11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12N 1/20

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12N 1/ A01N 63/00 //(C12N 1/ C12R 1:24) 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Una cepa de microorganismo, una preparación bacteriana que comprende esta cepa, utilización de esta cepa y de esta preparación para el control de levaduras y mohos. kprioridad: FI k Titular/es: Valio OY Meijeritie Helsinki, FI k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Mäyrä-Mäkinen, Annika y Suomalainen, Tarja k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría Goiburu, Bernardo ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 Campo de la invención DESCRIPCION La invención presente se refiere a una nueva cepa de microorganismos teniendo un excelente efecto inhibidor de levaduras y mohos, a preparaciones bacterianas constando de dicha cepa sola o en combinación con otras bacterias y/o aditivos, y a la utilización de dicha cepa y dichas preparaciones bacterianas para la inhibición de levaduras y mohos. Antecedentes de la invención El tiempo de durabilidad y utilidad de los artículos alimenticios y ensilaje, por ejemplo, es dañado a menudo por el deterioro provocado por levaduras y mohos. Las levaduras y mohos pueden presentar también problemas en la producción de artículos alimenticios, y particularmente en la industria fermentadoralos efectos adversos son grandes. Se han utilizado principalmente sorbato y propionato, en forma de diversas sales alcalinas, para la inhibición de levaduras y mohos en artículos alimenticios. Sin embargo, se tiende a reducir el uso de aditivos de esta clase, y por ejemplo el uso de sorbato está prohibido en algunos países europeos. Los inconvenientes del propionato incluyen el hecho de que no siempre tienen un efecto suficiente y el hecho de que da un sabor a los artículos alimenticios. Puesto que las actitudes de los consumidores que están aumentando contra el uso de aditivos así como la diferente legislación de artículos alimenticios en países diferentes deben ser tomadas en cuenta, la industria se ha esforzado en encontrar bioconservantes naturales para reemplazar tales aditivos. Las bacterias del ácido láctico son conocidas por producir diversos compuestos antimicrobianos, tales como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas, y uno ha intentado utilizar éstos como aditivos, por ejemplo para mejorar el tiempo de durabilidad de los artículos alimenticios. Disponible comercialmente está el producto Nisaplin (Aplin & Barrett), constando de nisina purificada producida por la bacteria Lactococcus lactis y teniendo efecto solamente en bacterias gram-positivas, y no teniendo de ese modo efecto inhibitorio en el crecimiento de mohos y levaduras. Se han hecho esfuerzos para aumentar intensivamente el uso de bacterias del ácido láctico, por ejemplo en la conservación de forraje ensayando combinaciones de bacterias del ácido láctico principalmente con diversas preparaciones enzimáticas. Sin embargo, tales combinaciones no tienen un efecto inhibitorio en el crecimiento de levaduras y mohos, y por lo tanto no han proporcionado una solución a los problemas causados por levaduras y mohos. La solicitud europea publicada N revela un procedimiento para preparar productos inhibidores de levaduras y mohos cultivando una especie de Lactobacillus y aislando los productos excretados en el medio de crecimiento. Estos productos manifiestan ser una mezcla compleja de compuestos de bajo peso molecular (PM < 1.000), y se aíslan del medio de crecimiento mediante un procedimiento multietapa, el cual además de etapas de extracción para llevar a cabo con butanol y etanol consta de cromatografía en columna y precipitación por acetona o etapas de diálisis. Tal procedimiento complicado no está disponible para producción a gran escala. En dicha aplicación, se utilizan esporas de Penicillium oxalicum para mostrar el efecto inhibitorio. Sumario de la invención 0 El objeto de la invención presente fue encontrar nuevas soluciones a los problemas causados por levaduras y mohos. Cuando se estudió el efecto de los factores antimicrobianos de diversas bacterias del ácido láctico y propiónicas en el crecimiento de levaduras y mohos, se encontró inesperadamente que una nueva cepa bacteriana del género Lactobacillus, la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, tiene un excelente efecto inhibitorio contra mohos, por ejemplo mohos de las especies Penicillium, Aspergillus, Cladosporium y Fusarium, y levaduras, por ejemplo la especie Candida, especialmente cuando se utilizó como suspensión celular en su caldo de fermentación. Además, se encontró inesperadamente que el efecto de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 se puede mejorar sustancialmente mediante una bacteria del género Propionibacterium, particularmente la cepa Propionibacterium shermanii JS. También se puede mejorar el efecto utilizando la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en combinación con otra cepa Lactobacillus casei, particularmente la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum

3 ES T3 También es posible mejorar el efecto de la cepa anterior, o de las combinaciones anteriores, mediante sustancias conocidas utilizadas para la inhibición de levaduras y mohos, tales como propionato de metal alcalino o fenilalanina. 2 Por lo tanto, el objeto de la invención presente es una nueva cepa bacteriana del género Lactobacillus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM Otro objeto de la invención presente es una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei, preferentemente como una suspensión celular en caldo de fermentación. Un objeto adicional de la invención presente es el uso de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos. Un objeto adicional de la invención presente es el uso de una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos. Todavía otro objeto de la invención presente es un método para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos, estando caracterizado el método por utilizar una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei, preferentemente como una suspensión celular en caldo de fermentación. Descripción detallada de la invención La invención se basa en la nueva cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, depositada el 13 de Mayo de 1992 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) con el número de depósito DSM 7061, y teniendo las siguientes propiedades: - varilla corta gram-positiva en cadenas 3 - homofermentativa - buen crecimiento a -4 C - la cepa no tiene actividad proteolítica - no produce amoniaco a partir de arginina - catalasa-negativa cuando crecen en un caldo MRS (LAB M), la cepa produce 1 6 % de ácido láctico teniendo una actividad óptica de la configuración L(+); la cepa descompone citrato (0 169 %), produciendo diacetilo y acetoína; la cepa fermenta como mínimo los siguientes carbohidratos (azúcares, alcoholes de azúcares): ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-sorbosa, ramnosa, manitol, sorbitol, metil-d-glucósido, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, celobiosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, melecitosa, gentiobiosa, D-turanosa y D-tagatosa. - sobrevive bien a una salinidad del % y justamente bien a una salinidad del %. La cepa Propionibacterium shermanii JS ha sido depositada el 13 de Mayo de 1992 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM 7067 y tiene la siguientes propiedades: - gram-positiva, varilla corta - fermenta glucosa, fructosa, galactosa y lactosa - fermenta lactato bien 3

4 ES T3 - temperatura de crecimiento óptimo 32 C La cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 es obtenible a partir de la colección de microorganismos de la Finnish Dairies Central Co-Operative Society Valio mediante el número de producto 1931, y tiene las siguientes propiedades: - gram-positiva, varilla corta - facultativamente heterofermentativa - buen crecimiento a -4 C - ninguna actividad proteolítica - no produce amoniaco a partir de arginina - produce D(-) y L(+) ácido láctico. 2 3 La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 se produce creciendo por ejemplo en un medio decrecimientobasadoensuerodurante2a3días a una temperatura de -37 Cconosinajuste de ph. Se recupera el caldo de fermentación conteniendo células y se utiliza tal cual, concentrado, o liofilizado. La concentración se puede llevar a cabo utilizando un aparato de microfiltración o algún otro método correspondiente. El caldo de fermentación constando de células de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 conserva su actividad inhibidora de levaduras y mohos cuando se almacena frío (a temperatura de frigorífico) por lo menos durante dos meses, y liofilizado incluso mas tiempo. Si se desea, se pueden añadir otras bacterias o aditivos utilizados para inhibición de levaduras y mohos a este caldo de fermentación conteniendo células. Cuando se emplean bacterias, dicha otra cepa bacteriana se puede cultivar simultáneamente con o separadamente de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70. El cultivo simultáneo de las cepas es ventajoso debido a su simplicidad y facilidad. Por otra parte, el cultivo independiente de las cepas hace posible variar las proporciones de las cepas que se van a incluir en la preparación bacteriana, si se desea. Es naturalmente posible utilizar preparaciones liofilizadas de ambas bacterias, las cuales se reconstituyen juntas o separadamente. Preferentemente, bacterias del género Propionibacterium o células de otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei se añaden al caldo de fermentación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, o la cepa se cultiva conjuntamente con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei. Preferiblemente, las preparaciones son aquellas constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS, o la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum Mas preferiblemente es añadir al caldo de fermentación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 la cepa Propionibacterium shermanii JS, o cultivar las dos cepas juntas. 4 0 Una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium, por ejemplo la cepa Propionibacterium shermanii JS, u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei, tal como la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931, se puede utilizar para la prevención de problemas causados por levaduras y mohos en muchos campos industriales, por ejemplo para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos durante el proceso de fabricación, o para inhibir el deterioro causado por levaduras y mohos, por ejemplo en productos de la industria alimentaria, industria fermentadora y la industria forrajera. La invención será descrita mas detalladamente mediante los ejemplos siguientes. Estos ejemplos se dan solamente para aclarar la invención, y no serán considerados como limitantes del campo de aplicación de la misma. Ejemplo 1 Producción de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 creció en un medio de crecimiento basado en suero conteniendo % de permeado de suero (Valio), 2 % de hidrolizado de caseína (Valio) y 1 % de extracto 4

5 ES T3 de levadura (Difco) en agua destilada. Es posible la variación en los componentes nutrientes. Durante el cultivo, el ph del medio de crecimiento se mantuvo a 4 mediante ajuste automático de ph. El cultivo se realizó a granel cultivando a -37 C durante dos días, después de lo cual se recuperaron las células en un estado de crecimiento estacionario. El contenido bacteriano en el caldo de fermentación conteniendo células fue del orden de 9 UFC/ml. El caldo de fermentación conteniendo células se puede utilizar tal cual o concentrado. Para preparar el concentrado, el caldo de fermentación conteniendo células se concentra por ejemplo a veces. La concentración se realizó utilizando un aparato de microfiltración. También se puede utilizar otro método correspondiente. El contenido bacteriano en el concentrado fue del orden de UFC/ml. El caldo de fermentación se conservó tal cual o como un concentrado a unos 4 C o liofilizado. Ejemplo Producción de la cepa Propionibacterium shermanii JS La cepa Propionibacterium shermanii JS creció en un caldo de fermentación de propiona durante tres días a C en un matraz Erlenmeyer. El caldo de fermentación de propiona contenía 0 % de triptona (Difco), 1 0 % de extracto de levadura (Difco) y 4 1 % de lactato sódico ( %, Valio) en agua destilada. Es posible la variación en los componentes nutrientes. Cuando el crecimiento estaba en fase estacionaria, se recuperaron las células en su caldo de fermentación. El contenido en Propionibacterium shermanii JS fuedelordende UFC/ml. El caldo de fermentación conteniendo células se puede utilizar tal cual o concentrado. La concentración se puede realizar como se expuso en el Ejemplo 1. La suspensión celular (caldo de fermentación con células) se puede conservar tal cual o concentrada a una temperatura de unos +4 C. Ejemplo 3 Producción de una preparación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS fueron inoculadas en un caldo de fermentación basado en suero en una proporción de 1:2 ó 1: dependiendo del contenido en ácido propiónico deseado del producto final. La composición del medio de crecimiento basado en suero fue 1) 3 % de permeado de suero, 1 0 % de hidrolizado de caseína, 1 0 % de extracto de levadura y 0 % de citrato sódico, 2) 3 % de permeado de suero, 1 0 % de hidrolizado de caseína, 1 0 % de extracto de levadura, 0 % de citrato sódico y 0 % de cloruro sódico, ó3)4 0%depermeado de suero, 1 0 % de hidrolizado de caseínay 1 0 % de extracto de levadura. Las cepas se cultivaron durante tres días a C manteniendo el ph a 4 mediante ajuste automático de ph. Al final del cultivo, se recuperó el caldo de fermentación con células. Tal caldo de fermentación conteniendo células es útil dos meses como mínimo cuando se refrigera. Un caldo de fermentación conteniendo células en el que el contenido de cada bacteria estaba en exceso de 2 UFC/ml se utilizó comopreparación inhibiendo el crecimiento de mohos y levaduras. El contenido en ácido láctico de la preparación fue de aproximadamente %, el contenido en ácido propiónico fue de aproximadamente 0-0 mg/0 g, dependiendo de la cantidad de inóculo empleado (por ejemplo 1% ó %), y el contenido en ácido acético fue de aproximadamente 0- mg/0 g. La preparación aguanta el calentamiento a C durante minutos sin perder su actividad totalmente, pero un tratamiento a 70 Cdaña claramente su actividad inhibidora de levaduras y mohos. El ph de la preparación podría ser aumentado a 8 sin ser dañada la actividad. Ejemplo 4 Producción de una preparación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 Las cepas Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 crecieron durante 2 a 3 días a -37 C en un medio de crecimiento basado en suero conteniendo 0 % de permeado de suero, 2 0 % de hidrolizado de caseína y 1 0 % de extracto de levadura. El caldo de fermentación con células se concentró con un aparato de microfiltración. El caldo de fermentación se utilizó tal cual (contenido bacteriano del orden de aproximadamente 9 UFC/ml) o como concentrado

6 ES T3 a un contenido bacteriano de aproximadamente UFC/ml para inhibición de mohos y levaduras. Ejemplo 2 3 Inhibición de mohos y levaduras con la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 Se utilizaron en el ensayo de inhibición mohos de los géneros Penicillium, Aspergillus y Cladosporium aislados de artículos alimenticios, tales como pan y queso, y el moho Fusarium sp. aislado de ensilaje, así como levaduras del género Candida aisladas del pan. Los mohos y levaduras, excepto el moho Fusarium, se regeneraron dos veces antes del ensayo verdadero en tubos de agar inclinado de malta (MEA). El último cultivo se realizó a2 C durante 2 a 3 días. El agar de malta contenía 2 % de extracto de malta (Difco), 0 1 % de peptona (Difco), 2 0 % de glucosa y 1 % de agar. El moho Fusarium se regeneró en agar de patata-dextrosa (agar PD, LAB M). Se pipetearon ml de una solución estéril de cloruro sódico al 0 9 % en el tubo de agar inclinado de mohos o levaduras, siendo suspendido cautelosamente el crecimiento en el tubo de agar inclinado en dicha solución frotando con un asa de siembra estéril. Un ml de esta suspensión se pipeteó en 0 ml de solución estéril de cloruro sódico al 0 9%. El contenido en mohos/levaduras en esta etapa fue - 6 UFC/ml. Se aplicó 0 1 ml de esta suspensión básica a cada placa de ensayo. 1 ml(ó 0 ml)de la preparación descrita en el Ejemplo 1 (contenido bacteriano aproximadamente 9 UFC/ml) se pipeteó en una placa dentro de la cual se fundió ml de agar PC a 4 C (Plate Count Agar, Difco), y se dejó que el agar solidificase. Con el moho Fusarium, se empleó agar PD (Agar Patata- Dextrosa,LABM).Sepipeteó 0 1 ml de la suspensión de mohos o levaduras descrita anteriormente en el agar solidificado y se pulverizó de modo uniforme sobre la placa. Las placas se cultivaron durante 1 día a C y luego durante 2 días a 2 C. Después del cultivo, las placas se compararon con placas de control a las que no se había añadido preparación de ensayo. Se leyó, a partir de las placas, la intensidad del crecimiento de mohos y levaduras comparado con el crecimiento de los controles. El efecto inhibitorio de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en concentraciones del % y % contra levaduras y mohos se muestra en la Tabla 1. Las abreviaturas de especies de mohos y levaduras en la tabla representan los mohos Penicillium sp. 1 (16A), Penicillium sp. 2 (114), Penicillium digitatum (L), Aspergillus niger (L22), Cladosporium sp. 1 (P1), Penicillium sp. 3 (MZ1) y Fusarium sp. 1 (FH-1), y las levaduras Candida sp. 1 (L9) y Candida lusitaniae (L18). La interpretación de los resultados mostrados en la tabla es el siguiente: +++ = crecimiento de mohos muy fuerte, como en el control; ++ = buen crecimiento de mohos; + = crecimiento débil de mohos; - = ningún crecimiento de mohos. La abreviatura SS utilizadas en la tabla representa un caldo de fermentación conteniendo células. TABLA 1 Efecto inhibitorio de la preparación LC-70 4 Inhibidor Moho/levadura A L L9 L18 L22 P1 MZ1 FH1 0 SS % SS % Control La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en una concentración del % inhibió los mohos Penicillium sp. (16A y MZ1), Cladosporium sp. (P1) y Fusarium (FH-1), y las levaduras Candida. Por otra parte, una adición del % inhibió completamente el crecimiento del moho Fusarium (FH-1) solamente. 6

7 ES T3 Ejemplo 6 Inhibición de mohos y levaduras con una combinación de la cepa Lactobacillus casei ssp. LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS (1:2) rhamnosus La preparación Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y Propionibacterium shermanii JS (preparación LC-70 y JS, 1:2) había sido producida como se describe en el Ejemplo 3. El efecto inhibitorio de la preparación en una concentración del % ambas como una suspensión celular y como un concentrado de suspensión celular contra levaduras y mohos se estudió como se describe en el Ejemplo para la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70. Se muestran los resultados en la Tabla 2. Las abreviaturas para las especies de mohos y levaduras utilizadas en la tabla, y la interpretación de los resultados presentados son como anteriormente en el Ejemplo. La abreviatura SS utilizada en la tabla representa un caldo de fermentación conteniendo células, la abreviatura Kons representa un caldo de fermentación concentrado conteniendo células, y la abreviatura SN representa un caldo de fermentación sin ninguna célula. Inhibidor TABLA 2 Efecto inhibitorio de la preparación LC-70 y JS (1:2) Moho/levadura 16A L L9 L18 L22 P1 MZ1 FH1 2 SS % Kons % SN % Control Con el caldo de fermentación conteniendo células (SS), el crecimiento de los mohos Penicillium (16A, L y MZ1), Cladosporium (P1), Aspergillus niger (L22) y Fusarium (FH-1) fue inhibido totalmente. También se inhibió totalmente el crecimiento de levaduras (L9) y (L18). En las placas tratadas con una suspensión celular concentrada, se presentó crecimiento de mohos en dos placas y crecimiento de levaduras en una placa. El sobrenadante del cultivo celular, de donde se habían quitado las células por centrifugación (SN), no tuvo efecto inhibitorio en el crecimiento de mohos y levaduras. 4 Ejemplo 7 Inhibición de mohos y levaduras con una combinación de la cepa Lactobacillus casei ssp. LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS (1:) rhamnosus 0 La preparación Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y Propionibacterium shermanii JS (preparación LC-70 y JS, 1:) había sido producida como se describe en el Ejemplo 3. El efecto inhibitorio de la preparación en una concentración del % ambas como una suspensión celular y como un concentrado de suspensión celular contra levaduras y mohos se estudió como se describe en el Ejemplo para la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70. Se muestran los resultados en la Tabla 3. Las abreviaturas para las especies de mohos y levaduras utilizadas en la tabla, la interpretación de los resultados presentados y las otras abreviaturas son como anteriormente en los Ejemplos y 6. 7

8 ES T3 TABLA 3 Efecto inhibitorio de la preparación LC-70 y JS (1:) Inhibidor Moho/levadura 114 L L9 L18 L22 P1 MZ1 FH1 SS % SN % Control Con el caldo de fermentación conteniendo células (SS), el crecimiento de los mohos Aspergillus niger (L22), Penicillium sp. (MZ1), Cladosporium sp. (P1), y Fusarium sp. (FH-1) fue inhibido totalmente. También se inhibió totalmente el crecimiento de la levadura Candida sp. 1 (L9). El crecimiento de los mohos Penicillium sp. 2 y Penicillium digitatum (114 y L) y la levadura Candida lusitaniae (L18) fue claramente debilitado. El sobrenadante del cultivo celular, de donde se habían quitado las células por centrifugación (SN), no tuvo efecto inhibitorio en el crecimiento de mohos y levaduras. 2 Ejemplo 8 Inhibición de mohos y levaduras con una combinación de la cepa Lactobacillus casei ssp. LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS (1:1) rhamnosus 3 La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2, respectivamente, después de lo cual los caldos de fermentación con células se combinaron en una proporción de 1:1. El efecto inhibitorio del compuesto contra mohos y levaduras se estudió como se describe en el Ejemplo para la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70. Se muestran los resultados en la Tabla 4. Las abreviaturas para las especies de mohos y levaduras utilizadas en la tabla, la interpretación de los resultados presentados y las otras abreviaturas son como anteriormente en el Ejemplo. TABLA 4 Efecto inhibitorio de la preparación LC-70 y JS (1:1) Inhibidor Moho/levadura 114 L9 L22 P1 MZ1 4 SS % SS % Control Como una adición del %, la preparación inhibió el crecimiento de la levadura Candida sp. 1 (L9) y el crecimiento de los mohos Aspergillus niger (L22), Cladosporium sp. 1 (P1) y Penicillium sp. 3 (MZ1) totalmente en los ensayos de placas. A una concentración del %, la preparación retardó claramente el crecimiento de los mohos L22, P1 y MZ. 8

9 ES T3 Ejemplo 9 Inhibición de mohos y levaduras con una combinación de la cepa Lactobacillus casei ssp. LC-70 y la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 rhamnosus La preparación Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 (preparación LC-70 y 1931, 1:1) había sido producida como se describe en el Ejemplo 4. El efecto inhibitorio de la preparación a una concentración del % ambas como una suspensión celular y como un concentrado de suspensión celular contra levaduras y mohos se estudió como se describe en el Ejemplo paralacepalactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70. Se muestran los resultados en la Tabla. Las abreviaturas para las especies de mohos y levaduras utilizadas en la tabla, la interpretación de los resultados presentados y las otras abreviaturas son como anteriormente en los Ejemplos y 6. TABLA Efecto inhibitorio de la preparación LC-70 y 1931 (1:1) Inhibidor Moho/levadura A L L9 L18 L22 P1 MZ1 SS % Kons % SN % Control De estas preparaciones, la mas eficaz en inhibir mohos y levaduras fue el caldo de fermentación concentrado conteniendo células (concentrado celular). El caldo de fermentación conteniendo células, tal cual, tuvo una actividad notablemente mas débil que la tuvo el concentrado, y el sobrenadante del cultivo celular, del que se habían quitado las células por centrifugación (SN), no tuvo efecto para inhibir el crecimiento de mohos y levaduras. Ejemplo 4 0 Utilización de preparaciones constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en la producción de ensilaje pre-desecado La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS crecieron en un fermentador durante 3 días a C a ph 4. La composición del medio de crecimiento fue la siguiente: 4 % de permeado de suero, 1 % de hidrolizado de caseína y 1 % de extracto de levadura. Se utilizó como preparación una suspensión celular (caldo de fermentación con células) teniendo un contenido celular de 1 2 x 9 UFC/ml para LC-70 y 1 1 x 9 UFC/ml para JS. La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum 1931 crecieron juntas a un contenido total de aproximadamente 2 x 11 UFC/ml en un fermentador durante 2 días a C a ph 4. La composición del medio de crecimiento fue la siguiente: 4 % de permeado de suero, 1 % de hidrolizado de caseína, 1 % de extracto de levadura y 0 1 % de Tween 80. Se utilizó como preparación un concentrado celular teniendo un contenido celular de 2 x 11 UFC/ml. La cepa Lactobacillus plantarum LB 7 - creció en un fermentador en un medio de crecimiento H conteniendo % de permeado de suero, 0 % de hidrolizado de caseína, 0 2 % de extracto de levadura, 0 0 g/l de SO 4 Mn y 0 1 % de Tween 80, durante horas a C a ph 4. Se utilizó como preparación una suspensión celular teniendo un contenido celular de 7 x UFC/ml. Un moho Fusarium (F67) creció en un tubo de agar inclinado PD durante 3 días a 2 C, después de lo cual el crecimiento se suspendió en una solución estéril de cloruro sódico al 0 9 %. El contenido de mohos en la suspensión fue de aproximadamente 6 UFC/ml. En el ensilaje, el contenido fue de 9

10 ES T3 aproximadamente -0 UFC/g. Las preparaciones se mezclaron con ensilaje pre-desecado ( kg) pulverizando, después de lo cual el ensilaje se empaquetó compactamente en silos. Los resultados se muestran en las Tablas 6 a 8 a continuación. El silo 1 es un silo de control sin inóculo. El silo 2 es una muestra tratada con preparación LC-70 + JS (2 %) y moho F67. El silo 3 es una muestra tratada con preparación LC (2 %) y moho F67. El silo 4 es una muestra tratada con preparación LB 7 - (2 %) y moho F67. El silo es una muestra tratada con moho F67 (-0 UFC/ml). Se tomaron muestras de los silos inmediatamente después de la adición, antes de que se cerraran los silos, y diez semanas después de la adición. Las levaduras y mohos, excepto el moho Fusarium, se determinaron con medio de crecimiento HDK teniendo la composición siguiente: 0 % de extracto de levadura, 2 % de dextrosa y 0 mg/ml de cloramfenicol en agar al 1 %. El moho Fusarium se determinó con agar PD. Las bacterias coliformes se determinaron con agar VRB (Violet Red Bile Agar, LAB M), las bacterias del ácido láctico con agar MRS y las bacterias propiónicas con un medio de crecimiento de lactato sódico teniendo la composición siguiente: 0 % detriptona (Difco), 1 2 % de lactato sódico al % y 1 % de extracto de levadura en agar al 1 %. Las bacterias totales se determinaron con agar PC. TABLA 6 Contenido microbiano inicial en ensilaje (UFC/g) 2 Silo Coli Bacterias Bacterias Bacterias ácido láctico totales propiónicas x x x x x x x x x 2 7 x x 7 1 x x 3 4 x x 7 4 x 8 no se podían mostrar TABLA 7 Contenido microbiano final en ensilaje (UFC/g) 4 0 Silo Coli Bacterias Bacterias ácido láctico totales 1 < 6 1 x 7 < < 1 0 x 3 < < 1 2 x 9 < < 1 6 x 8 <1.000 < 9 0 x 7 <1.000

11 ES T3 TABLA 8 Contenido en levaduras y mohos en ensilaje (UFC/g) Silo Levaduras Mohos Tiempo 0s. s. 11 s. 0s. s. 11 s x 2x 4 x x 3 <1.000 < x < x 1 8 x <1.000 < x < x x < x x x 7x x < x 2 6 x 2 6 x 6 x x < x 4 Después del almacenaje de diez semanas, había diferencias en la apariencia de los silos abiertos. Un crecimiento superficial blanco visible se había formado en todos los silos excepto en el silo 2, siendo dicha superficie, obviamente, crecimiento de levaduras. Los silos 1 y contenían el mayor crecimiento de levaduras. Según la determinación microbiológica, (sensibilidad de determinación <1.000), el silo 2 y el silo3nocontenían bacterias aeróbicas o levaduras y mohos. Los silos 1, 4 y tenían microbios aeróbicos en el momento de apertura. Según la determinación hecha de los silos una semana mas tarde (11 semanas a partir del comienzo del ensayo), se había desarrollado un crecimiento de levaduras en todos los silos. El contenido en levaduras fue mas bajo en el silo 2. Se había desarrollado un crecimiento de mohos en los silos 3, 4 y. El inóculo añadido al silo 2 había inhibido el crecimiento de moho. Ejemplo 11 Utilización de preparaciones constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en la producción de ensilaje pre-desecado (contenido en materia seca 2-0 %) La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS crecieron en un fermentador durante 3 días a C a ph 4. La composición del medio de crecimiento fue la siguiente: 3 % de permeado de suero, 1 % de hidrolizado de caseína, 1 0 % de extracto de levadura y 0 % de citrato sódico (Difco). Se utilizó como preparación una suspensión celular teniendo un contenido celular de x 8 UFC/ml para LC-70 y 2 x UFC/ml para JS. Se añadió pulverizando el 2 % de la preparación al ensilaje embalado en redondo pre-desecado teniendo un contenido en materia seca del %. Se tomaron muestras de la bala redonda con un taladro estéril según un calendario. Se utilizó ensilage conservado sin un conservante como muestra de referencia. Los resultados microbiológicos se muestran en las Tablas 9 y a continuación. Las determinaciones microbiológicas se hicieron mediante métodos descritos en el Ejemplo anterior. 11

12 ES T3 TABLA 9 Resultados microbiológicos de ensilaje embalado en redondo pre-desecado tratado con la preparación (UFC/g) Tiempo Bacterias Levaduras Mohos Coli ácido láctico x x x 6 7 x x x x x x x x x TABLA Resultados microbiológicos del ensilaje de referencia (sin conservantes) (UFC/g) 3 4 Tiempo Bacterias Levaduras Mohos Coli ácido láctico x x x 7 0 x x x x x x x x x x x 4 No se pudieron detectar mohos y levaduras en el ensilaje empaquetado en redondo pre-desecado tratado con la preparación después de la primera semana, visto que el contenido en levaduras en el ensilaje de referencia varió entre 0 y 7.0 UFC/g y el contenido en mohos entre y 1.0 UFC/g durante el tiempo de conservación. La calidad microbiológica del ensilaje tratado con la preparación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 en su totalidad fue superior a la del ensilaje sin conservante. 12

13 ES T3 Ejemplo 12 Utilización de una preparación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 para la inhibición del enmohecimiento de pan agrio La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS se inocularon en una proporción de 1: en un medio de crecimiento basado en suero conteniendo 3 % de permeado de suero, 1 0 % de hidrolizado de caseína, 1 0 % de extracto de levadura y 0 % de citrato sódico. Las cepas se cultivaron durante 3 días a C a ph 4. Se recuperó el caldo de fermentación con células y se añadió tal cuala una masa de pan agrio. El contenido bacteriano de la preparación fue 3 x 9 UCF/mlparaLC-70y4x 9 UFC/ml para JS. La preparación se añadió en una cantidad del %, y la adiciónfuetenidaencuentaenlacantidad de agua en la masa. Se utilizó como pan de referencia, pan agrio de fabricación comercial. El pan se coció en pan tostado; 24 de las barras se almacenaron enteras y 86 barras se rebanaron. Se observó visualmente el enmohecimiento de las barras de pan durante 21 días. Los resultados se muestran en la Tabla 11. TABLA 11 Enmohecimiento de las barras de pan agrio 2 Barras de referencia Barras de ensayo Días enteras rebanadas enteras rebanadas 0/24 0/ 0/24 0/ 6 3/24 0/ 0/24 0/ 3 7 8/24 2/ 0/24 0/ 11/24 / 1/24 2/ 11 /24 / 2/24 1/ 12 /24 3/24 2/ /24 3/24 / 14 16/24 /24 3/ 17 16/24 13/24 / 18 16/24 14/24 4/ 19/24 /24 4/ 21 19/24 /24 29/31 Las barras de referencia se deterioraron mas rápidamente que las barras tratadas con la preparación. El primer moho se detectó en las barras de referencia después de 6 días, y en las barras de ensayo solamente después de días. De todas las barras de referencia, casi el 0 % se deterioraron después de días, visto que el 0 % de las barras tratadas con la preparación se deterioraron solamente después de 17 días. De las barras rebanadas, las barras de referencia se deterioraron considerablemente mas rápidamente. De 13

14 ES T3 los paquetes de barras de referencia que se observaron diariamente, los se deterioraron ya después de días y 11 días, y de ese modo se discontinuó la observación de las barras de referencia. De las barras a las que se había añadido la preparación, los paquetes se deterioraron por primera vez después de 13 días, pero de las barras del día siguiente solamente se deterioraron 3 paquetes. Ejemplo 13 Utilización de una preparación constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 para la inhibición del enmohecimiento de pan de trigo La cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70 y la cepa Propionibacterium shermanii JS se inocularon en una proporción de 1: en un medio de crecimiento basado en suero conteniendo 3 % de permeado de suero, 1 0 % de hidrolizado de caseína, 1 0 % de extracto de levadura y 0 % de citrato sódico. Las cepas se cultivaron durante 3 días a C a ph 4. Se concentró el caldo de fermentación con células y se liofilizó. El contenido bacteriano de la preparación liofilizada fue 2 x 11 UCF/g para LC-70 y JS. La preparación se añadió a la masa en cantidades de 0 1 %, 0 2% y 0 % del volumen total de la masa. Se utilizó como pan de referencia, pan de trigo similar de fabricación comercial. El pan se coció en pan tostado (17 barras). Se observó visualmente el enmohecimiento de las barras de pan durante 9 días. También se evaluó el sabor del pan. Los resultados se muestran en la Tabla TABLA 12 Enmohecimiento de barras de pan de trigo Tiempo Barras enmohecidas/17 barras Barras de ensayo Días (Barras de referencia) 0 1 % 0 2 % 0 % Las barras de referencia se deterioraron mas rápidamente que las barras de trigo tratadas con la preparación. De las barras de trigo tratadas con la preparación, las de 0 2 % de preparación añadida se conservaron mejor. Mas del 0 % de estas barras no se enmohecieron hasta después de 8 días, visto que mas del 0 % de las barras de referencia se enmohecieron después de 6 días. También el contenido total en mohos en las barras de pan tratadas con la preparación fue mas pequeño que en las barras de referencia. La preparación también mejoró el sabor y aroma del pan de trigo. 14

15 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM Una preparación bacteriana, caracterizada por que consta de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei. 3. Una preparación bacteriana como se reivindicó en la reivindicación 2, caracterizada por que consta de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC -70, DSM 7061, como suspensión celular en caldo de fermentación, sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei. 4. Una preparación bacteriana como se reivindicó en la reivindicación 2, caracterizada por que consta de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC -70, DSM 7061, conjuntamente con la Propionibacterium shermanii JS, DSM Una preparación bacteriana como se reivindicó en la reivindicación 2 ó3, caracterizada por que consta de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, conjuntamente con la cepa Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum Una preparación bacteriana como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 2 a, caracterizada por que la suspensión celular está concentrada Una preparación bacteriana como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 2 a, caracterizada por que la suspensión celular está liofilizada. 8. Una preparación bacteriana como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada por que consta adicionalmente de agentes convencionales utilizados para el control de levaduras y mohos, tales como propionato o fenilalanina. 9. La utilización de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC -70, DSM 7061, para controlar el crecimiento de levaduras y mohos. 3. La utilización de una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, para controlar el crecimiento de levaduras y mohos. 11. Un método para controlar el crecimiento de levaduras y mohos, caracterizado por utilizar una preparación bacteriana constando de la cepa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-70, DSM 7061, sola o en combinación con una bacteria del género Propionibacterium u otra cepa de la bacteria Lactobacillus casei. 4 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva.