JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ. TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de. Microbiólogo Industrial

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1 VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbiólogo Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2007

2 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

3 VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO Fernando Murcia, Microbiólogo. Director

4 VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO Fernando Murcia, Microbiólogo. Director María Clara Méndez, Microbióloga Jurado Adriana Páez, Microbióloga Jurado

5 VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO Angela Umaña Muñoz, M. Phil Decana Académica David Gómez Méndez, Msc Director de carrera

6 TABLA DE CONTENIDO Pág. RESUMEN 1 1. INTRODUCCIÓN 2 2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA Generalidades de la validación Validación Validación Primaria Validación secundaria Tipos de validación Validación prospectiva Validación retrospectiva Validación concurrente Revalidación Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método Precisión Selectividad Especificidad Linealidad Exactitud Estabilidad Limite de detección Limite de cuantificación Microorganismos de estudio Bacillus cereus Staphylococcus aureus Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos Toma de muestras Análisis microbiológico de alimentos Recuento y siembra en placa por superficie Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Control en la validación de los métodos 26

7 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos MATERIALES Y METODOS Control de calidad de los medios de cultivo Verificación del control de equipos Control de ambientes Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie Dilución y homogeneización de las muestras Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Evaluación de la validación Informe de resultados RESULTADOS Y DISCUSION Control de calidad de los medios de cultivo Verificación del control de equipos Control de ambientes Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie Ensayos de validación para Bacillus cereus Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 69

8 7. CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS Recursos Electrónicos ANEXOS 90

9 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio 39 Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio 40 Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio 41 Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio 41 Tabla 5. Recuento del control de ambientes 45 Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca 48 Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 50 Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 50 Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 51 Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido 51 Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 53 Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 55 Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 55 Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 56

10 Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 57 Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 59 Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 60 Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 61 Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 62 Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 63 Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 64 Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 67 Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67 Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67 Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida 68 Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1) 70 Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 71 Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda 72

11 Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 73 Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 74 Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 76 Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 77 Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Staphylococcus aureus en leche cruda 78 Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 79 Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 80

12 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba) 40 Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (interferente) 40 Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control) 40 Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba) 41 Figura 5. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (interferente) 42 Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control) 42 Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 48 Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad 49 Figura 9. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus con BBL Crystal 49 Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido 52 Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas 54 Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1 54 Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido 58 Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus realizado por diferentes analistas 59 Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2 60 Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido 63 Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 65 Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de repetibilidad 66

13 Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus 66 Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal 66 Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida 69 Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas 70 Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 1 71 Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida 75 Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas 76 Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 2 77 Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida 81

14 LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC 90 Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo 93 Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos 95 Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos BBL Crystal 111

15 AGRADECIMIENTOS A Biotrends Laboratorios Ltda., por la financiación total del proyecto, en especial a la doctora Maria Clara Méndez y al doctor Fernando Murcia, por su valiosa colaboración; a todo el personal de Biotrends Laboratorios por su ayuda; a la profesora Lorena Valencia por su asesoría y al profesor Miguel Pinzón por su asesoría estadística.

16 A mis padres por todo el apoyo que me han dado siempre. A mis hermanos por su ayuda y tolerancia. A Ana Maria, y a mis amigos, You know who you are.

17 RESUMEN Con el fin de brindar una mayor calidad a los consumidores, las empresas productoras de alimentos deben realizar análisis microbiológicos y fisicoquímicos para determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos puedan ser comercializados. Por esta razón, es necesario que los laboratorios que llevan a cabo dichos análisis se comprometan a realizar los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar resultados altamente confiables, razón por la cual, el laboratorio debe controlar y asegurar la calidad de sus resultados, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros nacionales e internacionales, para así poder garantizar un buen desarrollo del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. En este estudio se llevó a cabo la validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida, debido a que es una de las técnicas más frecuentemente utilizadas en Biotrends Laboratorios Ltda. De esta forma, se obtuvieron resultados que permitieron validar esta técnica y que fueron analizados estadísticamente, entre los cuales se encontró un alto grado de concordancia en los coeficientes de variación de los diferentes ensayos de repetibilidad y reproducibilidad realizados. 1

18 1. INTRODUCCIÓN Las empresas productoras de alimentos deben brindar una mayor calidad a los consumidores, ya que los productos que estas elaboran pueden comprometer la salud de los mismos, razón por la cual es necesario llevar a cabo análisis microbiológicos y caracterización físico química para determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos puedan ser comercializados. Es por esta razón que se ha visto la necesidad de crear laboratorios de análisis de alimentos que lleven a cabo dichos análisis para determinar la calidad de los productos de las empresas o personas que los elaboran, y que además brinden asesoría en los respectivos análisis y en la implementación de un sistema de calidad en estas empresas productoras de alimentos. Estos laboratorios se deben comprometer a realizar los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar resultados altamente confiables, los cuales dependerán del programa que se haya implementado en el laboratorio para garantizar la confiabilidad de los resultados finales emitidos; razón por la cual, el laboratorio, debe controlar y asegurar la calidad de sus resultados, entendiéndose calidad como el grado en el que un conjunto de características inherentes cumplen con los requisitos, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros nacionales e internacionales. Los programas de control interno de un laboratorio incluyen evaluación continua y/o monitoreos de los principales materiales y objetos que se utilizan dentro de los análisis, como medios de cultivo, reactivos, equipos o instrumentos, además de la validación de procedimientos técnicos y del 2

19 personal, también debe incluir manuales de procedimientos y documentación en general, para así poder garantizar un buen desarrollo del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. La validación de una técnica, es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio si las características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos, en la cual se determinarán las posibles variaciones que se presentan entre diferente número de ensayos, para así disminuir las posibilidades de error dentro del método, generando un alto grado de confianza en los resultados finales. Para realizar la validación de un método microbiológico se debe tener en cuenta la evaluación de los medios de cultivo a utilizar para la recuperación de la microflora bacteriana presente en el producto; también se debe llevar a cabo la calibración y verificación de los equipos que se utilizan en este tipo de técnicas, tales como: balanzas, micropipetas, incubadoras, autoclaves, etc. Además de realizar la evaluación de los analistas que efectúan dichos procedimientos a diario, así como el conocimiento de las técnicas que se desarrollan y si se han presentado modificaciones o no de estas dentro del laboratorio, para así poder llevar a cabo un proceso de validación secundaria, en el que se verifique que la técnica que ha sido desarrollada en otra parte se está realizando adecuadamente en el laboratorio. Esta validación de técnicas microbiológicas es de gran importancia, ya que permite emitir resultados confiables que garanticen que el proceso planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados, que conlleven a la toma de decisiones 3

20 adecuadas; además ayuda a la regulación y el cumplimiento de la normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio y como requisito para dar cumplimiento a la norma NTC ISO/IEC Requisitos Generales para la competencia de laboratorios de Prueba y calibración, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación del laboratorio. 4

21 2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA El consumo de algunos alimentos representa un riesgo por la presencia de microorganismos patógenos, de sus toxinas, metabolitos tóxicos o por la de microorganismos capaces de deteriorar la calidad del alimento hasta un estado inaceptable. Por lo tanto, deben tenerse muy en cuenta los tipos de microorganismos presentes en el alimento y su número. Ciertos microorganismos simplemente alteran el producto, algunos pueden causar enfermedades y otros indican la posibilidad de que los alimentos estén contaminados por patógenos. A menudo, el riesgo de enfermedad alimentaria es tanto más elevado, conforme el patógeno va multiplicándose en el alimento y, por tanto, su número aumenta; al contrario el riesgo será menor si el microorganismo se multiplica escasamente en el alimento. En algunos casos el alimento solo actúa como vehiculo de transmisión del organismo infeccioso. La manipulación sufrida por un alimento durante su distribución, almacenamiento y preparación para el consumo puede provocar la disminución, mantenimiento o aumento del número de microorganismos presentes, mientras que las toxinas más lábiles se desactivan y las más resistentes se mantienen (ICMSF, 1999). Es por esto que se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico de los alimentos, que asegure que estos son aptos para el consumo humano y que poseen las condiciones de calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental y así poder ser comercializados. El análisis microbiológico de alimentos permite valorar la carga microbiana que se encuentra en los diferentes productos, por esta razón se debe determinar en la industria cuales son los puntos de riesgo de contaminación o multiplicación microbiana (los puntos críticos del proceso) y evitarlos, siguiendo un código estricto de Buenas Practicas de Manufactura (BPM) y distribución del alimento (Decreto 3075, 1997). 5

22 La calidad del producto puede garantizarse, mediante la identificación y manejo de los diferentes puntos críticos de control que se dan en el proceso, de una correcta manipulación que dependerá de las buenas practicas de manufactura seguidas durante el proceso de producción, de un adecuado proceso de envasado o empaquetado, del transporte y de las características de almacenamiento del producto (Decreto 3075, 1997). Debido a la importancia de garantizar la calidad de los alimentos, es importante la verificación y validación de los procesos o técnicas de evaluación y diagnóstico de la calidad higiénica de estos, que proporcionen la confiabilidad de los productos de consumo, ya que los consumidores exigen cada vez más, atributos de calidad en los productos que adquieren para su consumo (Lightfoot & Maier, 2002). Estos atributos de calidad son los que el laboratorio debe demostrar mediante la implementación de un adecuado análisis microbiológico, en donde se verifiquen los procedimientos que se usan para tal fin, generando así confiabilidad por medio de técnicas reconocidas y validadas que se encuentren contempladas en las especificaciones técnicas propuestas por los entes reguladores, para así poder determinar si un producto es apto para salir o no al mercado, y si se encuentra bajo los más altos estándares de calidad; característica requerida para lograr mayor aceptación por parte del consumidor. El análisis microbiológico entonces, cobra gran importancia al ser un punto álgido en la elaboración y distribución de los alimentos, por esta razón el laboratorio encargado del análisis debe mantener estándares de calidad aceptables en el procesamiento de muestras y en los resultados que emitan sus técnicas para garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos que sus clientes producen y/o distribuyen (ICMSF, 2000). Sin embargo, la exactitud y precisión de los resultados microbiológicos no solo dependen de los métodos utilizados y de la competencia del personal 6

23 del laboratorio, sino también del correcto funcionamiento de los equipos empleados (Lightfoot & Maier, 2002). La garantía de calidad en un laboratorio debe tomarse como un programa para identificar el origen de las variaciones significativas y para minimizar o aminorar sus efectos sobre la fiabilidad de los resultados analíticos. Sus objetivos son: 1. Estandarizar los métodos y prácticas del laboratorio. 2. Lograr que su funcionamiento sea comparable, no solo entre analistas individuales dentro de un mismo laboratorio, sino también entre distintos laboratorios que realizan el mismo tipo de análisis y examinan la misma clase de alimentos. 3. Impedir que informes de laboratorio inexactos o en los que no se pueda confiar sean utilizados para decidir si un producto se ajusta a las especificaciones aplicables a la industria o cumple los requisitos legales (ICMSF, 2000). 2.1 Generalidades de la validación Un adecuado proceso de validación debe desarrollarse dentro del marco de buenas prácticas de manufactura, ya que garantizan la seguridad de los datos obtenidos para poder así juzgar sobre la seguridad de un producto, permitiendo obtener una documentación confiable y segura, además, la validación permite obtener una optimización y estandarización de procesos al disminuir el tiempo muerto, reducir costos y la probabilidad de fallas (Medina & Quintana, 2002). 7

24 2.1.1 Validación Es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003), es decir, para detectar o cuantificar grupos microbianos específicos como es el caso, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Para validar un proceso se deben realizar sistemáticamente los procedimientos de puesta a punto del mismo, mediante el seguimiento de las siguientes fases: Planificación: Se busca establecer programas temporales y listas de verificación, protocolos de la validación con criterios de aceptación/rechazo, necesidades de recursos, análisis de riesgos, etc. (European Commission, 2001). Calificación del diseño: El primer elemento de la validación es la evaluación de nuevas instalaciones, sistemas o equipos. Se deberá demostrar y documentar la adecuación del diseño a las normas de correcta fabricación (European Commission, 2001). Calificación de la instalación: La calificación de la instalación busca establecer por evidencia objetiva que todos los aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de 8

25 sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones aprobadas del fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este. Además de esto, también se incluyen requisitos de calibración y verificación de los materiales de construcción (European Commission, 2001). Calificación del funcionamiento: Esta calificación deberá realizarse tras la calificación de la instalación, y busca establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla con todos los requerimientos predeterminados. Debe incluir: (a) Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre procesos, sistemas y equipos. (b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites máximos y mínimos de trabajo, condiciones denominadas como frecuencia caso más desfavorable. La finalización de forma satisfactoria de la calificación del funcionamiento permitirá terminar los procedimientos de calibración, fabricación y limpieza, la formación del operario y las exigencias de mantenimiento preventivo. Así, permitirá la aprobación formal de las instalaciones, sistemas y equipos (European Commission, 2001). Calificación de desempeño: La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas satisfactoriamente la calificación de la instalación y de funcionamiento. Esta proveerá evidencia documentada, bajo condiciones anticipadas, que 9

26 se produce de manera consistente un producto que cumpla con las especificaciones y el criterio de diseño (European Commission, 2001). La calificación de la ejecución del proceso incluirá, entre otras cosas, lo siguiente: (a) Ensayos, empleando materiales de producción (o componentes sustitutivos calificados y/o simulaciones de productos), que se hayan desarrollado a partir del conocimiento especializado sobre los procesos y las instalaciones, sistemas o equipos. (b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites máximos y mínimos de funcionamiento (European Commission, 2001) Validación primaria La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene como metas establecer los límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés. Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo especialmente diseñados. Los laboratorios que desarrollan un método en casa o una variante de una norma existente deben realizar los pasos de la validación primaria (GTC 84, 2003). 10

27 2.1.3 Validación secundaria La validación secundaria tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en otra parte. Esta validación se centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria. Suele llamarse verificación; y es la confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos (ISO 9000, 2000). Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria (GTC 84, 2003). Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas para así optimizar sus procesos, al mejorar el uso de equipos y de personal de laboratorio y eliminar los tiempos muertos, lo cual genera confiabilidad en los resultados, lo que a su vez implica reducción en los gastos (PDA Suggested Revision, 2000). Así mismo sirve para dar cumplimiento a las normas legales pertinentes o a normas internacionales de calidad, contribuyendo a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de calidad que generen confianza dentro de sus clientes Tipos de validación Validación prospectiva Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Se debe realizar un análisis de riesgos para determinar si podrían conducir a situaciones críticas; se investigan 11

28 posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda. Luego se efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva validación demuestre su carácter satisfactorio (European Commission, 2001) Validación retrospectiva Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la información histórica del proceso para proveer de la evidencia documentada necesaria que el proceso está haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados en este tipo de validación requieren la preparación de un protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos analizados que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones (PDA Suggested Revision, 2000), (WHO, 1997). Este tipo de validación solo es aceptable para procesos bien establecidos y sería inapropiado si recientemente se hubieran realizado cambios en la composición del producto, en los procedimientos de operación o en los equipos (PDA Suggested Revision, 2000), por lo tanto, nunca se debe aplicar a nuevos procesos o productos. Esta validación puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (WHO, 1997). Dentro de la validación retrospectiva es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, especificaciones y métodos analíticos (European Commission, 2001) Validación concurrente Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia documentada que un proceso hace lo que debe hacer basado en 12

29 información generada durante una implementación real del proceso. La validación concurrente es muy utilizada cuando se ha variado alguna etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto o resultado final sea correcto (ISO 14000, 1996). Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo. Sin embargo, cada aproximación tiene sus características y limitaciones y por lo tanto, antes de desarrollar una validación deberá evaluarse qué tipo de validación puede dar la mayor información sobre la seguridad y la estabilidad del proceso (García, 2001) Revalidación Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un sistema o equipo o cambio en instalaciones. La revalidación periódica se presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales (European Commission, 2001). Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del mismo. Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues la revalidación se efectúa para asegurar que los cambios intencionales o no intencionales en los procesos no afecten las características del proceso ni la calidad del producto (European Commission, 2001), (WHO, 1997). 13

30 2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método Son las propiedades, características o capacidades del método que indican su grado de calidad en cuanto a exactitud, exactitud relativa, desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial, repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad, fortaleza y solidez y robustez, entre otras características (OGA-016, 2005) Precisión Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o central, que puede ser expresada en términos de varianza, desviación estándar o coeficiente de variación. La precisión puede ser considerada a tres niveles: repetibilidad, reproducibilidad y solidez y robustez (OGA-016, 2005). - Repetibilidad Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones sucesivas por el mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo instrumento y condiciones de medición (precisión dentro del ensayo). Por mediciones sucesivas se entiende aquellas mediciones repetidas dentro de un corto periodo de tiempo (OGA-016, 2005), (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). - Reproducibilidad Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo analito realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración válida de reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las condiciones del análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el principio en que se basa la medición, el método, analista/observador e 14

31 instrumento, material y patrones de referencia, ubicación, condiciones de uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente en términos de los parámetros de dispersión de los resultados (desviación estándar, varianza, coeficiente de variación) (OGA-016, 2005). La reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Lightfoot & Maier, 2002). - Solidez y robustez Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones deliberadas en parámetros del método. Examina el efecto que las condiciones operacionales y del medio ambiente tienen sobre los resultados del análisis (diferentes temperaturas y porcentaje de humedad, analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos de diferentes marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se vea afectado por estas variaciones deliberadas (OGA-016, 2005) Selectividad Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos los analitos de interés (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992) Especificidad Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se espera estén presentes en la matriz de la muestra (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). La especificidad se puede estudiar agregando a la muestra algunas sustancias que se sospecha que reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y comparar 15

32 estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (OGA-016, 2005) Linealidad Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito, dentro de un intervalo determinado (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992) Exactitud Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor verdadero convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado (OGA-016, 2005). Se conoce también como error sistemático o sesgo Estabilidad La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa calculada en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo, no excede el 20% del valor correspondiente de la precisión del sistema (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992) Límite de detección Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005) Límite de cuantificación Corresponde a la concentración mínima del analito que puede ser cuantificada con una exactitud y precisión aceptable en una muestra bajo condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005). 16

33 2.2 Microorganismos de estudio El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias patógenas resultaría poco práctico para la mayoría de las industrias. Es por esto que se ha convertido en práctica corriente investigar en los alimentos la presencia de grupos indicadores que determinen la posibilidad de la existencia de microorganismos causantes de intoxicaciones o de otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993). Entre los microorganismos que se usan como indicadores se encuentran las bacterias mesófilas esporuladas, de las cuales hace parte Bacillus cereus, que revelan un tratamiento térmico insuficiente de los alimentos enlatados o de un almacenamiento prolongado sin refrigeración de los alimentos cocinados, tales como la carne y el arroz. También se puede mencionar como indicador a Staphylococcus aureus, cuya presencia en los alimentos se interpreta como indicativo de contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los manipuladores de alimentos, ya que el material y equipo sucios y las materias primas de origen animal pueden ser también la fuente de la contaminación (ICMSF, 2000) Bacillus cereus Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, móvil, esporoformador, aerobio. Común en el suelo, en los vegetales, en los alimentos crudos y procesados. Puede producir intoxicación alimentaria generalmente de curso leve, que no suele durar más de horas (ICMSF, 2000). Bacillus cereus causa dos tipos diferentes de intoxicación por alimentos: el tipo diarreico y el tipo emético (Sarrías et al., 2002). El tipo diarreico de intoxicación alimentaria es causado por las enterotoxinas producidas durante el crecimiento vegetativo de B. cereus en el intestino delgado, y los alimentos asociados más frecuentemente a este tipo de enfermedad son los postres, carnes y los productos lácteos; mientras que la toxina 17

34 emética, que causa vómito, es producida por las células que crecen en el alimento. El arroz es el vehículo de intoxicación más común por este tipo de toxina. Para ambos tipos de intoxicaciones, los alimentos implicados usualmente han sido calentados, y las esporas sobrevivientes han sido la fuente de la enfermedad. Carlin et al. (2006), evaluaron los riesgos de la producción de la toxina emética en ciertos tipos de alimentos, encontrando que la poca habilidad de crecer a bajas temperaturas demuestra que las cepas de B. cereus productoras de la toxina emética representan un bajo riesgo en alimentos refrigerados. Por el contrario, la notable resistencia de sus esporas a altas temperaturas favorece su crecimiento en alimentos calentados cuando estos son dejados a temperatura ambiente por más de 2 horas. Las esporas de B. cereus son un factor importante en las enfermedades transmitidas por alimentos, ya que estas son mas hidrofóbicas que otras esporas de Bacillus spp., lo cual permite que estas se adhieran a varios tipos de superficies. De aquí que sean difíciles de remover de equipos durante la limpieza, pues estas poseen apéndices y/o pilis que están, en menor parte, involucrados en la adhesión. Estas propiedades de adherencia no solo permiten que las esporas resistan los procedimientos normales de saneamiento, y así contaminar los alimentos durante el procesamiento, sino que ayudan a que se unan a las células epiteliales (Doyle, 1997). B. cereus no es un microorganismo competitivo, pero crece bien después de cocinar el alimento y dejarlo enfriar (< 48 C). El tratamiento con calor causa la germinación de las esporas y, en ausencia de flora competitiva, B. cereus crece óptimamente (Doyle, 1997). B. cereus es un microorganismo común del suelo y se propaga fácilmente a muchos tipos de alimentos, especialmente los de origen vegetal, pero también es aislado normalmente de carne, huevos, leche cruda y productos lácteos debido a procesos de contaminación cruzada. Estos últimos, además del 18

35 arroz y las especias, están entre los alimentos que más frecuentemente se contaminan con B. cereus. Bacillus cereus produce intoxicaciones alimentarias solamente cuando el alimento ingerido contiene números muy elevados de células, generalmente superiores a 10 7 UFC/g o ml. Por ello, el recuento de B. cereus es el factor decisivo a la hora de evaluar el significado de este microorganismo en los alimentos (ICMSF, 2000). Sin embargo, las enfermedades causadas por B. cereus no son muy reportadas, pues ambos casos de intoxicaciones son relativamente poco agresivas y usualmente duran menos de 24 horas (Doyle, 1997) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, inmóvil que forma agrupaciones irregulares de células usualmente parecidas a los racimos de uvas. Son anaerobios facultativos, pero crecen mejor en presencia de aire, siendo su temperatura óptima de crecimiento los 37 C, pero desarrollándose hasta los 10 C o ligeramente menos (Hayes, 1993). La intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome caracterizado por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y debilidad general. Los síntomas comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después de consumido el alimento (ICMSF, 2000). S. aureus ha sido ampliamente caracterizado, ya que se sabe que este microorganismo produce una gran variedad de productos extracelulares. Muchos de ellos, como las enterotoxinas estafilococales (SE en inglés), son factores virulentos que han estado implicados en enfermedades de humanos y animales. Estas enterotoxinas elaboran un juego de propiedades biológicas que causan al menos dos enfermedades humanas comunes, síndrome de shock tóxico (TSS en inglés) e intoxicaciones 19

36 debidas a Staphylococcus en alimentos (Doyle, 1997). Si en un alimento asociado a un brote es identificado S. aureus, también se debe estudiar la producción de enterotoxinas, lo cual incrementa la complejidad del ensayo, ya que es usual que S. aureus produzca una o más toxinas simultáneamente. Comúnmente, las SE han sido divididas en cinco grandes clases serológicas (SE A, SE B, SE C, SE D, SE E) debido a sus propiedades antigénicas, pero en los últimos años se han identificado nueve clases más (SE G hasta SE O). Siendo la SE A la enterotoxina más comúnmente recuperada de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos (Aznar et al., 2005). Las intoxicaciones debidas a Staphylococcus en alimentos están clasificadas como unas de las causas más prevalentes de gastroenteritis en el mundo. Esto se debe a la ingestión de una o más enterotoxinas estafilocócicas preformadas en alimentos contaminados por miembros del género Staphylococcus, en donde predomina Staphylococcus aureus (Doyle, 1997). La principal fuente de contaminación de los alimentos por Staphylococcus se debe a la manipulación de estos por parte de personas contaminadas, ya que los humanos son el principal reservorio de este microorganismo. Si bien muchas especies del género Staphylococcus se consideran habitantes normales del cuerpo humano, S. aureus es el patógeno más destacado. En los humanos, las fosas nasales son los sitios de colonización predominantes, aunque se pueden encontrar células de S. aureus en diferentes sitios de la piel. La diseminación de S. aureus entre humanos y de los humanos a los alimentos puede ocurrir por contacto directo o indirectamente por fragmentos de piel (Doyle, 1997). Algunas propiedades únicas de resistencia de S. aureus facilitan la contaminación y crecimiento en alimentos. Afuera del cuerpo humano, 20

37 S. aureus es uno de los patógenos humanos no esporoformador más resistente, pues puede sobrevivir por extensos periodos de tiempo. Es por esto que para algunos alimentos procesados o tratados, S. aureus es un buen indicador del grado de contacto humano, o con alimentos naturales no tratados de origen animal dentro de la fábrica de alimentos (ICMSF, 2000). Por tal razón, se debe realizar la búsqueda de S. aureus; pues su presencia indica insuficiencia en los tratamientos con calor como pasteurización de la leche o cocción de la carne y en el uso de agentes químicos sanitizantes que generalmente destruyen a este microorganismo (Ingham & Schoeller, 2001). Los factores que originan las enfermedades transmitidas por alimentos debido a la contaminación de estos por S. aureus son: a) Refrigeración inadecuada. b) Poca higiene personal (no lavar las manos o los instrumentos apropiadamente o no usar tapabocas). c) Cocción o calentamiento inadecuados de los alimentos. d) Uso prolongado de platos para calentar cuando se sirven los alimentos, una práctica que promueve el crecimiento del microorganismo y la producción de enterotoxinas (Doyle, 1997). 2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos Toma de muestras La calidad del informe final emitido por un laboratorio dependerá directamente de la calidad de la muestra recogida y analizada. Los análisis se solicitan para obtener una respuesta a una demanda específica, por lo que deben ser realizados sobre muestras recogidas de forma correcta y aplicando las técnicas más adecuadas para obtener resultados representativos. Para cumplir este objetivo se debe seguir un 21

38 adecuado plan de toma de muestras (Lightfoot & Maier, 2002). Los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento (Romero, 2005). El factor más importante en el análisis es el muestreo, el cual incluye: a) evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por los microorganismos presentes en las diferentes partes de la superficie (canales, máquinas, platos, etc.); b) determinación del modo óptimo de remoción del microorganismo de la muestra o lugar de muestro y c) eliminación del riesgo de la contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestras (Romero, 2005). En cuanto al transporte de muestras, es importante evitar que durante el tiempo que este va a durar se produzca una multiplicación de los microorganismos presentes o por el contrario, inactivación de algún microorganismo (Romero, 2005). Para conseguir este objetivo, la muestra debe ser protegida de los rayos ultravioletas, luz visible y las altas temperaturas. Esto se consigue utilizando recipientes isotérmicos refrigerados con bolsas de hielo o cualquier otro sistema adecuado (Lightfoot & Maier, 2002). En el momento de tomar las muestras es muy importante evitar sesgos y propensiones, y obtener un número suficiente de unidades de muestra para poder confiar en el juicio derivado de su análisis. El muestreo aleatorio es el método más reconocido para evitar subjetividades y proporciona mejores resultados que intentar recoger, de forma consciente, unidades de muestra de varias partes de un lote. Aunque no hay garantía de que la muestra elegida con los números aleatorios tenga las mismas características que el lote, es más probable que las tenga, que si las muestras no se hubieran tomado aleatoriamente (ICMSF, 1999). 22

39 2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos El análisis microbiológico en la industria de alimentos, se constituye en una herramienta básica para el control de materias primas, procesos, productos y manipuladores, ya que permite establecer el grado de contaminación biológica de estos, por esta razón el control microbiológico es parte fundamental de todo el proceso (Carrascal, et al., 2003). Los principales objetivos del análisis microbiológico son: - Asegurar que el alimento cumpla con las normas estatutarias. - Que se ajuste a normas internas establecidas por la empresa que los procesa y a las que exige el comprador. - Que las materias alimenticias que llegan a la fábrica para ser procesadas cumplan las normas exigidas y las pactadas con el productor. - Que se mantenga el control del proceso y la higiene de la línea de fabricación (Hayes, 1993). Los métodos de examen microbiológico utilizados para controlar la calidad del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran parte del alimento que va a ser analizado (Soler, 2006). Para el análisis microbiológico se debe tomar un peso conocido del alimento (10 o 25 g). El alimento se debe adicionar en un diluyente como agua peptonada al 0.1%. El tratamiento implica una homogenización mecánica o en el Stomacher. El volumen de diluyente utilizado generalmente es nueve veces mayor que la muestra; para 25 g se utilizan 225 ml de diluyente de forma que se obtenga un homogeneizado de dilución 10-1, a partir de la cual se preparan las correspondientes diluciones seriadas en base 10, dependiendo de la calidad microbiológica del producto objeto de análisis (Hayes, 1993). 23

40 2.4 Recuento y siembra en placa por superficie Cada tipo de recuento de microorganismos viables es potencialmente útil para fines específicos. Los recuentos de bacterias viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas de agar que han sido previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Tales recuentos se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos totales en placa, cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias que pueden crecer en las condiciones ambientales elegidas; pues se pueden cambiar las condiciones ambientales, las de incubación, la composición del medio de cultivo (añadiendo inhibidores selectivos al medio o agentes con actividad de superficie o colorantes) favoreciendo así el crecimiento de unos u otros microorganismos (ICMSF, 1999) Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus -Sembrar por triplicado 0.1 ml de muestra líquida o 0.1 ml de dilución madre a placas de Agar Bacillus cereus. -Extender con un asa estéril sobre el agar. -Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales. -Tapar y dejar absorber durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. -Incubar a 35 C ± 2 C durante 18 h 24 h (+ 24 horas si es necesario). Recuento: Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado) (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002). 24