ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE CATINONAS SINTÉTICAS EN CONDUCTORES ESPAÑOLES TITULO DEL PROYECTO

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4 TITULO DEL PROYECTO EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE NUEVAS CATINONAS SINTÉTICAS EN MEDIANTE ANÁLISIS DE MUESTRAS DE FLUIDO ORAL POR LC- MS/MS INTRODUCCIÓN Los sistemas de detección empleados para determinar el consumo de drogas en los conductores españoles mediante análisis de saliva, e implantados en los controles en carretera a partir de diciembre de 2010, solo permiten la identificación de las drogas de abuso tradicionales, incluyendo opiáceos, cocaína, anfetamina y derivados, y cannabis. Sin embargo, en los últimos años se ha detectado la comercialización y consumo de nuevas drogas de diseño, cuya expansión se debe fundamentalmente a la falta de regularización (al menos, al inicio de su comercialización), la facilidad de adquisición a través de internet o en grow/smart shops, y la dificultad en su detección (1,2,3). Son las denominadas "DROGAS EMERGENTES", que constituyen un amplio grupo de sustancias, de rápida expansión en el mercado de las drogas recreativas. Una característica también común a la mayoría de estas sustancias es la ausencia de datos relativos a los riesgos que su consumo comporta para la salud humana. La mayoría de los estudios disponibles sobre las mismas hacen referencia a su obtención química y, sólo ocasionalmente, tratan sobre los efectos que producen en células y tejidos animales. Además, la escasa evidencia sobre sus efectos en humanos procede, mayoritariamente, de las experiencias de autoconsumo que, a través de testimonios por escrito o mediante vídeos, aportan los propios consumidores en determinados foros de Internet o en páginas web, carentes, en todo caso, de rigor científico. Aunque es escasa la información sobre la prevalencia de consumo en España, lo que, sin duda, dificulta el establecimiento de políticas de prevención adecuadas a la realidad del problema, el último informe del Observatorio Español sobre Drogas (4) ya incluye datos de su uso entre la población general (Figura 1). Tampoco existen hasta el momento datos sobre su presencia real en muestras biológicas, que permitan confirmar los datos relativos a la prevalencia de consumo en nuestro país. La mayor parte de la bibliografía publicada sobre su determinación en medios biológicos, además de ser muy reciente, refleja la situación del consumo en países de nuestro entorno, y sobre todo en USA (5,6,7).

5 En el amplio grupo de las drogas emergentes han adquirido un importante protagonismo los derivados de la catinona, compuesto natural extraído de la planta Khat (Catha edulis), cuyo uso recreacional se debe a sus efectos estimulantes, euforizantes y entactógenos, similares a los producidos por anfetaminas y derivados. De hecho, estas dos familias de sustancias comparten una importante similitud estructural, tal y como puede observarse en la Figura 2. Desde el año 1999, nuestro grupo ha venido centrando sus esfuerzos en el desarrollo de una metodología analítica para la detección, confirmación y cuantificación de drogas de abuso en saliva, culminando este trabajo con la publicación de una metodología, completamente validada de acuerdo con los protocolos estándares, que permite la detección de 27 drogas y fármacos en muestras reales de fluido oral (8), pero que no incluye drogas emergentes. Con este nuevo proyecto hemos ampliado el abanico de sustancias que somos capaces de detectar y cuantificar, desarrollando y validando el primer método para determinación de catinonas sintéticas en saliva. Figura 1. Prevalencia de consumo de drogas emergentes (PNSD 2011)

6 Anfetamina Metanfetamina MDMA MDA MDEA Catinona Fluorometanfetamina Fluorometcatinona Mefedrona Mecedrona Metilona MDPV Figura 2. Estructura de catinona, anfetamina, y principales derivados de ambos compuestos.

7 OBJETIVOS A. Desarrollar y validar un método analítico, empleando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS), para la identificación y cuantificación de catinonas sintéticas (Mefedrona, Metilendioxipyrovalerona (MDPV), Mecedrona, Metilona, Fluorometanfetamina y Fluorometcatinona) en fluido oral. En el método se incluirán además las 2 piperazinas sintéticas con mayor prevalencia dentro de las drogas emergentes, mcpp y trifluorometilpiperazina (TFMPP). B. Estudiar la presencia de estas nuevas drogas de diseño entre los conductores españoles. Para ello se reanalizarán muestras de fluido oral, enviadas previamente al laboratorio de toxicología para la confirmación de un resultado positivo a pie de carretera para alguna de las sustancias identificadas en la actualidad (opiáceos, cocaína, anfetamina y derivados, y/o cannabis). C. Evaluar la posibilidad de que los falsos positivos a anfetamina o metanfetamina con el dispositivo empleado en la carretera sea originado por la presencia de alguna de estas drogas emergentes en las muestras de fluido oral.

8 DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 1. DESARROLLO DEL MÉTODO 1.1. Condiciones del LC-MS/MS La separación cromatográfica se realizó empleando una columna analítica de fase reversa Atlantis T3 (150 x 2.1 mm, 3.5 µm), que se mantuvo a una temperatura de 35ºC, utilizando como fase móvil ácido fórmico 0.1% en agua y acetonitrilo a un flujo de 0.3 ml/min, con el gradiente que se muestra en la Tabla 1. La Tabla 2 muestra el método de masas empleado en la detección Extracción de las muestras de fluido oral Se realizó una extracción en fase sólida empleando cartuchos de fase reversa Strata X, aplicando el siguiente protocolo: acondicionamiento de los cartuchos con 2 ml de metanol y 2 ml de agua; carga de la muestra (0.5 ml) acondicionada con tampón borato ph 9 (2 ml); lavado de los cartuchos con 2 ml de agua con 5% metanol y 2 ml de agua:metanol:hidróxido amónico (70:29.5:0.5); elución con 3 ml de 2-isopropanol:diclorometano (25:75). Las muestras se evaporan con N2 en un baño a 35ºC, y se reconstituyen en 75 µl de ácido fórmico 0.1%: acetonitrilo (90:10) para su inyección en el LC-MS/MS. A B Figura 3. Cromatograma de los compuestos incluidos en la metodología en una muestra de fluido oral blanco (A), y en una muestra fortificada a 0.6 ng/ml (B).

9 2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO El método se ha validado de acuerdo con las normas propuestas por organismos internacionales y autores de reconocido prestigio en la materia (9-11) Selectividad Se evaluó mediante el estudio de posibles interferencias endógenas y exógenas. Las interferencias endógenas se evaluaron mediante el análisis de 10 muestras blanco de fluido oral de distinta procedencia a las que simplemente se les añadió el patrón interno. No se encontró ninguna señal para las transiciones seleccionadas para cada analito a su tiempo de retención. Las interferencias exógenas se evaluaron mediante el análisis de muestras blanco de fluido oral fortificadas con 43 drogas de abuso y fármacos comunes (a 500 ng/ml), incluyendo morfina, codeína, 6-acetilmorfina, metadona, 2-ethylidene-1,5- dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EDDP), anfetamina, metanfetamina, 3,4- metilendioxianfetamina (MDA), 3,4-metilendioxianfetamina (MDMA), 3,4- metilendioxietilanfetamina (MDEA), THC, THC-COOH, cannabinol, cannabidiol, OH-THC, cocaine, benzoilecgonina, ecgoninametilester, cocaetileno, dietilamina del ácido lisérgico (LSD), ketamina, norketamina, ácido hidroxibutírico (GHB), nicotina, cotinina, fentanilo, amitriptilina, paroxetina, zolpidem, zopiclona, ibuprofeno, omeprazol, paracetamol, diclofenaco, naproxeno, alprazolam, temazepam, lormetazepam, lorazepam, flunitrazepam, 7-aminoflunitrazepam, clonazepam, diazepam, nordiazepam, oxazepam, triazolam, nitrazepam y bromazepam. No se encontró ninguna señal para las transiciones seleccionadas para cada analito a su tiempo de retención Límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) El LOD se define como la concentración más baja a la que se pueden detectar las 2 transiciones MRM monitorizadas con una señal/ruido >3 y adecuada razón de iones, y con un tiempo de retención ± 0.2 min con respecto a la media de los calibradores. Se calculó de forma experimental mediante el análisis de muestras de fluido oral a concentraciones decrecientes. El LOQ es la concentración más baja que puede ser cuantificada de forma precisa (% coeficiente de variación, %CV <20%) y exacta (% concentración nominal ±20%) en 5 replicados de muestras de fluido oral fortificadas a esta concentración. Los LODs estuvieron en el rango de

10 0.025 a 0.1 ng/ml, y los LOQs entre 0.2 y 0.5 ng/ml, dependiendo del compuesto (Tabla 3) Linealidad La linealidad se estudió mediante al análisis de 5 rectas de calibrado elaboradas con 8 o 9 calibradores (0.2 o 0.5 a 200 ng/ml), en 4 días diferentes. Se considera que la linealidad es aceptable cuando el coeficiente de determinación (r 2 ) es >0.99 y las residuales son <15%, excepto para el LOQ, para el que se permiten residuales <20%. La Tabla 3 muestra los parámetros de calibración para cada compuesto Precisión y exactitud Ambos parámetros se evaluaron a concentración baja, media y alta (0.6, 20 y 150 ng/ml), dentro del rango de linealidad, mediante el análisis de 5 replicados a cada concentración durante cuatro días diferentes (n=20). La imprecisión se determinó mediante el cálculo del %CV siguiendo las recomendaciones de Krouwer y Rabinowtz (12), y debe ser <15%. La exactitud se expresó como el porcentaje de la concentración nominal, y debe estar comprendida entre el %. La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos para la precisión y la exactitud Recuperación La recuperación del Quantisal y de la extracción, y el efecto matriz originado con y sin tampón del Quantisal se evaluaron a concentración baja y alta (0.6 y 150 ng/ml). Para determinar la recuperación del Quantisal se comparó el área media del compuesto al añadir directamente 1 ml de fluido oral al tampón del Quantisal (sin algodón) (n=5) con la media del área del compuesto al recoger 1 ml ± 10% de fluido oral con el algodón (aparición de la coloración azul), e incorporarlo en el tampón del Quantisal (n=5). Todas las muestras se guardaron en nevera 24 h antes de su análisis para simular las condiciones reales. La recuperación de la extracción se calculó comparando el área media del analito en muestras de fluido oral fortificadas antes (n=5) y después de su extracción (n=5). La Tabla 5 muestra los resultados de estos experimentos Efecto matriz El efecto matriz se evaluó comparando el área media del analito en muestras blanco de fluido oral (n=10, de diferente procedencia) fortificadas después de su extracción, con el área media obtenida cuando los compuestos se prepararon en ácido fórmico 0.1%:acetonitrilo (90:10). El efecto matriz originado por la mezcla de

11 fluido oral + tampón del Quantisal se evaluó comparando el área media del compuesto en 2 ml de mezcla fluido oral + tampón (0.5 ml fluido oral ml tampón) fortificado después de la extracción, con el área media obtenida cuando los compuestos se prepararon en ácido fórmico 0.1%:acetonitrilo (90:10). La Tabla 6 muestra los resultados de estos experimentos Estabilidad La estabilidad de los compuestos se estudió a concentración baja y alta (0.6 y 150 ng/ml) en distintas condiciones: muestra procesada en el inyector durante 72 h, muestras almacenados en nevera (4ºC) durante 24 h, y tras someter las muestras a 3 ciclos de congelado/descongelado. La estabilidad se determinó calculando el %pérdida en las muestras sometidas a las condiciones citadas anteriormente con respecto a la obtenida en muestras fortificadas y extraídas en el momento del análisis (Tabla 7). Tabla 1. Gradiente cromatográfico empleado en la separación de los compuestos en estudio. Tiempo (minutos) Ácido fórmico 0.1% (%) Acetonitrilo (%)

12 Tabla 2. Transiciones MRM, voltage de cono (VC), energía de colisión (EC), tiempo de retención (Rt) y patrones internos (P.I.) para cada analito en estudio. Analito Transición MRM Metilona 208.4>160.2 VC EC (ev) Rt (min) P.I. (V) Metilona-d > Metilona-d > Metanfetamina-d > Mecedrona 194.4> Metanfetamina-d >161.2 FMAMP 168.3> >137.2 FMCAT 182.3> >149.2 Mefedrona 178.3> Mefedrona-d Metilona-d Mefedrona-d > Mefedrona-d > mcpp 197.3> mcpp-d > mcpp-d > MDPV 276.3> mcpp-d >175.2 TFMPP 231.3> TFMPP-d > TFMPP-d > Las transiciones subrayadas se emplearon en la cuantificación. FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3-clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3-trifluorometilfenil)piperazina

13 Tabla 3. Límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ), y parámetros de calibración para cada compuesto. Analito LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) Linealidad (ng/ml) Origen ± SD (n=4) Pendiente (x) ± SD Pendiente (x 2 ) ± SD r 2 ± SD (n=4) (n=4) (n=4) Metilona ± ± ± Mecedrona ± ± ± FMAMP ± ± ± ± FMCAT ± ± ± Mefedrona ± ± ± mcpp ± ± ± MDPV ± ± ± TFMPP ± ± ± FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3-clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3-trifluorometilfenil)piperazina Tabla 4. Imprecisión y exactitud a concentración baja (0.6 ng/ml), media (20 ng/ml) y alta (150 ng/ml). Analito Imprecisión intra-día (n=20; %CV) Imprecisión inter-día (n=20; %CV) Imprecision total (n=20; %CV) Exactitud (n=20; %CV) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 150 ng/ml 0.6 ng/ml 20 ng/ml 150 ng/ml 0.6 ng/ml 20 ng/ml 150 ng/ml 0.6 ng/ml 20 ng/ml 150 ng/ml Metilona Mecedrona FMAMP FMCAT Mefedrona mcpp MDPV TFMPP FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3-clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4- metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3-trifluorometilfenil)piperazina

14 Tabla 5. Recuperación de la extracción y del dispositivo de recolección Quantisal a concentración baja y alta (0.6 y 150 ng/ml). Analito Recuperación de la extracción, n=5 (%CV) Recuperación del Quantisal, n=5 (%CV) 0.6 ng/ml 150 ng/ml 0.6 ng/ml 150 ng/ml Metilona (8.3) (4.0) (4.0) 88.1 (2.9) Metilona-d (7.7) (4.1) (4.1) 85.5 (2.6) Metanfetamina-d (6.6) (5.0) (5.0) 85.7 (1.4) Mecedrona (5.6) 98.6 (3.9) 98.6 (3.9) 93.4 (5.7) FMAMP 98.7 (7.6) (4.7) (4.7) 88.9 (2.2) FMCAT (8.3) (5.3) (5.3) 86.7 (2.5) Mefedrona 87.1 (7.9) (4.9) (4.9) 87.3 (2.3) Mefedrona-d (6.3) (4.4) (4.4) 84.7 (2.6) mcpp (6.4) 98.0 (5.7) 98.0 (5.7) 84.1 (1.6) mcpp-d (4.6) 99.6 (3.7) 99.6 (3.7) 81.1 (1.9) MDPV (2.4) 93.1 (8.3) 93.1 (8.3) 82.8 (2.4) TFMPP (8.3) 88.8 (5.8) 88.8 (5.8) 79.6 (1.7) TFMPP-d (5.9) 91.0 (5.6) 91.0 (5.6) 76.5 (2.2) FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3- clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3- trifluorometilfenil)piperazina Tabla 6. Efecto matriz en fluido oral y en la mezcla fluido oral + tampón del Quantisal a concentración baja y alta (0.6 y 150 ng/ml). Analito Efecto matriz en fluido oral, n=10 (%CV) Efecto matriz en la mezcla fluido oral + Quantisal, n=5 (%CV) 0.6 ng/ml 150 ng/ml 0.6 ng/ml 150 ng/ml Metilona (10.5) (8.6) 17.4 (8.6) -0.3 (7.3) Metilona-d (6.8) (7.9) 23.5 (8.6) 6.2 (5.4) Metanfetamina-d (10.8) (10.5) (6.8) 84.1 (3.9) Mecedrona (8.5) (10.0) 29.3 (6.4) 24.8 (15.0) FMAMP (17.1) (11.1) 89.9 (7.5) 62.2 (3.7) FMCAT (11.6) (9.1) 83.0 (9.2) 81.0 (3.3) Mefedrona (13.0) (10.0) (8.0) 75.3 (3.4) Mefedrona-d (8.2) (9.2) (7.4) 84.0 (4.0) mcpp -6.1 (10.8) (5.8) (14.1) (6.7) mcpp-d8-6.8 (8.7) -9.2 (5.2) (6.9) (6.1) MDPV -7.7 (15.7) -1.1 (11.4) (9.2) (10.4) TFMPP 31.9 (12.8) 13.9 (12.5) (16.2) (10.9) TFMPP-d (10.7) 6.7 (11.6) (7.3) (11.5) FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3-clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3-trifluorometilfenil)piperazina

15 Tabla 7. Estabilidad a concentración baja (0.6 ng/ml) y alta (150 ng/ml) tras someter la muestra a diferentes condiciones: inyector durante 72 h (muestra procesada), 4ºC durante 24 h, 3 ciclos congelado/descongelado. Analito Concentración Inyector 72h 4ºC for 24 h Tres ciclos congelado/descongelado Metilona 0.6 ng/ml ng/ml Mecedrona 0.6 ng/ml ng/ml Fluorometanfetamina 0.6 ng/ml ng/ml Fluorometcatinona 0.6 ng/ml ng/ml Mefedrona 0.6 ng/ml ng/ml mcpp 0.6 ng/ml ng/ml MDPV 0.6 ng/ml ng/ml TFMPP 0.6 ng/ml ng/ml FMAMP: Fluorometanfetamina; FMCAT: Fluorometcatinona; mcpp: 1-(3-clorofenil)piperazina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; TFMPP: 3-trifluorometilfenil)piperazina

16 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE ESTAS NUEVAS DROGAS DE DISEÑO EN LAS MUESTRAS DE SALIVA DE CASOS REALES Tras su completa validación, el método se aplicó a muestras fluido oral tomadas DURANTE LOS AÑOS 2012 Y 2013 a conductores para confirmar un resultado positivo a opiáceos, cocaína, anfetamina, metanfetamina y/o cannabis con el dispositivo de carretera. Estas muestras fueron recogidas con el dispositivo Quantisal para su traslado al laboratorio. Se analizaron un total de 281 muestras clasificadas según los siguientes criterios: 113 muestras que habían dado un resultado POSITIVO con el dispositivo onsite DRAGER 5000, a anfetamina y/o metanfetamina, pero que no fue confirmado en el laboratorio (FALSOS POSITIVOS). 84 muestras con resultado en carretera POSITIVO al menos a anfetamina y/o metanfetamina, y confirmado en el laboratorio (VERDADEROS POSITIVOS). 12 muestras NEGATIVAS a anfetamina y/o metanfetamina en carretera, pero POSITIVAS en el laboratorio (FALSOS NEGATIVOS). 72 muestras NEGATIVAS a anfetamina y/o metanfetamina, en carretera y en laboratorio (VERDADEROS NEGATIVOS), pero positivas a alguna de las restantes drogas detectadas con el dispositivo de carretera. Las Tablas 8, 9, 10 y 11 reflejan los resultados del análisis de las muestras de fluido oral de casos reales, reanalizadas con el método analítico descrito en el presente documento. A B Figura 4. Cromatogramas de las 2 transiciones monitorizadas para metilona y su deuterado-d3 (A) y mcpp y su deuterado-d8 (B) en 2 muestras positivas positivas a estos compuestos (caso 694 y 464, respectivamente).

17 Tabla 8. Re-análisis de muestras con resultado positivo en carretera a anfetamina y/o metanfetamina, no confirmado en el laboratorio (falso positivo). Resultados obtenidos para catinonas y piperazinas en el laboratorio. Caso Anfetamina (on-site) Metanfetamina (on-site) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas COC, THC THC THC COC, THC COC, THC COC, THC THC, BZD THC COC, THC COC, THC OPI, MTD, THC, BZD COC, THC THC THC THC COC THC COC, THC, BZD THC COC, MTD THC COC, MTD, THC THC COC, THC THC THC THC THC COC, THC OPI, COC OPI, MTD, TH THC OPI, COC, THC OPI, COC, THC THC OPI, COC, MTD, THC 38 + inválido - COC, THC OPI, COC, MTD, BZD OPI, COC, MTD, THC, BZD OPI, COC, MTD, THC, BZD OPI, COC, MTD COC, THC MTD COC, MTD OPI COC, THC OPI, COC, MTD, THC COC, THC THC THC COC, THC COC, THC THC OPI, COC, MTD COC OPI, COC, THC OPI, COC, MTD, THC OPI, COC, MTD, THC, BZD THC THC

18 Tabla 8. (Continuación). Caso Anfetamina (on-site) Metanfetamina (on-site) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas THC THC 63 inválido + - THC THC THC COC, THC COC, THC THC COC, THC COC, THC THC THC COC OPI THC THC THC THC COC, THC COC, MTD, THC OPI, COC, THC OPI, COC, BZD OPI, COC, MTD OPI, COC Metilona= 1577,6 COC, THC OPI, COC, MTD, BZD OPI, COC, MTD THC COC, THC COC, THC COC, MTD + (confirmado) + - ANF, COC THC COC, MTD, BZD THC THC COC, THC OPI, COC OPI, COC COC, THC COC, THC, KETA

19 Tabla 9. Re-análisis de muestras con resultado en carretera positivo al menos a anfetamina y/o metanfetamina, y confirmado en el laboratorio (verdaderos positivos). Resultados obtenidos para catinonas y piperazinas en el laboratorio. Caso Anfetamina (LC-MSMS) Metanfetamina (LC-MSMS) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas MDPV= 63 COC, THC Metilona= 9,8 TFMP= 10,2 COC, THC THC mcpp= 89,8 COC, THC COC, THC THC Metilona= 8581,4 COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC THC COC, THC MDPV= 12,8 COC, THC COC, THC COC, THC THC COC, THC Mefedrona= 8, THC COC COC COC, THC COC, THC COC THC COC, THC COC, THC THC COC, THC COC, THC Mefedrona= 0,8 COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC THC COC, THC COC, THC COC THC COC, THC COC COC, THC COC, THC COC, THC OPI, COC COC, THC THC COC, THC

20 Tabla 9. (Continuación). Caso Anfetamina (LC-MSMS) Metanfetamina (LC-MSMS) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas COC, THC THC COC, THC THC COC, THC THC COC THC mcpp= 2, COC, THC COC, THC mcpp= 12,4 COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC Mefedrona= 4,2 COC, THC COC THC THC COC, THC COC, THC THC THC COC THC THC Tabla 10. Re-análisis de muestras con resultado en carretera negativo a anfetamina y/o metanfetamina, pero positivo en el laboratorio (falso negativo). Resultados obtenidos para catinonas y piperazinas en el laboratorio. Caso Anfetamina (LC-MSMS) Metanfetamina (LC-MSMS) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas THC THC COC, THC COC, THC COC, THC COC, THC THC COC, THC COC, THC THC OPI, THC

21 Tabla 11. Re-análisis de muestras con resultado negativo a anfetamina y/o metanfetamina (en carretera y en el laboratorio). Resultados obtenidos para catinonas y piperazinas en el laboratorio. Caso Catinonas/piperazinas Otras sustancias confirmadas (LC-MSMS) THC COC, THC COC THC THC THC BZD COC, THC COC, THC THC COC, THC THC THC THC COC, THC COC, THC COC, THC THC COC, THC THC THC THC COC, THC THC THC THC THC COC, THC COC, THC THC THC COC, THC COC, THC THC THC OPI, COC, THC COC, THC THC THC COC, THC THC THC COC, THC COC, THC THC COC, THC COC, BZD THC THC THC COC, THC THC THC THC COC, THC COC COC, THC

22 Tabla 11. (Continuación). Caso Catinonas/piperazinas Otras sustancias confirmadas (LC-MSMS) COC, THC THC THC THC COC THC COC, THC THC, BZD THC THC COC, THC THC THC THC COC

23 DISCUSION Y CONCLUSIONES La metodología descrita en este informe permite la determinación simultánea de las catinonas y piperazinas sintéticas más frecuentemente detectadas en nuestro entorno y otros países, incluyendo mefedrona, metilendioxipyrovalerona (MDPV), mecedrona, metilona, fluorometanfetamina, fluorometcatinona, mcpp, TFMPP (13-17). El método analítico ha sido validado siguiendo las directrices de las principales guías de validación, obteniendo resultados satisfactorios para todos los parámetros estudiados. El método se aplicó al análisis de 281 muestras de fluido oral recogidas en 2012 (muestras 1-56) y 2013 (muestras ), y enviadas al Servicio de Toxicología del Instituto de Ciencias Forenses Luis Concheiro (Universidad de Santiago de Compostela) para confirmar un resultado positivo en carretera a algunas de las drogas identificadas actualmente con los dispositivos on-site. Entre las muestras analizadas se incluyeron muestras que habían dado un falso positivo en carretera a anfetamina y/o metanfetamina (40.2%). En un estudio previo realizado en nuestro laboratorio en colaboración con Dräger Safety (Lübeck, Alemania) para evaluar la posible reacción cruzada de catinonas con el Dräger DrugTest 5000, observamos la obtención de un resultado positivo para metanfetamina en muestras de fluido oral fortificadas con cualquiera de las catinonas estudiadas, con concentraciones cut-off entre y 100 µg/ml en función del compuesto; por ello, el presente estudio podría permitir la atribución de falsos positivos a metanfetamina a la presencia de alguna de estas nuevas drogas. Además, es frecuente la venta de pastillas que supuestamente contienen anfetamina, MDMA o MDA, pero que realmente incluyen catinonas sintéticas (18). Se analizaron también muestras en las que se confirmó la presencia de anfetamina y/o metanfetamina (con resultado positivo o negativo en carretera) (34.2%) a fin de evaluar la posible combinación de ambos tipos de sustancias, ya que en ciertos foros de usuarios se discute esta posibilidad. Finalmente, se analizaron muestras que dieron un resultado negativo a anfetaminas y/o derivados en carretera y en el laboratorio (25.6%). De las muestras analizadas, 11 (3.9%) resultaron positivas a algunas de las catinonas o piperazinas sintéticas incluidas en la metodología (Tabla 12), resultado similar al obtenido recientemente por Caudevilla-Gálligo et al. (18) en material enviado al servicio de análisis de la ONG Energy Control por los usuarios del producto. Las catinonas/piperazinas identificadas fueron metilona (3 casos), mefedrona (3 casos), MDPV (2 casos), mcpp (3 casos) y TFMPP (1 caso). En la mayoría de los casos solo se identificó una de estas drogas, excepto en la muestra 116, en la se detectó una combinación de metilona y TFMPP. Todas las muestras,

24 excepto la 88, fueron verdaderos positivos a anfetamina y/o derivados, lo que indica la frecuente combinación de estos grupos de drogas. Para la muestra 88 se obtuvo un falso positivo a metanfetamina con el dispositivo de carretera que, como se mostró en el estudio de reacción cruzada, pudo ser debido a la presencia de metilona en alta concentración ( ng/ml) en esta muestra. En el 75% de los casos también se identificó el consumo simultáneo de cocaína y cannabis (THC), reflejando la frecuencia del policonsumo. Los resultados contenidos en este informe y en publicaciones previas (18) ponen de manifiesto la presencia de estas nuevas drogas recreativas actualmente en nuestro país. Por tanto, es fundamental disponer de las herramientas analíticas necesarias para identificar el consumo de estas sustancias entre la población general, así como en conductores, a fin de establecer las políticas adecuadas de prevención y control del consumo de estas nuevas drogas recreacionales. Tabla 12. Muestras con resultado positivo a catinonas o piperazinas. Caso Grupo Anfetamina/metanfetamina (on-site* o LC-MS/MS) Catinonas/piperazinas (LC-MSMS) Otras sustancias confirmadas 88 FP -/+* Metilona= 1577,6 COC, THC 114 VP +/+ MDPV= 63 COC, THC 116 VP +/+ Metilona= 9,8 TFMP= 10,2 COC, THC 118 VP +/+ mcpp= 89,8 COC, THC 121 VP +/+ Metilona= 8581,4 COC, THC 131 VP +/+ MDPV= 12,8 COC, THC 137 VP +/+ Mefedrona= 8,8-151 VP +/+ Mefedrona= 0,8 COC, THC 179 VP +/+ mcpp= 2,2-182 VP +/+ mcpp= 12,4 COC, THC 187 VP -/+* Mefedrona= 4,2 COC, THC FP: falso positivo a anfetamina y/o metanfetamina; VP: verdadero positivo a anfetamina y/o metanfetamina CONCLUSIONES El método LC-MS/MS para la determinación de las principales catinonas y piperazinas sintéticas descrito en el presente trabajo ha sido satisfactoriamente validado de acuerdo con las principales guías de validación. La aplicación del método a muestras de fluido oral de conductores en vías españolas nos ha permitido confirmar la importante presencia de estas nuevas drogas recreacionales en nuestro entorno y, más aún, el consumo de las mismas en conductores, frecuentemente asociado a otras drogas de abuso. Los resultados ponen en evidencia la necesidad de incluir estas nuevas sustancias en las metodologías de análisis de carretera y/o laboratorio.

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27 EQUIPO INVESTIGADOR LOPEZ-RIVADULLA LAMAS, MANUEL Catedrático de Toxicología CRUZ LANDEIRA, ANGELINES DE CASTRO RIOS, ANA LENDOIRO BELIO, ELENA BLANCO TURNES, SALVADOR REY LÓPEZ, PABLO Catedrática de Toxicología Dra./Investigadora Torres Quevedo Lcda/Predoctoral Xunta de Galicia Técnico laboratorio Técnico laboratorio

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