención al lavado de manos, la sanitización de las cuchillas, picadoras. La utilización de mesadas de madera, trapos rejillas también incrementa el riesgo. -Origen de la micro flora de la carne de pollo: Se inicia desde el huevo, en los oviductos o por una penetración de los microorganismos intestinales a través de la cascara cuando pasa por la cloaca en la puesta. Un ave sana posee millones de microorganismos en su intestino, por ejemplo, bacterias entéricas y sobre su piel por ejemplo bacterias psicótropas. En el proceso de manipulación después del sacrificio, el pollo puede contaminarse por contaminación cruzada con microorganismos patógenos provenientes de otros, ya 9

10 que los mismos comparten zonas en común, maquinaria en común y las manos de los trabajadores los arrastran. - Características de la carne de pollo como medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos : La carne de pollo tiene propiedades que favorecen al crecimiento de microorganismos, su rapidez de multiplicación y le proporcionan medio de viabilidad óptimo: o Factores Intrínsecos: La carne de ave está constituida por el tejido muscular, piel adherida, tejido conectivo y órganos comestibles de las especies de aves utilizadas comúnmente como alimento. La mayor parte de las consignaciones del mercado internacional están constituidas por canales o partes de pollos. El contenido de agua de las porciones comestibles de las canales es de aproximadamente el 71 % para los pollos broiler, del 66 % para los pollos roaster, del 56 % para las pollas y del 58 % para los pavos semigrasos. La carne de las aves jóvenes tiene una mayor proporción de agua que la de las aves viejas. Los contenidos brutos de proteína y grasa de los pollos fryers son de 20,5 y 2,7 %, respectivamente, los de los pollos roasters de 20, 2 y 12,6. A diferencia de la carne roja, en la que la grasa se halla distribuida por los tejidos, la mayor parte de la grasa de las aves se encuentra justamente debajo de la piel y en la cavidad abdominal. La cantidad de grasa varía con la edad, sexo, anatomía y con la especie. Aparte de los nutrientes, otras propiedades de la carne de ave influyen en el crecimiento de los microorganismos. La actividad del agua (aw) viene a ser de 0,98 a 0,99 dependiendo de si la carne ha sido almacenada en presencia de aire seco y del tiempo de almacenamiento. El ph del músculo de la pechuga del pollo es de 5,7 a 5,9, mientras que el del músculo del muslo es de 6,4 a 6,7. Durante el desarrollo de los pollos el ph de la piel se eleva a 6,6 en los pollos de 9 semanas y a 7,2 en los pollos de 25 semanas. El potencial redox de la carne de ave es similar al de la carne de los mamíferos. La piel, portadora de muchos microorganismos, sirve sin embargo, de barrera física contra los microorganismos impidiendo que contaminen el músculo subyacente. Debido a su composición y otras propiedades tanto el músculo como la piel de pollo son substratos excelentes para el desarrollo de una amplia diversidad de microorganismos. -Ph: Óptimo 5.8 a 6.4. Mínimo para el crecimiento 3,8 10

11 - Aw: 0.90 a Nutrientes: Cantidades de mioglobiona, hierro, zinc y vitaminas del complejo B (Vitamina B5,Vitamina B6,Vitamina B12), proteínas (27g de proteínas en 100 g de pollo) y minerales escenciales (Ácido fólico). - Potencial redox: Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. Los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. Cada tipo de microorganismo sólo puede vivir en un estrecho rango de valores redox. El potencial redox de la carne de ave es similar al de la carne de los mamíferos. Aunque generalmente no se reconoce al potencial redox como un parámetro de procesado durante la preparación de los alimentos, es indudable que interactúa con el ph y las atmósferas gaseosas determinando la flora alterativa de muchos alimentos e influenciando probablemente el desarrollo de aromas tanto agradables como desagradables. El potencial redox de las piezas interiores de la carne se encuentra suficiente reducido como para prevenir el crecimiento de los aerobios (e.g., pseudomonas, bacilos u hongos) pero el bajo potencial redox (post-rigor) estimula el crecimiento de enterobacteriaceas y clostridios. o Factores extrínsecos: Humedad, temperatura, manipuleo e higiene. La humedad de la carne de pollo está relacionada con la elevada Actividad de agua que presenta, esto genera un ambiente propicio para los microorganismos ya que, las funciones metabólicas que realizan se ven favorecidas cuando hay elevada disponibilidad de agua. La temperatura afecta directamente a la tasa de multiplicación y la velocidad de crecimiento de bacterias, y va a estar determinada por la conservación que se le dé a las canales de pollo. Bajas temperaturas disminuyen la velocidad y tasa de multiplicación microbianas, razón por la que se recomienda la conservación en refrigerados. La higiene dependerá de las prácticas de manejo que se adopten en el proceso de las canales de pollo, de la conservación y del tipo de envasado. Para determinar la presencia o ausencia de salmonella spp primero es necesario conocer las características que posee: -Caracteristicas de Salmonela spp. : 11

12 - Bacilo ( forma de bastón ), GRAM -, NO esporulada, no forma cápsulas, produce acido y a veces gas de la gucosa, anaerobias facultativas, móvil ( Se moviliza por medio de flagelos peritricos ) a excepción de S. gallinarum y S. pullorum, no fermenta la lactosa, reducen nitratos a nitritos, citrato + (utiliza la citrato como única fuente de carbono),producen sulfuro de hidrogeno, Indol negativo, catalasa +, oxidasa -, Rojo de metilo positivo. Es una bacteria de origen fecal y produce infecciones e intoxicaciones. Su hábitat normal es el intestino del hombre y otros animales, invaden en primer lugar la mucosa intestinal y se multiplican allí, se eliminan por las heces y se transmiten por contacto. - NOMBRE DE LA ENFERMEDAD: salmonelosis. - SINTOMAS: Los síntomas de nauseas, vómitos, calambres abdominales, diarrea, fiebre, dolores de cabeza. CONSECUENCIAS CRÓNICAS: síntomas artríticos que pueden seguir 3-4 semanas después de los síntomas agudos. - DOSIS DE INFECCIÓN: Son pocas células 15 a 20 células, dependiendo de la edad y la salud del huésped y de las diferentes cepas, así como también la supervivencia de la bacteria durante el transito a través del estomago, el agua ingerida fuera de las horas de las comidas tiene un tiempo de retención mínimo, mientras que los alimentos grasos protegen a la bacteria de los ácidos del estomago. - CAUSAS DE LA ENFERMEDAD: Es la penetración y pasaje del organismo salmonella spp.al epitelio del intestino delgado causando inflamación. - DETECCIÓN: La detección rutinaria de las Salmonellas supone una secuencia de pre-enriquecimiento, siembra en placas de medios selectivos, aislamiento e identificación. - El diagnostico a nivel clínico se realiza mediante el cultivo aislado de materia fecal. - TIEMPO DE INFECCIÓN: Primeros síntomas dentro de las 6 a 48 hs. - ALIMENTOS ASOCIADOS: Carnes crudas, aves de corral, huevos, leche y productos lácteos, pescado, ranas, levaduras, salsas y aderezos, tortas, coco, cremas y coberturas, gelatinas, pasta de maní y chocolate. - CONTAMINACIÓN: La bacteria llega a la superficie de la carne desde el contenido intestinal y las heces que se adhieren en el pelo, la piel y las patas de los animales cuando llegan para el sacrificio. Una importante contaminación de carnes de cerdo se da durante el escaldado y el pelado. Las bacterias son transferidas con facilidad entre los operarios. Las cana les de pollo están contaminadas debido a restos de heces existentes en patas y plumas, siendo operaciones delicadas el desplumado, la evisceración de aves y el enfriamiento. Los huevos pueden contaminarse 12

13 por vía transovarica o la cascara a través de la cloaca o cuando se halla en un ambiente de materia fecal. La salmonella spp. existentes en la superficie contaminan el agua de lavado y las manos de manipuladores de alimentos. Varias especies de salmonella spp. han sido aisladas de la cascara de los huevos. La situación de S. enteritidi es complicada porque el microorganismo esta dentro de la yema del huevo. Esta y otras informaciones sugieren transmisión ovárica, deposición del microorganismo en la yema por las ponedoras infectadas. Los productos derivados de los huevos, tanto deshidratados como congelados que no han sido pasteurizados, son evidentes vehículos de contaminación. La leche fresca se contamina por medio de la ubre y de los pezones, menos corrientemente durante infecciones septicémicas ( presencia de salmonella en sangre ) de las vacas. - FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO, LA MUERTE Y/O LA SUPERVIVENCIA DE salmonella spp.:.temperatura: Minima 5,2, Óptima 35 a 43, Máxima 46,2. Aw: Afecta en gran medida el crecimiento, son capaces de sobrevivir durante un año o más en los alimentos que tienen una actividad de agua.baja. Límite inferior Aw de crecimiento 0.94, Óptimo de crecimiento Aw 0.99, Máximo de crecimiento Aw >0.99.Ph: ph señalado como minimo para el crecimiento es 3.8 A pesar de que las salmonellas no forman esporas, son capaces de sobrevivir durante mucho tiempo en los alimentos. - AGENTES DESINFECTANTES DE salmonella spp.: Alcohol, Cloro 13

14 MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES: -25 gramos de pechuga de pollo -225 ml de Agua peptonada bufferada al 1% - 1 erlenmeyer -1 micropipeta de 0.1 ml - 30 ml de Caldo Selenito y 30 ml de Caldo Rappaport - 40 ml de Agar SS, 50 ml de Agar Verde Brillante y 50 ml de Agar Verde Mc Conkey ml de Agar nutritivo (para repique en tubos) -Agua destilada - Cristal Violeta - Lugol (mordiente) -Alcohol 96% - Safranina - Mechero - LIA Y TSI para pruebas bioquímicas - PARA PRUEBAS IMVIC( Reactivo de Kovacs, medio SIM, Rojo de metilo- VG ( indicador de ph) ) Y ONPG 14

15 MÉTODOS: 1. Se toman 25 gramos del homogeneizado realizado en la preparación de la muestra y se colocan en 225 ml de Agua Peptonada Bufferada al 1 %. Se utilizan para ello un erlenmeyer o un frasco de capacidad adecuada. 2. Se incuba por 24 horas a 37 C en baño termostático. 3. Se toma con micropipeta 0.1 ml del pre- enriquecido. 4. Se lleva por triplicado en tubo con 10 ml de caldo Selenito y caldo Rappaport. 5. Se incuba durante 18 horas en baño termostático a 45 C. 6. Se repica de los tubos en los que se observo crecimiento, por agotamiento en superficie a placas que contengan 10 ml de agar SS, agar verde brillante y agar Mc Conkey incubar por 24 horas a 37 grados centígrados. 7. Se realiza la primera purificación en agar nutritivo. 8. Se realiza tinción de gram de las cepas obtenidas, para confirmar características morfológicas. - Se prepara el frotis. - Se colorea con Cristal Violeta durante 1 minuto. - Se añaden unas gotas de solución de Lugol (mordiente) durante 1 minuto. - Se decolorea con alcohol durante 30 segundos hasta arrastre total de colorante durante 30 segundos. - Se lava con agua. - Se colorea con Safranina durante 1 minuto. - Se lava con agua, se seca en la columna de aire caliente del mechero. 9. Se realizan pruebas Bioquímicas LIA y TSI,se utiliza tubos de ensayos cortos y se siembra en punción y estría. Se incuba 24 horas a 37 grados centígrados en estufa y se realiza un repique a agar TSI. 10. Se realizan las lecturas según tablas para estos medios: Tabla para TSI. Tabla para LIA 10 Se conservan en heladera las cepas que hayan dado reacción positiva en LIA y TSI. 11. Se realizan pruebas IMVIC, de los tubos que contengan posible Salmonella, para determinar si realmente lo es (incluye SIM,RM-VG) y ONPG. 15

16 RESULTADOS 1. SIEMBRA EN MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO PARA AMBOS: Caldo Selenito: Medio de enriquecimiento para el aislamiento de salmonella spp. a partir de materiales clínicos, especialmente heces. Parámetros: Microorganismos Salmonella enteritidis ATCC Salmonella typhimurium ATCC Escherichia coli ATCC Proteus mirabilis ATCC Crecimiento Bueno Bueno Regular-Escaso Regular-Escaso o Observaciones para ambas cepas : Se observa buen crecimiento. BD Rappaport Vassiliadis Broth :Es un medio líquido para el enriquecimiento selectivo de Salmonella a partir de carne vacuna y productos lácteos, heces y agua contaminada. Parámetros: Cepa de prueba Turbidez Resultados de crecimiento en BD Briliant Green Agar (subcultivo) Salmonella Typhimurium Fuerte De bueno a excelente ATCC Salmonella Enteritidis Fuerte De bueno a excelente ATCC Escherichia coli ATCC De nulo a escaso Inhibición parcial (a completa) Sin inocular Azul, transparente o Observaciones para ambas cepas : Se observa buen crecimiento. 16

17 -1 MUESTRA CON CEPA 1 : MÉTODOS Estriado en medio SS OBSERVACIONES Colonias transparentes/ incoloras, otras amarillas, algunas transparentes con centro negro ( por producción de H2S). PURIFICACIÓNES: Estriado en verde Brillante Viraje del medio a rojo. Colonias blanquecinas semitransparentes. También hay colonias amarillasverdosas sobre fondo amillo Estriado en Agar Mc Conkey Colonias blancas semitransparentes bastante bien separadas y colonias rojas con halo turbio. 17

18 PURIFICACIÓN EN AGAR NUTRITIVO: Colonias incoloras. Cambio de color del medio a verde. REPIQUE PARA CULTIVO CON TUBO AGAR NUTRITIVO Se observa buen crecimiento. TINCIÓN DE GRAM Solo bacilos cortos GRAM -. No hay presencia de GRAM + SIEMBRA EN TSI Pico amarillo, gas +, (acido) sulfuro -,fondo del tubo amarillo, crecimiento incoloro. SIEMBRA EN LIA Pico violeta, base amarilla,gas +, (acido) sulfuro -, crecimiento incoloro/ PRUEBAS IMVIC Observaciones agregadas: blanquecino. SIM INDOL No se realizo No se realizo RM No se realizo Debido al viraje de color del agar nutritivo, no se sigue con las pruebas. VG No se realizo Prueba ONPG complementaria( NO IMVIC) No se realizo RESULTADOS: Género: Sin determinar 18

19 -8 MUESTRAS CON CEPA 2: MÉTODOS Estriado en medio SS OBSERVACIONES Colonias transparentes/ incoloras, algunas transparentes con centro negro ( por producción de H2S). PURIFICACIÓNES : Estriado en verde Brillante Viraje del medio a rojo. colonias, rosas, blancas o transparentes, de forma convexa, sobre fondo rojo. Estriado en Agar Mc Conkey Colonias incoloras transparentes, de forma redondas y convexa, bastante bien separadas ; y pocas colonias rojas con halo turbio. 19

20 PURIFICACIÓN EN AGAR NUTRITIVO: REPIQUE PARA CULTIVO CON TUBO AGAR NUTRITIVO Colonias muy juntas, blancas transparentes-lechosas. Muy diminutas. Se observa buen crecimiento. TINCIÓN DE GRAM SIEMBRA EN TSI SIEMBRA EN LIA PRUEBAS IMVIC Solo bacilos cortos GRAM -. No hay presencia de GRAM + Pico rojo, gas +, (acido) sulfuro +, fondo del tubo amarillo, crecimiento. Pico violeta, base del tubo violeta, gas +, (acido) sulfuro +, crecimiento incoloro/ blanquecino. SIM INDOL RM VG (+) (-) (+) (-) Prueba ONPG complementaria( NO IMVIC) (-) Observaciones agregadas: En medio SIM se observó movilidad +. En pruebas IMVIC, sulfuro +. RESULTADOS: Género: salmonella spp. 20

21 CONCLUSIÓN En el estudio realizado 98 % de las repeticiones realizadas sobre las colonias sospechosas mostraron las reacciones características de salmonella spp. por ende determinamos la presencia del microorganismo en la muestra de 25 gramos de pollo analizada. Las características visibles en las colonias obtenidas de repiques, que fueron realizados luego de un pre enriquecimiento y un enriquecimiento selectivo en medios diferenciales y selectivos (Agar Salmonella Shigella, Agar Mc Conkey y Agar Verde Brillante), acompañadas por una tinción de gram de los cultivos purificados permiten observar caracteristicas propias de la salmonella spp. (basilos cortos gram negativos). Se realizan pruebas LIA y TSI. Las pruebas LIA y TSI resaltan características de salmonella, razón por la que se realizan pruebas IMVIC como complementarias para definir la presencia de salmonella spp. Las pruebas IMVIC dan positivas las características de salmonella spp, por ende HAY presencia de salmonella spp. La presencia de esta bacteria en el alimento define, que este no es apto consumo, razón por la que no debería estar siendo comercializado. La presencia de salmonella spp indica que es necesario realizar estudios epidemiológicos en la zona de origen para aplicar medidas de vigilancia, control y erradicación de la salmonelosis. Se recomienda la revisión del proceso de sacrificio en el matadero estudiado, aplicando sistemas HAPPC y buenas prácticas para evitar contaminaciones cruzadas. Se recomienda además realizar prácticas de control periódico de zonas de manejo de carne de pollo, en los puntos críticos de la cadena de producción, realizar practicas de higiene cada menor tiempo en el proceso y establecer un mejor control de manejo higiénico propio de los empleadores. Se recomienda la revisión del Código Alimentario Argentino (ley de Inocuidad Alimentaria) para favorecer el comercio de productos cárnicos con las máximas garantías sanitarias. La aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura obligatorias en los puntos de venta por menor como las carnicerías, supermercados, granjas y ferias es indispensable para la mantención y cuidado de la calidad microbiológica del pollo, las operaciones realizadas durante el expendio pueden incorporar microorganismos que hayan sido eliminados durante los procedimientos de faena. 21

22 BIBLIOGRAFÍA - Archile A. Ch. Barbosa de Martínez, C. Y, Izquierdo Córser PI y. Márquez Salas. E. J 1999 Composición química y Microbiológica de la carne de pollo deshuesada mecánicamente Revista Científica, FCV-LUZ/Vol. IX N 4, ,. Pag.286, Banwart J Microbiología básica de los alimentos, Ediciones Bellaterra, S. - _Britania Manual de Medios de cultivo. - Carrillo L, Audisio M.C Manual de microbiología de los alimentos Capitulo 11 Aves ISBN Facultad de Ciencias Agrarias, UNJU, SS Jujuy - Montes. A. L Microbiología de los alimentos, Vol. 1. Editorial Reseña universitaria, San Pablo. 22

23 ANEXO DE MEDIOS DE CULTIVO 23

24 Selenito Caldo Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de materiales clínicos, especialmente heces. Fundamento Este caldo selectivo favorece el crecimiento de Salmonella spp. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubación. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 5.0 Suspender 23 g del polvo en un litro de Lactosa 4.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar Fosfato de sodio 10.0 ligeramente hasta su disolución completa. Evite el calentamiento excesivo. No esterilizar en autoclave. Selenito de sodio 4.0 Distribuir en tubos estériles un volumen no menor a 5 ml. Se recomienda guardar en heladera si no se usa de inmediato. ph final: 7.0 ± 0.2 Siembra -Materia fecal: a un tubo con ml de caldo selenito, agregar 1-2 ml de una suspensión de materia fecal. -Tejido infectado: macerar 1-2 g de tejido en ml de caldo selenito, usando una varilla estéril. -Orina: a un tubo con unos 5 ml de caldo selenito doble concentración, agregar igual volumen de orina. Incubación A C, durante horas, en aerobiosis. Luego, subcultivar en medios selectivos: Salmonella Shigella Agar (B /06), Hektoen Entérico Agar (B /06), Verde Brillante Agar (B /06), Mac Conkey Agar (B /06). Resultados Microorganismos Salmonella enteritidis ATCC Salmonella typhimurium ATCC Escherichia coli ATCC Proteus mirabilis ATCC Crecimiento Bueno Bueno Regular-Escaso Regular-Escaso Limitaciones -Se aconseja usar el medio el mismo día de la preparación. -No incubar el medio de cultivo sembrado por mas de 24 horas, debido a que el efecto inhibitorio del selenito disminuye luego de las primeras 6-12 horas de incubación, y además porque no es favorable para la mayoría de las cepas de Salmonella, que pueden no recuperarse. -La única ventaja de incubar durante 48 horas es el incremento de la recuperación de Salmonella pullorum. 24

25 Características del medio Medio preparado: ámbar claro, traslúcido. Almacenamiento Medio deshidratado: a ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B x 500g :Código: B

26 Salmonella Shigella Agar. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de ph, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B ). Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar. Calentar a Citrato de sodio 8.5 ebullición durante 2 o 3 minutos. NO Tiosulfato de sodio 8.5 ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a Citrato férrico C y distribuir unos 20 ml por placa. Agar 13.5 Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa. Verde brillante Rojo neutro ph final: 7.0 ± 0.2 Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B ) o de agar Mac Conkey (B ). Incubación Durante24-48 horas a C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas 26

27 Enterococcus faecalis ATCC Incoloras, de muy escaso crecimiento Características del medio Medio preparado: rojo naranja. Almacenamiento: Medio deshidratado: a ºC. Presentación x 100g :Código: B X 500g :Código: B

28 Mac Conkey Agar. Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el ph alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de ph (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Suspender 50 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta Agar 13.5 disolver. Esterilizar en autoclave a 121 C Rojo neutro 0.03 durante 15 minutos. Cristal violeta ph final: 7.1 ± 0.2 Siembra - Sembrar en superficie. - Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a ºC. Incubación Durante horas, a ºC, en atmósfera aeróbica Resultados Microorganismos Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Salmonella typhimurium ATCC Shigella flexneri ATCC Proteus mirabilis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Colonias Rojas con halo turbio Rosadas mucosas Incoloras, transparentes Incoloras, transparentes Incoloras, transparentes Diminutas, incoloras, opacas Características del medio Medio preparado: rojo púrpura Almacenamiento: Medio deshidratado: a ºC. 28

29 Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B x 500g :Código: B

30 Verde Brillante Agar. Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp. Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas. Fundamento En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de ph, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 10.0 Extracto de levadura 3.0 Suspender 58 g de polvo por litro de agua Cloruro de sodio 5.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 Lactosa 10.0 minutos. Distribuir y esterilizar en Sacarosa 10.0 autoclave a C durante 15 Rojo fenol 0.08 minutos. Secar la superficie del medio por Verde brillante unos minutos en la estufa. Agar 20.0 ph final: 6.9 ± 0.2 Siembra Sembrar en superficie por estriado a partir de una dilución del material a investigar o de un cultivo previo en un medio de enriquecimiento selectivo, como Selenito caldo (B ) o Tetrationato caldo (B ). Para el tratamiento de materia fecal se recomienda hacer cultivo primario en medios menos selectivos, como Salmonella Shigella agar (B ), o Mac Conkey agar (B ). Incubación Incubar 24 horas a C. Resultados Microorganismos Escherichia coli ATCC Salmonella enteritidis ATCC Salmonella typhi Salmonella typhimurium ATCC Shigella flexneri. ATCC Staphylococcus aureus ATCC Características de las colonias Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo Crecimiento inhibido Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo Crecimiento inhibido Crecimiento inhibido 30

31 Características del medio Medio preparado: verde. Almacenamiento: Medio deshidratado: a ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B x 500g :Código: B

32 Rappaport Vassiliadis Broth USO PREVISTO BD Rappaport Vassiliadis Broth (R10 Broth, caldo Rappaport Vassiliadis BD o R10) es un medio líquido para el enriquecimiento selectivo de Salmonella a partir de carne vacuna y productos lácteos, heces y agua contaminada. PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico. Rappaport et al formularon un medio de enriquecimiento para Salmonella, que fue modificado por Vassiliadis et al1,2. La fórmula de Rappaport, denominada R25/37 C, recomendaba la incubación a 37 C; la modificación de Vassiliadis, denominada R10/43 C, presentaba un menor nivel de verde malaquita y recomendaba la incubación a 43 C. La labor posterior de Peterz demostró que la incubación a 41,5 ± 0,5 C durante 24 h mejoraba la recuperación de Salmonella spp3. El caldo Rappaport- Vassiliadis R10 es un medio de enriquecimiento selectivo utilizado después de un enriquecimiento preliminar de la muestra en un medio de enriquecimiento previo adecuado. Su uso se ha aprobado para el análisis de leche y productos lácteos4, productos con carne vacuna cruda, alimentos con alto nivel de contaminación y alimentos para animales5,6. El medio también se recomienda como enriquecimiento selectivo de Salmonella diferente de Salmonella Typhi a partir de muestras fecales humanas7,8. En BD Rappaport Vassiliadis Broth, la triptona es una fuente de carbono y nitrógeno para los requisitos generales de crecimiento. El cloruro de magnesio eleva la presión osmótica en el medio. El verde malaquita inhibe los organismos diferentes de Salmonella. El ph bajo del medio (5,1 ± 0,2), combinado con la presencia de verde malaquita y la alta concentración de cloruro de magnesio, que incrementa la presión osmótica, tiene carácter selectivo para Salmonella spp. REACTIVOS BD Rappaport Vassiliadis Broth Fórmula* por litro de agua purificada Bacto Tryptone 4,54 g Cloruro sódico 7,2 Fosfato monopotásico 1,45 Cloruro de magnesio, anhidro 13,4 Oxalato de verde malaquita 0,036 ph 5,1 ± 0,2 *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. PRECAUCIONES. Solamente para uso profesional. No utilizar los frascos si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, grietas o cualquier otro signo de deterioro. Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biológicos y desecho del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO. ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL Al recibir los frascos, almacenarlos en un lugar oscuro a 2 8 C hasta momentos antes de su utilización. Evitar la congelación y el sobrecalentamiento. Los frascos pueden inocularse hasta la fecha de caducidad (véase la etiqueta del envase) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Los frascos de envases abiertos pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad. Los frascos abiertos deben utilizarse de inmediato. BA CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los detalles, véase el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar durante h a 41,5 ± 0,5 C. Subcultivar en medio selectivos sólidos apropiados, por ej., BD Brilliant Green Agar.Incubar las placas durante h a C. RESULTADOS: 32

33 33

34 Lisina Hierro Agar. Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de ph, el cual es de color amarillo a ph igual o menor a 5.2, y de color violeta a ph igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado Extracto de levadura 3.0 en un litro de agua destilada. Dejar Glucosa 1.0 embeber unos 15 minutos. Calentar Lisina 10.0 cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la Citrato de hierro y amonio 0.5 disolución completa. Distribuir y esterilizar Tiosulfato de sodio 0.04 a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en Púrpura de bromocresol 0.02 pico de flauta dejando un fondo vertical Agar 15.0 apto para la punción. ph final: 6.7 ± 0.2 Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación. Incubación En aerobiosis, durante 24 horas a C. Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: 34

35 Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) Microorganismos Color en el pico de flauta Color en la base Ennegrecimiento del del tubo medio Proteus mirabilis ATCC Rojo Amarillo Negativo Salmonella typhimurium ATCC Púrpura Púrpura Positivo Salmonella enteritidis ATCC Púrpura Púrpura Positivo Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo Klebsiella pneumoniae ATCC Púrpura Púrpura Negativo Escherichia coli ATCC Púrpura Púrpura Negativo Características del medio Medio preparado: color violeta. Almacenamiento Medio deshidratado: a ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B x 500g :Código: B

36 TSI Agar Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de ph, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de Pluripeptona 20.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar Cloruro de sodio 5.0 con agitación frecuente, hervir 1 o 2 Lactosa 10.0 minutos hasta disolución total. Llenar Sacarosa 10.0 hasta la tercera parte de los tubos de Glucosa 1.0 ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 Sulfato de hierro y amonio 0.2 minutos. Enfriar en pico de flauta Tiosulfato de sodio 0.2 profundo. Rojo de fenol Agar 13.0 ph final: 7.3 ± 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubación A C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. Microorganismo Pico/Fondo Producción de gas Producción deácido sulfhídrico E. coli ATCC A/A