Foresta Veracruzana ISSN: Recursos Genéticos Forestales México

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1 Foresta Veracruzana ISSN: Recursos Genéticos Forestales México Nieto R., José Enrique; Ramos G., Luis; Motte D., Emmerik Extracción y purificación de ADN de tectona grandis L. para su empleo en la técnica RAPD Foresta Veracruzana, vol. 7, núm. 2, 2005, pp. 1-6 Recursos Genéticos Forestales Xalapa, México Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 Foresta Veracruzana 7(2): EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN DE Tectona grandis L. PARA SU EMPLEO EN LA TÉCNICA RAPD Resumen José Enrique Nieto R. 1, Luis Ramos G. 2 y Emmerik Motte D. 3 La presente investigación estuvo orientada a determinar el protocolo idóneo para la extracción y purificación de ADN de Tectona grandis L. también conocida como teca. De igual manera empleando el ADN obtenido se determinaron y estandarizaron las condiciones idóneas para el desarrollo de la técnica RAPD lo que a futuro inmediato permitirá su empleo en diferentes estudios tales como: diagnóstico, diversidad y mejora genética. De los tres protocolos evaluados para extracción de ADN (Dellaporta et al.,1983; Uyemoto et al., 1997 and Doyle & Doyle, 1987) el que reporto los mejores resultados fue el propuesto por Uyemoto, al cual se le hicieron modificaciones para la especie en estudio. En el análisis RAPD se reportaron buenos resultados debido a que con las condiciones empleadas en la técnica se obtuvieron varios productos amplificados (entre 4 y 8 bandas) y de un nivel alto de polimorfismo. Finalmente se concluye que el protocolo de extracción y purificación de ADN de teca a partir de hojas fue eficiente y permite su utilización en el desarrollo de la técnica RAPD con diversos fines de investigación. Abstract The objective of this research was to determine the ideal protocol for extraction and purification of the DNA of Tectona grandis L., commonly known as Teak. With the DNA obtained, it was possible to determine suitable conditions for the development of the RAPD technique. In the short term, this will encourage its use for different studies such as: diagnosis, diversity and genetic improvement. Three protocols were evaluated for the DNA extraction (Dellaporta, et al.,1983; Uyemoto, et al., 1997 and Doyle & Doyle, 1987). It was found out that the Uyemoto Protocol reported the best results although it was modified in order to study the specie. Due to the techniques conditions, amplified products were obtained (between 4 and 8 bands) and because of the high level of polymorphism the RAPD analysis reported satisfactory results. Finally we concluded that the protocol of extraction and Teak DNA purification from leaves was efficient and encourage its utilization in the RAPD technique development for diverse research goals. Palabras clave: Polimorfismo, ADN, marcadores moleculares, RAPD. Introducción Hasta mediados de la década del 60 los marcadores utilizados en estudios de genética y mejoramiento eran aquellos controlados por genes asociados a caracteres morfológicos, sin embargo el pequeño número de marcadores morfológicos distintos en un mismo linaje reducía la probabilidad de encontrar asociaciones significativas entre estos marcadores y ecotipos de una especie o a su vez con caracteres de importancia económica, lo cual limitaba su empleo en estudios de diversidad y mejoramiento genético (Ferreira y Grattapaglia, 1998). La revolución de este plano se inicio con el descubrimiento y utilización de los marcadores izoenzimaticos y posteriormente con la llegada de las técnicas modernas de biología molecular las cuales permitieron extraer y purificar el DNA y generar diversos métodos de detección de polimorfismo genético (Stuber, 1992). Con el surgimiento de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se formó una verdadera revolución en la biología tanto en la investigación volcada a la comprensión de procesos biológicos como en las áreas aplicadas incluyendo estudios genéticos, diagnóstico y mejora (Mullis y Faloona, 1987). 1 Docente-Investigador del Laboratorio de biotecnología de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo. Km 1 ½ via Quevedo-Santo domingo. Correo electronico: hnieto77@yahoo.com 2 Director de Laboratorio de biotecnología de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo Km 1 ½ via Quevedo-Santo Domingo. Correo electronico: migluisramos@yahoo.es 3 Director de Laboratorio de biotecnología de la Universidad Santiago de Guayaquil.

3 2 Nieto y col. Extracción y purificación de ADN de Tectona grandis L. Muchos métodos tradicionales de clonación, secuenciación y análisis de polimorfismo de DNA fueron acelerados por el uso de las numerosas derivaciones de la técnica PCR. Una de estas derivaciones es la tecnología RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) que comprende la amplificación simultánea de varios loci anónimos en el genoma utilizando para ello primers (iniciadores u oligonucleótidos) de secuencia arbitraria (Williams et al., 1990; Welsh y McClelland, 1991). Los RAPD son ampliamente empleados en análisis genómicos de individuos y poblaciones (Smith y Chin, 1992), debido a que estos marcadores permiten detectar un mayor porcentaje de loci polimórficos que las aloenzimas. (Szmidt et al., 1996). Otras de las ventajas que presentan estos marcadores es que no se necesita del conocimiento previo de la secuencia del DNA para poder aplicarlos, cosa muy común en especies forestales, de las cuales prácticamente poco a nada se conoce. Sin embargo una de las limitantes del empleo de esta técnica es el bajo contenido de información genética por locus que genera (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Por otro lado la obtención de datos es por lo menos dos órdenes de magnitud más rápida que los RFLP, esto se debe a la posibilidad de detectar polimorfismo por visualización directa de las bandas en el gel (Paran et al., 1991). La técnica AP-PCR como también se conoce a los RAPD permite detectar el gran polimorfismo de DNA distribuido por todo el genoma del organismo lo que potencia el empleo en estudios de diversidad genética (Williams et al., 1993). Todo esto es posible siempre y cuando se cuente con un protocolo de extracción y purificación de DNA estandarizado para la especie de interés, debido a que este proceso constituye una etapa clave de todos los estudios de genética molecular (Motte, 2001). En la actualidad existen varios métodos de extracción de ADN que han sido utilizados para la obtención de marcadores RAPD en especies vegetales, sin embargo para teca no hay información alguna sobre este proceso, el cual nos permitirá realizar a nivel molecular estudios de emparentamiento, diversidad y mejora. En base a lo expuesto, la presente investigación tuvo como objetivo principal estandarizar un protocolo de extracción y purificación de ADN de Teca y determinar las condiciones idóneas para el desarrollo de la técnica RAPD. Material y métodos Recolección de Material Vegetal. Para la ejecución de la presente investigación se colectaron hojas jóvenes de árboles adultos de Teca los mismos que estaban ubicados en la Finca Experimental La Represa propiedad de la UTEQ. Extracción del ADN. La extracción y purificación del ADN de las hojas de teca se llevo a cabo aplicando tres protocolos: Doyle y Doyle (1987), Dellaporta et al. (1983) y Uyemoto et al. (1997) los mismos que fueron modificados para la especie en estudio. La extracción del DNA de teca se logró colocando el buffer de CTAB a 65 ºC durante 15 minutos (2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mm EDTA ph 8, 100mM Tris HCl ph 8, 0.2% Mercaptoetanol y Agua ultra pura). Luego se maceró 100 mg de tejido vegetal de Teca en un mortero con nitrógeno líquido. Se colocó el tejido vegetal macerado en un microtubo con 800 µl del buffer de CTAB para después incubarlo por 20 minutos a 60 ºC. Se centrifugó a rpm durante dos minutos, posterior a esto se recuperó el sobrenadante, se agregó 600 µl de cloroformo isoamílico 24:1 y se paso por el vortex para luego centrifugar nuevamente a rpm por cinco minutos, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio al cual se le agregó un volumen igual de isopropanol helado, se mezclo por inversión y luego se colocó la mezcla en hielo por 10 minutos para precipitar el DNA. Posteriormente se centrifugó a rpm por ocho minutos para después desechar la fase acuosa. Se enjuagó el pellet con etanol 80% y se volvió a centrifugar a la misma velocidad por dos minutos. Se dejó secar al aire y se resuspendió en una solución de TE (Tris y EDTA) en 25 µl., por ultimo se agregó RNAsa tipo A en una concentración de 10 mg/µl durante una hora a 37 ºC. La visualización del DNA obtenido se efectuó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.2% empleando el procedimiento descrito por Rickwood y Hames (1990). Desarrollo RAPD. Para el desarrollo de las condiciones idóneas de la reacción RAPD (Polimorfismo de ADN amplificado al azar) fue necesario implementar la técnica descrita por

4 Foresta Veracruzana 7(2): Williams et al. (1990). Esta técnica se inicio con una PCR con un volumen total de 25 µl, el mismo que estaba conformado por los componentes indicados en la tabla 1. tabla 1. Mini preparación empleada para obtención de marcadores RAPD. (2005). No. Reactivo cantidad 1 Agua ultrapura 15.3 µl 2 Buffer PCR 2.5 µl 3 Cloruro de Magnesio 2.5 µl 4 dntps 2.0 µl 5 Primers 1.5 µl 6 Taq Polimerase 0.2 µl 7 DNA 1 µl TOTAL 25 µl La amplificación del DNA para la obtención de los RAPD fue llevado a cabo en un termociclador programable Smart-Genius. Las condiciones utilizadas para la amplificación constaron de tres segmentos: Primer segmento, desnaturalización a 94 C por 1 minutos, Segundo segmento: 40 ciclos que comprenden; desnaturalización 94 C por 1 min., hibridación 36 C por 1.30 minutos y polimerización 72 C por 2 minutos, y un segmento final de Polimerización de 10 minutos a 72 C, culminando a 4 C. Los fragmentos de DNA amplificado fueron separados por electroforesis a 65 voltios por 3:30 h, en un gel al 1.8% de agarosa. Para la visualización de los productos de la amplificación fueron teñidos los geles con bromuro de etidio. Se escanearon nueve primers, usando tres muestras individuales, es así que se realizó una preselección, afinando la cantidad de DNA para cada muestra y la temperatura optima de hibridación. Los oligos evaluados se muestran en la tabla 2. tabla 2. Lista de primers decaméricos empleados en RAPDs de Tectona grandis L. Clave Secuencia del Primers OPC 1 5 TTCCAGCCAG 3 OPC 4 5 CCGCATCTAC 3 OPC 7 5 GTCCCGACGA 3 OPC 8 5 TGGACCGACGA 3 ÖPC 9 5 CTCACCGTCC 3 OPC 10 5 TGTCTGCGTG 3 ÓPA 12 5 TCGGCGATAG 3 OPA 16 5 AGCCAGCGAA 3 OPA 15 5 TTCGAGCCAG 3 Resultados La extracción del ADN de plantas que contienen grandes cantidades de polifenoles, taninos y polisacáridos ha sido siempre difícil de manejar en el pasado (Webb y Knapp, 1990; Varadarajan y Prakash et a.l,1991). En teca al igual que en otros vegetales existe la presencia de metabolitos secundarios tales como los polifenoles y taninos, los cuales inhiben la acción enzimática, la misma que es esencial en el proceso extracción y purificación del ADN (Collins et al., 1992). En esta especie los polisacáridos fueron visualmente evidentes en el proceso de purificación del ADN notándose su presencia en la textura pegajosa y aspecto viscoso que presentaba el mix de extracción, lo que hicieron difícilmente manejable. Además por la presencia de estos metabolitos se presentó inicialmente dificultades en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) inhibiendo la acción de la Taq polimerasa, lo que concuerda con lo manifestado por Grattapaglia (1994). Consecuentemente fue necesario probar diferentes protocolos para la obtención de ADN libre de un alto grado de impurezas y que sea constantemente amplificable en la reacción en cadena de la polimerasa empleada en la técnica RAPD. El protocolo que finalmente se utilizó, de los tres probados, fue el propuesto por Uyemoto debido a la mayor calidad y cantidad de DNA obtenido. El ADN que se obtuvo fue de tejido perteneciente a hojas jóvenes, el mismo que una vez analizado en el espectrofotómetro presentó los siguientes parámetros: Pureza: 1.70 empleando para ello el calculo 260/280 (Becker et al., 1996), Cantidad: 560 mg/µl y una Absorbancia de (Figura 1). Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % del ADN extraído de hojas jóvenes de T. grandis L La visualización de los geles RAPD se efectuó de manera directa empleando para el efecto un transiluminador de rayos ultravioleta.

5 4 Nieto y col. Extracción y purificación de ADN de Tectona grandis L. Análisis RAPD. Con el empleo de esta técnica se generó un total de 111 bandas provenientes de la amplificación de nueve primers y el ADN de Tectona grandis estudiado. Los oligonucleótidos utilizados generaron bandas fuertes y resolución aceptable, los mismos que permitieron obtener 28 productos monomorficos y 83 polimorficos generando un porcentaje total promedio de polimorfismos del 74.93% (tabla 3). tabla 3. Productos RAPD amplificados con nueve primers decaméricos en T. grandis L. (2005). Primers Productos Amplificados Polimorfism (Clave) Monomórficos Polimórficos (%) OPC OPC OPC OPC OPC OPC OPA OPA OPA Total Media Cabe destacar que el numero de bandas generadas para esta especie leñosa concuerda con lo reportado por Canchignia (2004) en un estudio RAPD empleando los mismos primers y aplicado a Schizolobium parahyba, donde se generaron un promedio de siete a nueve segmentos amplificados. Figura 2. Perfiles de productos amplificados de Tectona grandis L. empleando nueve primers decaméricos (2005) Discusión Los estudios de polimorfismos genético vegetal a nivel de ácidos nucleicos deben de contar siempre con un protocolo de extracción y purificación de ADN eficiente, lo que viabilizara su empleo en diversos estudios y a la vez la obtención de resultados con un alto grado de confiabilidad (Boiteux et al., 1999). Los métodos que se caracterizan por la utilización del detergente catiónico CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) en el tampón de extracción son comúnmente denominados métodos CTAB y son los más ampliamente utilizados en especies vegetales y altamente eficientes para la extracción a partir de pequeñas muestras de tejido (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Un gran número de trabajos publicados de análisis genómico de RAPD utilizaron este método con mínimas variaciones. Una de las ventajas de este método es que no exige preparación previa del tejido y es adaptable a varios tipos de tejido, incluyendo el de hojas, además puede fácilmente acomodar una gran variación de cantidades iniciales de tejido desde el orden de miligramos de tejido momificado y herborizado hasta varios gramos de tejido fresco, (Becker, et al. 1996). Los resultados obtenidos en la presente investigación concuerdan con los reportados por Ferrer (2003) para otra especie leñosa tropical (Gmelina arborea), quien empleando el mismo protocolo obtuvo ADN en concentración y calidad suficiente para el desarrollo de la técnica RAPD en estudios de diversidad genética. Por otro lado, el nivel de polimorfismo reportado

6 Foresta Veracruzana 7(2): a partir del empleo de los nueve primers utilizados, evidencia la calidad del ADN obtenido y potencia su empleo en diversos estudios de diversidad y mejora genética. Lo último citado concuerda con los resultados obtenidos por Canchignia (2004) en S. parahyba quien empleo los mismos primers en estudio de diversidad genética de esta especie leñosa. Se resalta la importancia del empleo de los marcadores RAPD ya que esta reúne por lo tanto la simplicidad técnica de la visualización directa de los marcadores isoenzimáticos, con el poder de resolución de los marcadores de ADN (Ferreira y Grattapaglia,1998). Conclusiones Los resultados reportados en la presente investigación muestran la eficacia del protocolo de extracción de DNA empleado a partir de hojas jóvenes de individuos adultos, el cual fue propuesto por Uyemoto y modificado para la especie en estudio, donde se obtuvo como resultado un DNA con buen grado de pureza y en concentraciones suficientes para su amplificación mediante la técnica RAPD bajo las condiciones descritas. Los fragmentos amplificados mostraron alta resolución y reproducibilidad, lo que permite su empleo para diferentes estudios tales como: diversidad genética y mejoramiento asistido por marcadores moleculares entre otros. Literatura citada BECKER, J.M.; CALDWELL and ZACHGO, E.A Biotechnology: A Laboratory Course. Second Edition. Academic press. 216 p. BOITEUX, L.S.; FONSECA, M.E. & SIMON, P.W Effects of Plant Tissue and DNA Purification Method Randomly Amplified Polymorphic DNA-based Genetic Fingerprinting Analysis in Carrot. Amer. Soc. Hort. pp CANCHIGNIA, F. y MAYEK, N Diversidad Genética de Ecotipos de Schizolobium parahyba del Ecuador. Tesis de Maestría. Universidad de Guayaquil. 63 P COLLINS, G.G. AND SYMONS, R.H Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure. Plant Mol. Biol. Rept. 10: pp. DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J. & HICKS, J.B A plant DNA minipreparation version II. Plant Molecular Biology reporter. 18: pp. DOYLE, J.J. & DOYLE J.L A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19:11-15 pp. FERRER, J Diversidad Genética de Gmelina arborea en Costa Rica. Tesis de Maestría. Universidad de Costa Rica. 58 P FERREIRA, M. & GRATTAPAGLIA, D Introducción al Uso de Marcadores Moleculares en el Análisis Genético. EMBRAPA. 218 P. GRATTAPAGLIA, D Genetic mapping of quantitatively inherent economically important traits in Eucalyptus Ph.D. Dissertation, North Carolina State University. 289 pp. MOTTE, E Programa de Biotecnología. Maestría en Biotecnología. Universidad de Guayaquil. 42 pp. MULLIS, K & FALOONA, F Specific síntesis of DNA in Vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Methods enzymol pp PARAN, I.; KESSELI, R. & MICHELMORE R Identification of restriction fragment length polymorphism and random amplified polymorphic DNA markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce, using nearisogenic lines. Genome 34: pp RICKWOOD, D. & HAMES, B.D Gel electrophoresis of nucleic acids: A practical approach. Oxford University Press. New York. U.S.A pp SMITH, S. & CHIN, E The utility of random primer-mediated profiles, RFLPs and other Technologies to provide useful data for varietal protection. In Proceedings of the Symposium on Applications of RAPD Technology to Plant Breeding pp. STUBER, C.W Biochemical and molecular markers in plant breeding. In Plant breeding reviews Vol. 9. Dudley, J.W.Hallauer, A.R. & Ryder, M.(eds) 119 P. SZMIDT, A.E.; WANG, X.R. & LU, M Empirical assessment of allozyme and RAPD variation in Pinus sylvestris L. using haploid tissue analysis. Heredity 76: pp.

7 6 Nieto y col. Extracción y purificación de ADN de Tectona grandis L. UYEMOTO J.K.; YUN-PING, Z. & KIRKPATRICK, B.C A Small-scale procedure for extracting nucleic acids from woody plants infected with various phytopathogens for PCR assay. Journal of Virological Methods. 126 P. VARADARAJAN, G.S. and PRAKASH, C.S A rapid and efficient method for the extraction of total DNA from the sweet potato and its related species. Plant Mol. Biol. Rept. 9(1):6-12. pp WEBB, D.M. and KNAPP, S.J DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. Plant Mol. Biol. Rept. 8: pp. WELSH, J & McCLELLAND, M Polymorphisms generated by arbitrarily primed PCR in the mouse: application to strain identification and genetic mapping. Nucleic Acids Res. pp WILLIAMS, J.G.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A. & TINGEY, S.V DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res p. WILLIAMS, J.G.K.; RAFALSKI, J.A. & TINGEY, S.V Genetic analysis using RADP markers. Methods Enzymol. pp Recibido en abril de 2005 Aceptado julio de 2005