LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VETERINARIA

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1 LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VETERINARIA Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Antioquia Fecha de elaboración: 13 de abril de Fecha de actualización: 13 de abril de 2015 GUÍA DE LABORATORIO DE: Fisiología general del sistema endocrino (demostrativo). Docentes: Carlos Andrés Giraldo Echeverri. Carlos Arturo Morales Vallecilla. Esta práctica de laboratorio tiene los siguientes objetivos de aprendizaje: Al final de este laboratorio usted: Comprender los términos de metabolismo y tasa metabólica basal. Familiarizarse con modelos animales experimentales para el estudio de la endocrinología. Analizar el funcionamiento del fenómeno de retroalimentación negativa. Comprender el papel de las hormonas tiroideas en el mantenimiento de la tasa metabólica. Relacionar la actividad de la insulina en la clínica de la diabetes tipo I y tipo II Comprender como se realiza una curva de glucosa estándar. Materiales y equipos: a) PhysioEx 9.1. b) Computador. c) Sistema de proyección. d) Cuaderno de apuntes. e) Regla f) Lápices y/o lapiceros Conceptos técnicos para revisar: Construcción de gráficas. El concepto de variable dependiente e independiente. Conceptos teóricos para revisar: Para la realización de este laboratorio es necesario realizar una lectura previa del tema de fisiología del sistema endocrino, y apoyarse en la revisión de los objetos de aprendizaje disponibles en la plataforma Moodle. Como puntos generales es necesario comprender las siguientes bases: El papel del sistema endocrino (al igual que el nervioso) en la homeostasis. El concepto de hormona (estructura, tipos, metabolismo). El concepto de glándula endocrina (anatomía, histología, fisiología). Liberación y transporte de hormonas. Señalización celular de las hormonas. Control de la función endocrina a través de los mecanismos de retroalimentación. Procedimiento: 1. Ingresar al software PhysioEx Ingresar al Ejercicio 4: Fisiología del sistema endocrino. 3. Leer detenidamente la introducción (overview). 4. Actividad 1. Metabolismo y hormona tiroidea: El amplio rango de reacciones bioquímicas que ocurren en el cuerpo se conoce como metabolismo, e incluye al anabolismo y al catabolismo.

2 El anabolismo es la fabricación de moléculas grandes a partir de pequeñas moléculas. Los enlaces químicos generados durante el anabolismo, contienen energía potencial. El catabolismo es el rompimiento de grandes moléculas en otras más pequeñas, mediante la acción de enzimas. El rompimiento de los enlaces químicos libera energía que puede ser utilizada por la célula, o transformarse en energía calórica. Los mamíferos somos animales homeotérmicos, que necesitamos mantener una temperatura corporal para las labores metabólicas. Las hormonas tiroideas son los principales biomoduladores para mantener el metabolismo y la temperatura corporal. En el hipotálamo se produce TRH, la cual estimula la liberación de TSH, quien a su vez, estimula la producción y liberación de T3 y T4 en la glándula tiroides. La T3 y T4 realizan una retroalimentación negativa sobre el hipotálamo y la hipófisis. En este primer ejercicio vamos a calcular la tasa metabólica de una rata, o sea, la cantidad de oxígeno que consume por una unidad de tiempo por masa corporal. Vamos a utilizar tres tipos de ratas experimentales en el simulador: 1) Normal. 2) Tiroidectomizada: se le extrajo quirúrgicamente toda la glándula tiroides. 3) Hipofisectomizada: se le extrajo quirúrgicamente toda la hipófisis. Ejercicio 1. Calcular la tasa metabólica basal (TMB) en una rata normal: - Colocamos la rata normal en un recipiente de vidrio cerrado. - Pesamos el animal. - La tapa del recipiente tiene dos salidas, una a la atmósfera y otra a una conexión en doble ( T ), la cual comunica a trampa de agua y a una jeringa. La trampa de agua es un tubo en U calibrado con una doble escala, con agua en su interior. La jeringa es una jeringa convencional. En la Figura 1 se esquematiza el sistema como lo verán en el simulador: Figura 1. Diagrama que representa un sistema de medición de tasa metabólica (cámara metabólica). - Vamos a calcular el consumo de oxígeno durante un minuto (se ajusta el cronómetro a 1 minuto). - Se cierra la llave de paso que comunica con la atmósfera. - La otra llave de paso se deja abierta en dirección a la trampa de agua. - El consumo de oxígeno de la rata se verá representado por la disminución de la presión parcial de oxígeno dentro del frasco. La presión parcial de un gas en el aire (en este caso dentro del frasco) corresponde a la parcial del cantidad del mismo (el aire es una mezcla de gases: nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, agua, nobles);

3 por lo tanto, su consumo reducirá parcialmente el volumen total de aire. Esta reducción se observa por el movimiento de agua hacia arriba, en la columna izquierda de la trampa de agua. - Para calcular cuánto oxígeno fue consumido, la llave de paso se abre hacia la jeringa. La idea es ir inyectando un volumen de aire conocido hasta que las dos columnas de agua en la trampa de agua queden nuevamente niveladas. Ese volumen de aire inyectado equivale al volumen de oxígeno consumido. - Por último, la fórmula para calcular la Tasa Metabólica es la siguiente: - La tasa metabólica basal de un animal sano, o eutiroideo, está en el rango de Además, al finalizar la medición de la tasa metabólica, tendrán la opción de palpar la glándula tiroides y obtener la información semiológica básica. - Recuerden grabar los datos obtenidos (peso, ml O2/min, ml O2/h, palpación, TMB) Ejercicio 2. Calcular la tasa metabólica basal de una rata hipofisectomizada: En el simulador, repetiremos los pasos del ejercicio 1, pero utilizando una rata hipofisectomizada. Realice sus hipótesis predictivas con respecto a la tasa metabólica de este animal, comparándola con la normal. Las tasas metabólicas basales puedes indicar el estado clínico de los animales según la Tabla 1: Clasificación Tasa Metabólica Basal Hipotiroideo <1600 Eutiroideo Hipertiroideo >1800 Tabla 1. Clasificación del estado clínico de una rata según su tasa metabólica basal. Ejercicio 3. Calcular la tasa metabólica basal de una rata En el simulador, repetiremos los pasos del ejercicio 1 y 2, pero utilizando una rata tiroidectomizada. Realice sus hipótesis predictivas con respecto a la tasa metabólica de este animal, comparándola con la normal y la hipofisectomizada (consulte la Tabla 1). 5. Actividad 2. Determinación del efecto de la Tiroxina, la TSH y el Propiltiuracilo en el Metabolismo: La tiroxina es la hormona tetrayodotironina (T4), producida en la glándula tiroides. Se produce en mayor proporción y tiene una vida media mayor que la triyodotironina (T3). Su efecto sobre el metabolismo ocurre una vez ingresa a la célula y se desionidiza a T3. En esta simulación, las ratas se aclararán de tiroxina (metabolizarán la tiroxina) inmediatamente; en un laboratorio real se deben esperar algunas semanas o utilizar una nueva rata experimental. La TSH es la hormona estimulante de tiroides (o tirotropina). Se produce en la adenohipófisis por estímulo de la TRH. En esta simulación, el efecto de la TSH será inmediato; en un laboratorio real, se debe inyectar diariamente durante 1 a 2 semanas para evidenciar los efectos metabólicos. El propiltiouracilo, es un medicamento que inhibe la producción de tiroxina mediante el bloqueo de la iodinización de los residuos de tirosina en las células foliculares de la tiroides. En esta simulación, el efecto de la propiltiouracilo será inmediato; en un laboratorio real, se debe inyectar diariamente durante 1 a 2 semanas para evidenciar los efectos metabólicos. El signo clínico de Coto o Bocio es el aumento del tamaño de la glándula tiroides. Se determina por palpación, o incluso, por la visualización directa de la glándula agrandada en el cuello (dependiendo de la morfología específica del animal).

4 Ejercicio 1. Determinar el efecto de la tiroxina en la tasa metabólica de una rata normal, hipofisectomizada y Para este ejercicio repetirán los pasos realizados en la Actividad 1, con cada uno de los animales experimentales, aplicándoles tiroxina antes de ingresarlos a la cámara metabólica. Ejercicio 2. Determinar el efecto de la TSH en la tasa metabólica de una rata normal, hipofisectomizada y Repita los pasos que ya ha realizado en los ejercicios anteriores, aplicando esta vez TSH. Ejercicio 2. Determinar el efecto del propiltiouracilo en la tasa metabólica de una rata normal, hipofisectomizada y Repita los pasos que ya ha realizado en los ejercicios anteriores, aplicando esta vez propiltiouracilo. 6. Actividad 3. Glucosa plasmática, Insulina y Diabetes mellitus. La hormona insulina es producida en las células beta del páncreas endocrino. Su principal función es movilizar la glucosa plasmática hacia al interior de las células para ser usada en los procesos metabólicos. Cerca del 75% de la glucosa es almacenada como glicógeno (o almidón), principalmente en el hígado y en el músculo esquelético. Este recurso puede utilizarse en períodos de ayuno para elevar la glicemia, utilizando glucagón para producir glucosa a partir del glicógeno. La diabetes mellitus tipo 1 aparece cuando el páncreas no produce suficiente glucosa. Si las células no repsonden a la insulina (falta de receptores), se genera diabetes mellitus tipo 2. En mabas se filtra la glucosa plasmática hacia la orina. En la diabetes, el músculo esquelético inicia proteólisis para usar los aminoácidos en la formación de glucosa. Esto genera un balanca negativo de nitrógeno, pérdida de tejidos e incluso deterioro del sistema inmune. Ejercicio 1. Generar una curva estándar de glucosa: En este ejercicio se recreará en el simulador la forma en la que se realiza la medición clínica de glucosa plasmática, a partir de la creación de una curva estándar de glucosa. Básicamente se utilizan concentraciones conocidas de glucosa para medir su densidad óptica (absorbancia) en un espectofotómetro, lo cual genera una curva estándar. Esta curva sirve para calcular la concentración de glucosa en muestras clínicas. - Se preparan cinco tubos con las siguientes concentraciones de glucosa: 30 mg/dl, 60 mg/dl, 90 mg/dl, 120 mg/dl, 150 mg/dl. Para esto, se tiene una muestra inicial de glucosa a 30 mg/dl (por gota) y se diluye usando agua destilada. - Las muestras se mezclan y se centrifugan. Luego se remueve el pellet formado y se deja el sobrenadante. - Luego, se agrega una enzima coloreada en igual proporción a los cinco tubos. Las muestras se incuban agitándolas constantemente. - Se lleva cada muestra al espectofotómetro y se realiza una gráfica en la que la variable dependiente es la densidad óptica y la independiente la concentración de glucosa (la cual conocemos). - Se unen los puntos y se calcula la curva estándar de glucosa.

5 Ejercicio 2. Medición de niveles de glucosa en ayunas: En este ejercicio se utilizará la curva estándar generada en el ejercicio anterior. Se tienen cinco muestras de plasma de pacientes con mínimo ocho horas de ayuno. - Se preparan las muestras agregando: agua destilada, hidróxido de bario y heparina. - El hidróxido de bario lisa las proteínas plasmáticas y membranas celulares; la heparina previne la formaciónd e coágulos. Ambos se agregan para que la lectura en el espectofotómetro sea lo más precisa posible. - Se mezclan y centrifugan los tubos. Luego, se retira el pellet sobrante. - Se agrega la enzima marcada con colorante y se incuban las muestras mientras se agitan. - Se lleva cada una al espectofotómetro para calcular su densidad óptica. - La concentración de glucosa plasmática en ayunas se calcula según el punto de corte sobre la curva estándar de glucosa. - Las concentraciones de glucosa predicen lo siguiente (Tabla 2): Concentración de glucosa Clínica <110 mg/dl Normal 110 a 126 mg/dl Incapacidad de ingresar la glucosa por parte de las células. >126 mg/dl Diabetes Tabla 2. Concentraciones de glucosa plasmática en ayunas y referencias clínicas. Realice las hipótesis predictivas mientras realiza el laboratorio demostrativo. Pregunta especial: qué tipo de enzima es la que se está utilizando en esta herramienta diagnóstica? Preguntas evaluativas: Las preguntas se realizarán durante la ejecución del laboratorio, por su carácter demostrativo. Se evaluarán de manera grupal.