identificación de especies del género Atriplex

Transcripción

1 Primer Encuentro de Investigación Vincúlate Generación de marcadores moleculares para la identificación de especies del género Atriplex Dra. Adriana Bastías Docente Universidad Autónoma de Chile

2 Introducción Atriplex es un género que posee alrededor de 300 especies a nivel mundial En Chile, crecen 21 especies de Atriplex nativas diferentes, principalmente en zonas áridas del norte. Características Alta generación de biomasa Crece en suelo degradado, con alta salinidad y baja humedad Usadas en fitorremediación Sirve como forraje animal y refugio de vida silvestre

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4 SSRs-microsatélites: Marcadores moleculares Fragmentos de ADN formado por unidades repetitivas de secuencia simple. Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 pares de bases y su grado de repetición es relativamente bajo. Mononucleótido Dinucleótido Trinucleótido Tetranucleótido El mayor inconveniente de los microsatélites es que hay que caracterizar y aislarlos para cada especie. Se utilizan en análisis de paternidad en animales y plantas.

5 El Campo Experimental Las Cardas está ubicado en la IV Región, provincia de Elqui, comuna de Coquimbo, aproximadamente a 37 km al sur de La Serena. Muestreo Atriplex sp.: 25 procedencias de los 5 continentes

6 Flujo general para el desarrollo de marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR). DNAg Secuenciación de última generación (Illumina)

7 DNA templado Fragmentación Etiquetado Amplificación Secuenciación

8 Flujo general para el desarrollo de marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR). DNAg Secuenciación de última generación (Illumina) Control de calidad/limpieza (FastQC v0.11.5/prinseq v0.20.4) Ensamblaje de novo (Soapdenovo)

9 Tabla 1. Resultados de la secuenciación mediante plataforma Illumina Antes de la limpieza Después de la limpieza Muestra Lecturas Totales GC(%) Lecturas Totales GC(%) % Lecturas totales Atriplex deserticola Atriplex atacamensis a) A. desertícola b) A. atacamensis FastQC v0.11.5/prinseq v0.20.4

10 Tabla 2. Medidas de contigs. Las lecturas con alta calidad fueron ensambladas con el programa SOAPdenovo2. A. deserticola A. atacamensis Contigs N Count >= N Max contig: Min contig: Total length: Promedio contig: Mb y 338 Mb fue la cobertura de los genomas de A. desertícola y atacamensis, respectivamente Bastías et al., en preparación

11 Flujo general para el desarrollo de marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR). DNAg Secuenciación de última generación (Illumina) Control de calidad/limpieza Ensamblaje de novo (Soapdenovo) Descubrimiento de SSR (MISA) Elección de SSR y diseño partidores Validación de SSRs polimórficos Marcador SSR

12 Tabla 3. Resultados de los microsatélites (SSRs) investigados de Atriplex deserticola y Atriplex atacamensis. Categoría A. deserticola A. atacamensis Número total de secuencias examinadas Tamaño total de secuencias examinadas (bp) Número total de SSRs identificados Número de secuencias que contienen SSR Número de secuencias que contienen más de 1 SSR Programa MIcroSAtellite (Thiel et al.,2003)

13 Los microsatélites más comunes son tri y tetranucleótidos para ambas A. deserticola y A. atacamensis. Frequency (%) Mononucleótido Dinucleótido Trinucleótido Tetranucleótido Mono Di Tri Tetra Penta Hexa Hepta Octa Bastías et al., en preparación

14 Comparación de SSRs entre A. atacamensis y A. deserticola 5849 SSRs altamente transferibles SSRs SSRs 5254 SSRs altamente transferibles A. atacamensis A. deserticola e-pcr software ( Bastías et al., en preparación

15 A. atacamensis A. deserticola 5849 SSRs altamente transferibles 5254 SSRs altamente transferibles SSRs A. deserticola A. undulata A. clivicola A. nummularia A. amnicola A. atacamensis Bastías et al., en preparación A. glauca A. rhagodiades A. lentiformis A. canescens A. cinerea Chile Europa Australia EEUU

16 1.-Preparación muestras Termociclador 2.-Amplificación de fragmentos 3.-Separación de fragmentos por electroforesis capilar Patrón de amplificación parcial para el marcador M37

17 100 SSRs 75 SSRs A. imbricata A. paludosa Análisis en proceso A. semibaccata A. repanda A. vesicaria A. halimus A. acathocarpa Chile Europa Australia EEUU

18 Predicción de genes con programa Augustus Especie Genes totales Completos Parciales A. deserticola A. atacamensis Bastías et al., en preparación

19 Análisis por ontología de genes

20 Conclusiones Se identificaron y marcadores moleculares del tipo SSR para A. desertícola y A. atacamensis, respectivamente, utilizando secuenciación masiva (plataforma Illumina). Se determinaron mediante análisis de secuencia, más de SSRs transferibles entre ambas especies de Atriplex. De 100 marcadores SSR seleccionados, un 75% muestra una alta transferibilidad entre 11 especies distintas de Atriplex cuyo origen es diverso (Australia, Africa, América del Norte, Europa y Latinoámerica) En desarrollo se encuentra el análisis de la diversidad genética presente en la Estación Experimental Las Cardas (UCH, IV región). Los marcadores moleculares identificados en este estudio son una herramienta útil para la identificación, estudios de población y manejo de germoplasma de Atriplex sp.

21 UCH INIA-Rayentué Claudia Torres Francisco Correa José Elias Alarcón Manuel Paneque Boris Sagredo Gracias. Fondecyt de Iniciación N

22 Figure 3. Distribution with respect to the motif repeats of di to octo-nucleotide microsatellites based on the assembled genomic sequences of Atriplex deserticola and Atriplex atacamensis.

23 Tabla 5. Resumen de las frecuencias de A. deserticola y A. atacamensis con diferentes números de repeticiones en tandem. Largo del SSRs de mayor tamaño Más frecuentes motivo A. deserticola A. atacamensis A. deserticola A. atacamensis Mono (A)89 (A)89 A/T A/T Di (CT)35 (AG)36 AT/AT AT/AT Tri (AAT)29 (TTA)29 AAT/ATT AAT/ATT Tetra (TTTA)14 (TAAA)13 AAAT/ATTT AAAT/ATTT Penta (AAAAT)8 (TAAAT)10 AACTG/AGTTC AAAAT/ATTTT Hexa (TAAAAA)8 (TTTATT)8 AAAAAT/ATTTTT AAAAAT/ATTTTT Hepta (AAACCCT)12 (CTAAACC)12 AAATAAT/ATTATTT AAACCCT/AGGGTTT Octa (GTCAATGT)5 (GAGAAGA)6 AAAAAAAT/ATTTTTTT AAAAAAAG/CTTTTTTT