BOLETÍN EPIDEMIOLÓGICO DE CASTILLA-LA MANCHA FEBRERO 2006/ Vol.18 /Nº 06

BOLETÍN EPIDEMIOLÓGICO DE CASTILLA-LA MANCHA FEBRERO 2006/ Vol.18 /Nº 06 Resumen BROTES DE NOROVIRUS POR AGUA DE BEBIDA (I)* Como parte de un programa intensivo de monitorización de brotes de enfermedad transmitida por alimentos, en Finlandia, se investigaron brotes de virus transmitidos por agua. Los procedimientos diagnósticos incluyeron el análisis de muestras de heces de pacientes por microscopía electrónica y por transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), para norovirus y astrovirus. Cuando los resultados de estas pruebas fueron positivos para un virus, se analizó la muestra de agua. La concentración del virus se basó en filtros cargados positivamente para muestras de 1 L. Del total de los 41 brotes por agua notificados durante el período de observación (1998-2003), se dispuso de muestras para análisis en 28 de ellos. A juzgar por los resultados de la RT-PCR en muestras de pacientes, un norovirus causó 18 de los brotes. En diez de ellos, también se encontraron norovirus en las muestras de agua. En todos menos uno, la secuencia amplificada fue idéntica a la obtenida de pacientes. La ubicuidad de los brotes de norovirus transmitidos por agua llama a tomar medidas de monitorización de virus en el agua. Introducción El agua puede ser una fuente de brotes de enfermedad (1). La contaminación tiene lugar, casi exclusivamente, por aguas residuales que contienen patógenos entéricos; los enterovirus que afectan a humanos son sobre todo de especies específicas. Su abundancia puede ser explicada por las altas concentraciones en heces de pacientes. Los norovirus (anteriormente llamados virus análogos al Norwalk), causan gastroenteritis en todos los grupos de edad. Ya que los norovirus, a diferencia de los enterovirus, no crecen fácilmente en cultivos celulares, su papel se hizo evidente a partir de los noventa, cuando empezaron a estar disponibles métodos específicos de diagnóstico. Solo en años recientes, se ha conocido la gran variedad genómica del norovirus (2). Un reciente informe (3), lista 5 genogrupos y 22 clusters genéticos, que incluyen la mayoría de los humanos pero también virus porcinos y murinos. Además de numerosos brotes comunitarios en los que se piensa que la transmisión tuvo lugar de persona a persona, los brotes causados por alimentos contaminados han sido frecuentes (4). El papel dominante del norovirus en brotes de transmisión alimentaria e hídrica, ha sido estimado por Mead y col. (5). Algunos brotes por agua han sido detectados sobre la base de la evidencia epidemiológica (6,7), en 1997 se notificó por primera vez la aparición de un norovirus en agua (8). Los procedimientos diagnósticos basados en el genoma, como la transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), ofrecen herramientas sensibles y específicas para identificar estos virus. La identificación basada en la secuencia es efectiva para el rastreo de fuentes en brotes, especialmente en aquellos causados por norovirus, los cuales muestran una alta variabilidad en la secuencia de nucleótidos, incluso dentro de la corta amplificación producida en la región de la polimerasa del virus (9). Los brotes de virus transmitidos por el agua son, frecuentemente, difíciles de reconocer. La enfermedad causada por norovirus es común, y si el nivel de contaminación es bajo, el número de casos permanece bajo. Usualmente, es necesario un brote extenso para que personal sanitario y autoridades reconozcan el agua como una posible fuente de infección (10). Este trabajo incluye análisis virológicos de brotes finlandeses de transmisión hídrica, durante un período de seis años. Se describe un procedimiento mejorado para la identificación del agua como fuente en brotes virales. SERVICIO DE EPIDEMIOLOGÍA/DIRECCIÓN GENERAL DE SALUD PÚBLICA Y PARTICIPACIÓN. 34

Métodos La notificación de brotes alimentarios e hídricos en Finlandia fue reorganizada e intensificada en 1997; se estableció, mediante nuevas regulaciones, que toda sospecha de casos debía ser notificada inmediatamente al Instituto Nacional de Salud Pública (KTL). Se emitieron recomendaciones para la correcta recogida de muestras, medioambientales y de pacientes. Fueron clarificadas las funciones de los equipos locales de investigación de brotes y se incluyó un entrenamiento en la realización de estudios epidemiológicos. El rendimiento de laboratorio fue mejorado mediante la inclusión de medios diagnósticos para virus y protozoos, en muestras de ambientales y de pacientes. Todos los casos en los cuales el agua fue sospechosa como fuente del brote, fueron notificados al KTL. Las recomendaciones de recogida de muestras incluían 3-10 muestras de heces de pacientes. Se recogieron inmediatamente muestras de agua, antes de tratar y, cuando fue necesario, agua del grifo de distintos puntos de la red de distribución. A pesar de las recomendaciones, no todos los brotes fueron investigados para virus. Los criterios para el establecimiento de un brote como hídrico, se tomaron de la clasificación inglesa (grados A-D) (11). En total, fueron analizadas para virus 271 muestras de pacientes de 25 brotes. El rango de muestras fecales obtenidas en cada brote fue de 2-69 (media, 11). Para la extracción de ARN se usó una suspensión fecal al 10% en 0,05 mol/l Tris-HCl, 0,1 mol/l NaCl, 1 mmol/l CaCl 2, ph 7,4. En total, fueron analizadas 73 muestras de agua de 27 brotes; muestras de agua de 1-2 L, recogidas en botellas limpias de cristal o plástico, se concentraron según describe Gilgen y col. (12). Las muestras de 1 L se pasaron por un filtro de disco de membrana cargado positivamente (diámetro 47mm, tamaño del poro 45 µm; AMF-cuno, Zetapor, Meriden, CO, USA), con o sin prefiltro de fibra de vidrio. Después de la elusión in 50 mmol/l de buffer glicina, ph 9,5, conteniendo un 1% de extracto bovino, el eluato fue neutralizado rápidamente con HCl. El volumen fue además reducido a 100 µl con un micro concentrador (Centricon-100, Amicon, Beverly, MA, USA). Esta muestra se usó para la extracción de ARN y para la PCR, como está descrito (10). La extracción de ARN y la RT-PCR para la región de la polimerasa del norovirus se ejecutaron como está descrito (13). Brevemente, el ARN fue extractado usando fenol- y tiocianato de guanidina- conteniendo reactivo Tripure (Roche, Indianápolis, IN, UASA) y precipitado con etanol. El ARN viral fue transcrito a cadn y la amplificación de ADN fue ejecutada en tubos separados, para norovirus de genogrupos I y II (GI y GII), mediante PCR manual, con cebadores Nvp110 (14) y N69 (15), y Nvp110 y NI (16), respectivamente. A partir del año 2002, los cebadores avanzados para genogrupos fueron modificados como KA1 (5 -GANGGCCTSCCMTCWGGNTT-3 ) y KA2 (5 -TGGAATTCNATHGCCCAYTGG-3 ). Las amplificaciones fueron visualizadas por electroforesis en un gel de agarosa, hibridadas con un panel de sonda, y usadas para la secuenciación de nucleótidos. La secuenciación fue realizada manualmente (kit de secuenciación de ADN versión 2.0, Sequenase,USB, Cleveland, USA), como está descrito (13). Los análisis de secuencias fueron ejecutados por programas SeqApp and ClustalW. Nuestras secuencias fueron alineadas con secuencias de nucleótidos de norovirus de las bases de datos EMBL/ GenBank: Southampton/91/UK (L07418), Norwalk/68/US (M87661), Malta (AJ277616), Melksham/94/UK (X81879), Hawaii/76/US (U07611), Lordsdale/93/UK (X86557), GIIb AY7732101), GIId (AF312728), y norovirus murino AY228235). Para secuencias de nucleótidos Hillingdon/94/UK y Grimsby/95/UK, ver Vinje y col. (17); la secuencia de Lord Harris viene de la base de datos de secuencias de la red Europea (9,18). Los números de acceso a las secuencias de nucleotides de GenBank de este studio son AY958213 9 para norovirus GI y AY958204 12 para norovirus GII. Resultados Descripción de brotes y hallazgos virales Se notificaron en total 41 brotes hídricos, en Finlandia, entre 1998 y 2003 (3-11 por año). De éstos, 28 (61%) fueron investigados para virus. En 24 brotes se dispuso de muestras de agua y de pacientes, para ser analizadas; en 3 brotes sólo se dispuso de muestras de agua y en 1 brote, sólo de muestras de pacientes. No se obtuvieron muestras para análisis virales en los restantes 13 brotes. El análisis se realizó mediante RT- PCR. Las muestras de pacientes también fueron investigadas por microscopía electrónica para otros virus entéricos y analizadas por RT-PCR para astrovirus. Para las muestras de agua, se estableció un método de concentración de acuerdo con Gilgen y col. (12), empezando por un volumen de 1 L. En la mayoría de los casos las muestras de agua fueron analizadas sólo para norovirus. Los virus que causaron la mayoría de los brotes hídricos 35

fueron noruvirus (18 brotes). El rotavirus causó 1 brote y en 9 brotes no se pudieron encontrar virus. Los resultados bacterianos se publican aparte. Los 18 brotes de transmisión hídrica por norovirus, se resumen en la tabla 1. Cada año, excepto en 2001, ocurrieron en Finlandia algunos brotes por norovirus. Durante el período de estudio fueron detectadas seis grandes epidemias con, al menos, 200 casos. En las epidemias mayores, más de 10.000 personas estuvieron expuestas y ocurrieron 2000-5.500 casos; además, 7 brotes de tamaño mediano (40-100 casos) y 5 pequeños (< 20 casos), fueron causados por norovirus. La mayoría de las contaminaciones por norovirus ocurrieron en los sistemas subterráneos de aguas, usados comúnmente en Finlandia. En tres casos fueron usadas aguas superficiales, de lago o de río. De los brotes por aguas subterráneas, 8 ocurrieron por sistemas públicos comunitarios y 7 por aguas de pozos privados. La distribución geográfica de los brotes se muestra en la figura 1. Ocurrieron por todo el país, desde los archipiélagos del sur hasta las partes más extremas del norte de Finlandia. El riesgo estacional para brotes hídricos por norovirus parece mantenerse aproximadamente igual (figura 2). La mitad de las epidemias hídricas (20 de 41) ocurrieron en verano y los brotes de norovirus (11 de 15) fueron más comunes de final del invierno a primavera (febrero-mayo). De hecho, la mayoría de los brotes de invierno fueron causados por norovirus, mientras que en verano fueron causados principalmente por bacterias. Tabla 1. Norovirus identificados en brotes. Finlandia, 1998-2003 Brote Fechas Nº Fuente de agua enfermos expuestos/nº E1, comunitario* Agua de superficie usada como agua de grifo E2, comunitario E3, casa de campo de alquiler E4, campamento en isla E5, comunitario E6, área industrial E7, comunitario E8, spa E9, comunitario* E10 casa privada E11, comunitario E12, granja para huéspedes E13, comunitario E14, casa de huéspedes E15, comunitario E16, casa de alquiler E17, campamento vacaciones E18, comunitario Pozo Pozo comunitario Agua suabterranea Pozo Pozo (perforado) Pozo (excavado) Agua de lago usada para baber Pozo (perforado Pozo Agua de superficie (río), tubería rota Análisis detallado de los norovirus Los norovirus de 16 brotes (E1-E16) fueron además caracterizados por análisis de secuencia de las amplificaciones, de los que fue también deducido el genotipo (tabla 2). Aparecieron norovirus en muestras de pacientes de los 16 brotes y en muestras de agua de 10 de ellos. También se encontraron coliformes en 9, mientras que en 7 brotes no se observó contaminación microbiológica. La mayoría (11 brotes), fueron causados por un solo linaje/genotipo de norovirus. En los brotes grandes se encontró, con más frecuencia que en los pequeños, más de un virus. El norovirus GII fue un poco más frecuente que el GI (7 vs. 5 brotes). En los 10 brotes con muestras de agua positivas, se detectó el mismo número de genotipos GI y GII. En todos menos uno, el mismo genotipo de norovirus encontrado en las muestras de agua apareció también en muestras de pacientes. La única excepción fue el brote E11, en el cual se detectaron en la muestra de agua dos secuencias de norovirus, GII.1 y GII.4, pero sólo el tipo GII.4 fue detectado en muestras de pacientes. No solo el genotipo viral, sino también la secuencia amplificada fueron idénticas in cada brote (figura 3). Se encontraron dos norovirus genogrupo I, tipos GI.3 (Birmingham) y GI.6 (Sindlesham, Hesse); una secuencia GI (brote E3) quedó sin determinar. 36

En los brotes por GII, se encontraron al menos 4 genotipos diferentes en muestras de agua o de pacientes. El genotipo más común fue GII.4 (Bristol, Lordsdale), encontrado en muestras de agua de 4 brotes; se trata de una nueva variante de tipo desde el 2003 (20). Los genotipos ya establecidos GII.1 (Hawaii) y GII.5 (Hillingdon) se detectaron también en algunos brotes, junto con algunos genotipos potencialmente nuevos o secuencias que no encajaron bien en ninguno de los genotipos establecidos, tal como el GIId (Upinniemi) y GIIb. Como muestra la figura 3, en la mayoría de los brotes fue detectado un virus con una única secuencia amplificada, incluso cuando pertenecía al mismo genotipo que otros virus en otros brotes. El norovirus genotipo GII.4 fue la única excepción y una secuencia larga de nucleótidos hubiera mostrado algunas diferencias genéticas (detectadas entre las secuencias de los brotes E1 y E11; no se muestran los datos). Tabla 1. Resultados de la identificación de norovirus en brotes. Finlandia, 1998-2003 Brote Fecha Resultados microbiológicos (genotipo)* coliformes Presencia de Pacientes E1, comunitario* E2, comunitario E3, casa de campo de alquiler E4, campamento en isla E5, comunitario E6, área industrial E7, comunitario E8, spa E9, comunitario* E10 casa privada E11, comunitario E12, granja para huéspedes E13, comunitario E14, casa de huéspedes E15, comunitario E16, casa de alquiler *nv, nueva variante Figura 1. Mapa de Finlandia. Distribución de los brotes de norovirus transmitidos por agua, 1998-2003 Figura 2. Distribución mensual de brotes transmitidos por agua, incluidos los brotes de norovirus. Finlandia, 1998-2003 37

*EMERGIN INFECTIOUS DISEASES VOL 11, Nº 11, NOV 2005 (www.cdc.gov/eid) Leena Maunula,* Ilkka T. Miettinen, and Carl-Henrik von Bonsdorff* *HUCH Laboratory Diagnostics, Helsinki, Finland; University of Helsinki, Helsinki, Finland; and National Public Health Institute, Kuopio, Finland COMENTARIOS EPIDEMIOLÓGICOS SEMANALES (Semana 06, del 5 de febrero al 11 de febrero de 2006) BROTES EPIDÉMICOS: Durante la presente semana se han declarado un brotes de TIA en Albacete (Albacete), y un brote de Fiebre urliana en Cebolla (Toledo). ENFERMEDADES DE DECLARACIÓN INDIVIDUALIZADA Y URGENTE: Durante esta semana no se han notificado ningún caso de enfermedad meningocócica. 38

TABLA I.- CASOS NOTIFICADOS DE CIERTAS ENFERMEDADES TRANSMISIBLES. CASTILLA-LA MANCHA. AÑO=2006 ENFERMEDAD CIE-OMS 9ª-Rev. SEMANA = 06 MEDIANA CASOS SEMANALES CASOS ACUMULADOS SEMANAL ACUMULADA 2006 2005 2006 2005 2001-05 2001-05 F.TIFOIDEA Y PARATIFOIDEA 002 0 0 0 0 0 0 DISENTERÍA BACILAR 004 0 0 1 0 0 0 GRIPE 487 611 3676 4056 73630 3676 19043 TUBERCULOSIS RESPIRATORIA 011-012 4 2 19 17 3 16 SARAMPIÓN 055 0 0 0 0 0 5 RUBEOLA 056 1 0 1 0 0 0 VARICELA 052 250 216 1124 1321 159 836 CARBUNCO 022 0 0 0 1 0 0 BRUCELOSIS 023 1 0 4 4 0 4 HIDATIDOSIS 122 2 0 2 3 0 2 F.EXNT. MEDITERRÁNEA 082.1 0 1 0 2 0 1 SÍFILIS 091 0 1 3 3 0 3 INFECCIÓN GONOCÓCICA 098.0-098.1; 098.4-098.8 0 0 3 2 0 1 ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA 036 0 1 6 4 1 4 PAROTIDITIS 072 0 0 7 7 1 7 TOSFERINA 033 0 0 0 0 0 0 HEPATITIS A 070.0-070.1 2 1 20 1 1 5 HEPATITIS B 070.2-070.3 0 1 3 5 1 4 HEPATITIS VIR. OTRAS 070.4-070.9 0 1 3 5 1 4 LEGIONELOSIS 482.8 0 0 2 2 0 0 MENINGITIS TUBERCULOSA 013.0 0 1 1 1 0 0 OTRAS TUBERCULOSIS NEUMONÍA 013.1-013.9; 014-018 480-486, (excluidas 482.2 y 482.8) 0 0 2 1 0 1 11 41 181 332 - - ENFERMEDAD TABLA II.- CASOS NOTIFICADOS DE ENFERMEDADES DE BAJA INCIDENCIA. CASTILLA-LA MANCHA CIE-OMS 9ª-Rev. CASOS ACUMULADOS ENFERMEDAD CIE-OMS 9ª-Rev. CASOS ACUMULADOS DIFTERIA 032 0 FIEBRE AMARILLA 060 0 LEPRA 030 0 PESTE 020 0 PALUDISMO 084 0 TIFUS EXANTEMÁTICO 080 0 POLIOMIELITIS 045 0 BOTULISMO 005.1 0 RABIA 071 0 RUBEOLA CONGÉNITA 771.0 0 TÉTANOS 037 0 SÍFILIS CONGÉNITA 090 0 TRIQUINOSIS 124 0 TÉTANOS NEONATAL 771.3 0 CÓLERA 001 0 ENF.INVASIVA POR HIb 038.4;041.5; 320.0; 464.0; 482.2 0 39

TABLA III.- CASOS NOTIFICADOS DE CIERTAS ENFERMEDADES TRANSMISIBLES. DISTRIBUCIÓN PROVINCIAL. AÑO=2006 ENFERMEDAD SEMANA = 06 ALBACETE CIUDAD REAL CUENCA GUADALAJARA TOLEDO SEMANA ACUM. SEMANA ACUM. SEMANA ACUM. SEMANA ACUM. SEMANA ACUM. F.TIFOIDEA Y PARATIFOIDEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 DISENTERÍA BACILAR 0 0 0 1 0 0 0 41 0 0 GRIPE 91 471 160 1005 43 337 17 146 299 2096 TUBERCULOSIS RESPIRATORIA 1 4 2 4 0 1 0 0 1 10 SARAMPIÓN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 RUBEOLA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 VARICELA 54 286 54 276 22 64 42 119 72 373 CARBUNCO 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BRUCELOSIS 0 0 0 2 0 0 0 0 1 2 HIDATIDOSIS 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 F.EXNT. MEDITERRÁNEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 SÍFILIS 0 2 0 1 0 0 0 0 0 0 INFECCIÓN GONOCÓCICA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA 0 0 0 1 0 3 0 0 0 2 PAROTIDITIS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 TOSFERINA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 HEPATITIS A 14 0 1 0 0 0 0 0 1 4 HEPATITIS B 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 HEPATITIS VIR. OTRAS 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 LEGIONELOSIS 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 MENINGITIS TUBERCULOSA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 OTRAS TUBERCULOSIS 0 1 0 1 0 2 0 0 0 0 NEUMONÍA 3 24 5 78 0 10 0 4 3 65 TABLA IV.- EVALUACIÓN DEL ABSENTISMO EN LA DECLARACIÓN. AÑO=2006 SEMANA=06 PROVINCIA MUNICIPIOS SIN DECLARACIÓN HABITANTES SIN DECLARACIÓN SEMANA ACUMULADO SEMANA ACUMULADO NÚMERO (%) NÚMERO (%) NÚMERO (%) NÚMERO (%) ALBACETE 8 8,3 51 8,9 6889 1,9 40040 1,9 CIUDAD REAL 11 9,3 89 12,6 15246 3,2 102913 3,6 CUENCA 33 13,4 204 13,8 16395 8,3 98324 8,3 GUADALAJARA 12 4,0 101 5,6 1301 0,8 164538 17,4 TOLEDO 20 9,5 136 10,8 21333 4,1 188389 6,1 CASTILLA-LA MANCHA 84 8,7 1581 10,0 61164 3,6 594204 5,8 40