Plataforma para el desarrollo de una Vacuna bivalente pediátrica contra VIH-1 y M. tuberculosis.
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- Vicenta Campos Caballero
- hace 6 años
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1 Plataforma para el desarrollo de una Vacuna bivalente pediátrica contra VIH-1 y M. tuberculosis. Taller UITB 2011 Barcelona, J. Joseph et al. Hospital Clínic de Barcelona-IDIBAPS/HIVACAT Unitat de Recerca VIH/SIDA
2 ESTUDIO COLABORATIVO ENTRE: Hospital Clínic de Barcelona / HIVACAT. MRC Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford. EDCTP: European and Developing countries clinical trial partnership. PedVacc: Development of an infant vaccine against mother-to to-child transmission of HIV-1 through breast milk.
3 rbcg:hiv: de qué tipo de vacuna estamos hablando? José Esparza MD, PhD Bill & Melinda Gates Foundation, IAC 2004
4 Vector vacunal: Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin BCG(I) Ventajas del uso BCG como vector(i) Perfil bioseguridad (desarrollado como vacuna atenuada contra TB en 1920 por Calmette i Guérin ). Miles de millones de dosis administradas como vacunas frente a M. tuberculosis Producción en masa fácil y barata. Bacteria Intracelular, reconocida por las Células Dendríticas, Macrófagos,
5 Vector vacunal: BCG(II) Ventajas del uso BCG como vector (II) Adyuvante Inmunopotenciador natural, por la composición de la pared celular. Induce inmunidad celular y humoral de larga duración BCG recombinante se ha utilizado como vector vacunal frente a otras enfermedades. Utilizada como vacuna pediátrica trica, que se administra en las primeras semanas de vida. Forma parte del programa vacunal en la mayoría de países del mundo.
6 Map displaying BCG vaccination policy by country. A: The country currently has universal BCG vaccination program. B: The country used to recommend BCG vaccination for everyone, but currently does not. C: The country never had universal BCG vaccination programs. Zwerling A, Behr MA, Verma A, Brewer TF, Menzies D, et al. (2011) The BCG World Atlas: A Database of Global BCG Vaccination Policies and Practices. PLoS Med 8(3): e doi: /journal.pmed
7 Nuestro modelo vacunal: BCG.HIVA 222 ADN BCG Lys- Kan r BCG LysA - : BCG substrain Pasteur, Lys auxotrophic. pjh222hiva LysA OriE pjh222hiva HIVA OriM Plasmid DNA: pjh222hiva HIVA: Immunogen designed for a CTL response versus p24 p17 Pk Tag HIV-1 Clade A. multi-ctl epitope region
8 HIVA protein expression pjh222hiva plasmid structure
9 Vacunación: n: prime-boost heterólogo (dos vectores con el mismo inmunógeno) Inmunógeno: rbcg222hiva Modelo animal: BALB/c Vía de Inoculación: Intraperitoneal WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17 BCG INOC MVA INOC SACRIF.
10 IMMUNOGENICITY RESULTS IFN-γ and TNF-α by ICS In Vivo Killing Assay
11 rbcg:hiva in vivo stability rbcg isolated from vaccinated mice at 14 weeks p.v. At 14 weeks p.v., 100% of the isolated colonies carried the pjh222hiva plasmid
12 Pruebas de protección: Infección n con Mycobacterium tuberculosis Desafío subrogado con virus vaccinia que expresa HIVA 1) Naïve 2) BCG.p 3) BCG.HIVA 4) pthr.hiva DNA 5) pthr.hiva DNA + BCG.p 6) pthr.hiva + BCG.HIVA
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14 Protocolo de vacunación WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17 BCG INOC MVA INOC SACRIF. Grupos 1: 1: (6 (6 mice) BCG:HIVA + MVA:HIVA 2: 2: (6 (6 mice) BCGwt + MVA:HIVA Animales: Edad: Hembras BALB/C mice 7 semanas (adultos) 7 días (recién nacidos) Dosis: rbcghiva y BCGwt: cfu MVA:HIVA: pfu Vías inoculación: rbcghiva/bcgwt Adultos: -Intradérmica (ID) -Subcutánea (SC) Recién Nacidos: -Subcutánea (SC) MVA:HIVA -Intramuscular (IM)
15 Inducción de respuesta específica frente a VIH-1: ensayo ICS y CTL IFNγ+ (% CD8 + T-cells) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 ** *** * * IFN-γ ICS, CD8+, estimulación con P18I10 0,00 Adult I.D. Adult S.C. Newborn S.C. Respuesta citolítica in vitro frente a VIH. Células diana pulsadas 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 con P18I10 0,0 % specific killing 10,0 *** *** *** Adult I.D. Adult S.C. New born S.C.
16 Inducción de respuesta específica frente a Mycobacterium: ELISpot, esplenocitos, estimulación con PPD IFNγ sfu/10 6 splenocytes * 0 Adult S.C. Newborn S.C.
17 Seguridad de la vacuna: evolución del peso corporal de los ratones eight growth curve Body weight (gr) BCG 0 vacc. Vaccinated Newborn mice body weight growth curve BCGwt + MVA:HIVA rbcg:hiva MVA:HIVA BCGwt Naïve MVA vacc. BCG vacc. recién nacidos rbcg:hiva + MVA:HIVA MVA vacc Age (weeks) rbcg:hiva + MVA:HIVA BCGwt + MVA:HIVA rbcg:hiva MVA:HIVA BCGwt Naïve Mean
18 Desarrollo de un vector de refuerzo MVA recombinante que contiene inmunógenos de Mycobacterium (Ag 85A) para mejorar la respuesta inmune frente a Mycobacterium Tuberculosis en un programa de inducción-refuerzo con BCG. MVA.HIVA vs MVA.HIVA.85A
19 Priming Agents: -BCG.HIVA 401 BCG 1331 urec::ωpfoa -BCG.HIVA 222 BCG Pasteur lysa5 Boosting Agents: -Human Adenovirus serotype 5 (HAdV5.HIVA) -Ovine Atadenovirus serotype 7 (OAdV7.HIVA) -Modified Vaccinia Ankara Strain (MVA.HIVA) -Plasmid DNA (pth.hiva) -BCG.HIVA 222 (BCG Pasteur lysa5)
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21 Desarrollo del vector vacunal BCG.HIVA 222 kanminus Incluído en el proyecto financiado por la EDCTP PedVacc: Development of an infant vaccine against mother- to-child transmission of HIV-1 through breast milk. La parte del proyecto de nuestro grupo de investigación era: - Desarrollo de la cepa BCG.HIVA 222 libre de resistencias a antibióticos: BCG.HIVA 222 kanminus. - Caracterización de la cepa BCG.HIVA 222 kanminus y demostración de su inmunogenicidad y seguridad.
22 Eliminación de la resistencia a la BCG.HIVA 222 kanamicina del plásmido pjh222hiva Eliminación del gen de la resistencia a la kanamicina mediante un proceso de represor titration, realizado por Cobra Inc Kan r BCG.HIVA 222 kanminus pjh222hiva kanminus ADN BCG Lys- pjh222hivakanminus Transformación de BCG Pasteur Lys-
23 CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA 222 kanminus (I) ADN BCG LyspJH222HIVA kanminus pjh222hiva kanminus LysA OriM OriE HIVA Identificación del plásmido pjh222hiva kanminus por digestión con enzimeas de restricción. Demostración por PCR de la presencia de la secuencia codficante para HIVA en la Matriz de Siembra de BCG.HIVA 222 kanminus (carril 3), comparado con la banda obtenida de la cepa BCG.HIVA 222 con resistencia a kanamicina (carril 6).
24 CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA 222 kanminus (II) ADN BCG LyspJh222HIVA kanminus Confimación de la cepa BCG de Mycobacterium bovis mediante ensayo GenoType MTBC (Hain Lifescience GmbH). Confirmación de la subcepa Pasteur de BCG por Multiplex PCR, descrito por Bedwell et al. Vaccine. 2001, 19:
25 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA 222 kanminus (I) AUXOTROFIA PARA LISINA DE LA CEPA BCG Pasteur. PRESENCIA DEL GEN DE COMPLEMENTACION DE SÍNTESIS DE LISINA EN EL PLASMIDO. AUSENCIA DE RESISTENCIA A KANAMICINA. Demostración por dot-blot de la síntesis del polipéptido codificado por la secuencia de HIVA en BCG.HIVA222kanminus (Clon10)
26 DEMOSTRACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE BCG.HIVA 222 kanminus EN BALB/c 2x10 6 cfu ADULTOS: 7 semanas, vía ID NEWBORN: 7 días, vía SC 10 6 pfu Vía IM %CD8+ T- cells producing IFN-γ (P18I10 stimulation) Specific HIVA immune response by ICS staining in BALB/c mice inoculated with BCG.HIVA 222 kanminus+mva.hiva 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Adult Newborn Naïve sfu/10 6 splenocytes (PPD stimulation) Specific BCG immune response by ELISpot in BALB/c mice inoculated with BCG.HIVA 222 kanminus+mva.hiva Adult Newborn Naïve
27 DEMOSTRACIÓN DE LA SEGURIDAD DE BCG.HIVA 222 kanminus EN BALB/c Seguimiento de la evolución del peso corporal de los ratones adultos y recién nacidos durante el desarrollo de la prueba.
28 CONCLUSIONES - Se ha caracterizado genética y fenotípicamente BCG.HIVA 222 kanminus. - Se ha demostrado la inmunogenicidad y seguridad de BCG.HIVA 222 kanminus en ratones BALB/c adultos y recién nacidos. - El modelo desarrollado permitiria avanzar en la realización de ensayos clínicos. - El uso de inmunógenos contra M. tuberculosis en el virus de refuerzo (MVA.HIVA.Ag85A) aumenta la respuesta inmune frente a TB. - BCG.HIVA 222 es un buen vector de inducción con vectores de refuerzo distintos a MVA.HIVA: HAdV5.HIVA, OAdV7.HIVA. - BCGHIV+MVAHIV se podria utilizar como vacuna bivalente pediatrica contra TB y VIH.
29 Human Immunology Unit in the Weatherall Institute of Molecular Medicine (University of Oxford) Dr. Tomás Hanke Dr. Eung Jun-Im Dr. Maximilian Rosario Dr. Richard Hopkins Sevicio de Animalario del IDIBELL (Bellvitge) Joana Visa
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