ANALISIS BÁSICOS DE ALIMENTOS

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1 ANALISIS BÁSICOS DE ALIMENTOS PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS: INTRODUCCIÓN Varios factores afectan los resultados obtenidos en un recuento bacteriano, tales como temperatura de incubación, método empleado, tipo de alimento, pero definitivamente lo que asegura buenos resultados, es el cuidado que se tenga para obtener y preparar una buena muestra que servirá como inoculo preciso y fiel reflejo del numero de microorganismos presentes. Existen varios métodos para lograr este objetivo, pero nos centraremos en el recomendado por él.international Standar Organization (ISO). El diluyente utilizado es el agua peptonada o tamponada con una solución amortiguadora de fosfatos. OBJETIVOS: 1. Utilizar las técnicas adecuadas de preparación de las muestras para análisis microbiano. 2. Adquirir destreza en Ia preparación de las diferentes diluciones de las muestras que se van a analizar.. 3. Establecer que número de diluciones necesitan las diferentes muestras a analizar. METODOLOGIA : La cantidad de alimentos empleada puede variar dependiendo del tipo de bacterias que se busca; lo importante es conseguir una dilución inicial de En nuestro caso emplearemos 10 gramos de alimento y 90 ml del diluyente. La homogeneización de la muestra puede hacerse en un agitador, licuadora o con un mortero cuando se trata de alimentos fácilmente rompibles. Una vez obtenida esta suspensión se procede a realizar las diluciones; para conseguirlo se debe disponer de varios tubos que contienen 9 ml de diluyente a los cuales se transfiere 1 ml de la dilución

2 anterior. De esta forma y a partir de 10-1 se puede obtener las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc respectivamente. Una vez preparadas las diluciones de la muestra, las siembras se realizan inoculando 1 ml. de cada una cuando se hace en profundidad ó 0.1 ml cuando es en la superficie de un agar. RECUENTO MICROBIANO DE MESOAEROBIOS

3 A los alimentos es común practicarles un examen bacteriológico con la finalidad de cuantificar las diferentes poblaciones bacterianas que ellos presentan y la presencia de determinados tipos de microorganismos puede reflejar deficiencia en el proceso mismo de la elaboración o posteriormente en la manipulación que conduce al empaque. RECUENTO STANDARD DE MESOFILOS AEROBIOS VIABLES (MESOAEROBIOS) EL método empleado se realiza en caja de Petri utilizando el agar cuenta gérmenes como medio de cultivo; se realiza a todo tipo de alimento y la siembra puede hacerse en profundidad, ó en superficie. OBJETIVO: Cuantificar la población de microorganismos aerobios viables en un alimento. MATERIALES: Por muestra de alimentos 1 Balanza (alimento sólido) 1 Pipeta de 10 ml graduada estériles (sí el alimento es líquido) 1. Papel o vidrio reloj estéril (si el alimento es sólido) 1. Tijera o pinza estéril 1 Morteros estériles (alimento sólido) 1 Hoja de bisturí (Alimento es carne) 1 Bajalenguas estériles (alimentos sólidos) 1 Recipiente frasco con 90 ml de agua peptonada para la primera dilución 10 Tubos con 9 ml de agua peptonada para las diluciones 5 Cajas de petri vacias estériles. 1 Micropipeta de microlitros 5 Tubos o erlenmeyer con 15 ml de plate Count Agar

4 METODOLOGÍA: Tradicionalmente se ha recomendado que con la finalidad de minimizar el error producido en los recuentos, todas las diluciones se siembren por duplicado. 1. Preparar las diluciones del alimento siguiendo las instrucciones de la sección anterior. 2. Pipetear de cada dilución 1 ml en una caja de petri vacia y estéril empezando por la dilución 10-1 hasta 10-5 Se sugiere esta serie de diluciones cuando no se conoce el grado de contaminacíon que pueda tener el alimento. 3. Teniendo el medio de cultivo fundido y enfriado a una temperatura de 45 C aproximadamente agregar a cada caja de Petri que contiene el ml. de las diferentes diluciones el contenido del tubo. Con movimientos suaves en sentido vertical, luego horizontal y finalmente circulares en el sentido de las agujas del reloj y a la inversa, teniendo el cuidado de no formar burbujas, se logra una mezcla uniforme entre la muestra y el medio de cultivo. Debe hacerse siguiendo los pasos anotados para conseguir un crecimiento bacteriano uniforme y rápido, para evitar la solidificación del agar. 4. Una vez solidificado el agar se invierten y se incuban a C. REALIZACION DE LOS RECUENTOS: Seleccione para hacer su recuento aquella dilución donde haya crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias. Cuente las colonias y el número encontrado deberá multiplicarlo por el reciproco de Ia dilución que utilizo para hacerlo. Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En la hoja siguiente usted encontrará las diferentes posibilidades y que hacer en cada caso. Lo importante es saber que cuando se puedan encontrar

5 diluciones que contengan entre 30 y 300 colonias si el recuento es preciso, se informa como Recuento Standard. RECUENTO ESTIMADO STANDARD Este cálculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilución que contenga menos de 300 colonias. Para hacer recuentos se puede dividir la caja en aun 8 porciones y contar las colonias. Este numero de colonia se multiplica por el factor apropiado ( 2, 4 u 8) y además por el reciproco de la dilución, que en este caso sería la más alta. Cuando hay más de 200 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja hay más de (200 X 8). El recuento total deberá ser mayor de multiplicado por el reciproco de la más alta dilución. Si no hubiese colonias en la caja de la dilucíon menor (10-1) se reporta como menos de 10 colonias puesto que el mínimo número de colonias que se puede obtener es de 1 y al multiplicarlo por el reciproco de la dilución dará 10. EXPRESION DE LOS RESULTADOS: 1. El recuento bacteriano se debe expresar con 2 dígitos y el resto en potencias de Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por ejemplo O-300 etc. es necesario aplicar algunas correcciones con la finalidad de convertir el numero hallado en uno con 2 dígitos. Ejemplos 1. Si el recuento se realizó en la diluci6n 10-3 y fue de 138 colonias, el tercer dígito por ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2o. o sea que el recuento seria = 14 x Si el recuento fue de 124, por ser el 3o dígito menor que 5 se anula y se expresa = 12 x 104.

6 4. Cuando el recuento de mesoaerobios se utiliza para determinar la aceptación o rechazo de un alimento, únicamente se considerar el recuento standard y nunca el estimado. NORMAS PARA INTERPRETAR Y REPORTAR EL RECUENTO ESTANDAR EN PLACA. Características del recuento Dos cajas de la misma dilución tienen entre 30 y 300 colonias. Contar las dos cajas Ejemplo Calcular Reportar Dilución 10-2 Caja 1: 180 Caja 2: 140 Promedio aritmético: Promedio = 160 Recuento estandar en placa: 16 x 10 3 En la misma dilución una caja tiene entre 30 y 300 y la otra < 30 ó >300 colonias. Contar las dos cajas. Dilución 10-2 Caja 1: 70 Caja 2: 26 Promedio aritmético: Promedio = 48 Recuento estandar en placa: 48 x 10 2 Las cajas de dos diluciones consecutivas tienen entre 30 y 300 colonias Contar las 4 cajas a : 35 b. 10-2: 250 a : 38 b : 150 Relación 10-2 /10-3 : 35000/25000 = Menos de 2. Tomar promedio. Relación 10-2 /10-3 : 38000/15000 = Mayor de 2. Tomar el menor. Recuento estandar en placa: 30 x 10 3 Recuento estandar en placa: 15 x 10 3 No hay colonias en las cajas de la suspensión más concentrada Dilución 10-1 Caja 1: <1 Caja 2: <1 Promedio: <1 Recuento estimado en placa: <1x10 1 Dos cajas de la dilución más alta tienen más de 300 colonias. Dividir las cajas en forma radial (2, 4, 8) y contar el número de colonias por sección. Dilución 10-3 Caja 1: 180 en ¼ Caja 2: 160 en ¼ Más de 200 en 1/8. Promedio aritmético 180 x 4 = x 4 = 640 Promedio: 680 Recuento estimado en placa: 68 x 10 4 >200 x 8 = 1600 Recuento estimado en placa > 16 x 10 5 Presencia de colonias diseminadas en un área menor de la mitad de la caja. Contar la otra mitad Dilución 10-2 Caja 1: mitad 60 x 2. Caja Promedio aritmético: X = 150 Presencia de colonias diseminadas 15x 10 3

7 RECUENTO BACTERIANO EN PLACA DE COLIFOMES INTRODUCCIÓN: El recuento de coliformes realizado en agar y ca,ia de Petri suministra un dato acerca de las bacterias que contaminaron el alimento posterior al proceso. Los coliformes se hacen evidentes por la capacidad que ellos tienen para fermentar la lactosa que posee el medio de cultivo. Es necesario anotar que aunque los indicadores de contaminación fecal (Escherichia coli) son también coliformes, este recuento solo nos suministra el dato de bacterias que pueden provenir tanto del intestino humano y animal como de otras fuentes. Esta técnica es recomendada para el análisis de agua, leche, helados y carnes. OBJETIVOS 1. Familiarizar al estudiante con el procedimiento y medio de cultivo empleado para realizar el recuento de coliformes. 2. Medir el grado de contaminación de un alimento procedente de los manipuladores. MATERIALES 1. Elementos necesarios para la preparación de las diluciones de las muestras (Diluciones 10-1 a 10-3 ) 2. Cajas de Petri estériles y vacias 3. Micropipeta de microlitros 4. Tubos con 15 ml de Agar Violeta cristal rojo neutro bilis o Mac Conkey PROCEDIMIENTO: 1. Prepare una muestra de alimento y haga diluciones hasta Transferir 1 ml de cada dilución a una caja de Petri estéril.

8 3. Adicionar ml del medio de cultivo licuado y enfriado a C y practicar los movimientos necesarios para conseguir una completa homogenización de la muestra. Dejar solidificar el medio. 4. Recubrir la superficie del medio solidificado con 10 ml del medio de cultivo también enfriado s C: 5. Invertir e incubar las ca,ias a 37 C durante 24 horas. Al cabo de este tiempo escoja la dilución que contenga entre 30 y 300 colonias de color rojo y de diámetro mayor de 0.5 mm. El recuento se expresará multiplicando el número de colonias contadas por la dilución de la caja en la cual se hizo el recuento. NMP DE COLIFORMES FECALES Y TOTALES INTRODUCCIÓN: El número más probable (NMP) es un método de realizar recuento bacteriano basado en la probabilidad que existe en el laboratorio de aislar bacterias en un sistema de medios de cultivo líquidos donde se siembran los inóculos empleando series de 5 y 3 tubos por cada dilución. Esta técnica que es tal vez de las más sensibles, se puede aplicar a muchos microorganismos. En nuestro caso lo utilizaremos en la búsqueda de Coliformes Totales y Fecales, Escherichia coli y Enterococcus,.como indicadores bacterianos de contaminación fecal y para Staphylococcus aureus, indice bacteriano. El NMP para S. aureus es especialmente recomendado para el análisis de leche en polvo. OBJETIVOS: 1. Familiarizar al estudiante con la técnica y los medios de cultivo empleados para realizar el NMP de coliformes totales y fecales, Enterococos y S. aureus. 2. Aplicar los indicadores bacteriológicos de contaminación fecal. 3. Buscar índices bacterianos en cierto tipo de alimentos. NMP DE COLIFORMES TOTALES, FECALES Y E. coli

9 La Prueba consta de tres etapas: 1. Prueba presuntiva 2. Prueba confirmativa 3. Prueba completa MATERIALES Tubos con 9 ml de Caldo Lauril Sulfato Triptosa de sencilla concentración y tubo de fermentación Tubos con 9 ml de Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis con tubo de fermentación Tubos con caldo Triptona 4. 3 Cajas de Petri con Agar Mac Conkey 5. Pruebas bioquímicas METODOLOGIA: Usaremos dos series de tres tubos para cada dilución. La primera serie consta de tres tubos con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de doble concentración y seis con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de concentración sencilla. Esta técnica es recomendada para el análisis de agua tratada y será mencionada en detalle en la Práctica de Microbiología del Agua. La segunda serie, que también se utiliza para agua sin tratar, la realizaremos para analizar un alimento consta de 9 tubos que contienen Caldo Lauril Sulfato Triptosa de concentración sencilla con tubo de fermentación. A. PRUEBA PRESUNTIVA 1. Prepare la muestra del alimento con los 90 ml de solución sal.ina peptonada y a partir de ella haga diluciones hasta Inocule 1 cc de la dilución 10-1 en cada uno de tres tubos con el medio de cultivo antes anotado

10 3. Continué sembrando un ml de cada dilución en 3 tubos hasta llegar a la dilución Incube a 37ºC durante horas. 5. Registre los tubos que contienen gas en el tubo de fermentación y presenten turbidez. PRUEBA CONFIRMATIVA: 1. De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva transfiera 2 asadas a otros que contienen Caldo Verde Brillante, lo mismo que a los tubos con Caldo Triptona. 2. Incubar a 45ºC los tubos brilla y triptona inoculados durante horas. La prueba confirmativa también se puede realizar inoculando de los positivos en la presuntiva a caldo E.C. e incubar a 44.5 ± 0.2 C. 3. Al cabo de la incubación observar los tubos de brilla que presenten turbidez y gas y practicar prueba de Indol a los Caldos Triptona. 4. Registre los tubos positivos de brilla y para Indol. 5. éstos le darán la fórmula que aplicará a la tabla adjunta para buscar el NMP de coliformes fecales. No incluya los tubos Indol negativo aunque el brilla haya sido positivo. PRUEBA COMPLETA: 1. De cada uno de los tubos con brila positivos y que tambien fueron Indol positivos tome una asada para sembrar Agar EMB. 2. Incube a 37ºC y al cabo de este tiempo observe la morfología de las colonias. Si encuentra colonias aisladas y típicas se puede purificar el cultivo en agar nutritivo inclinado. 3. A partir de una colonia aislada a del agar nutritivo realice las pruebas bioquímicas para identificar completamente Eschechia coli.

11 TABLA PARA REALIZAR LA LECTURA DEL NMP DE ALIMENTOS * (COLIFORMES Y ENTEROCOCOS) Índice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres tubos de cada dilución.** Número de tubos positivos en cada nivel de dilución Dilución Dilución Dilución NMP/g ó ml Límites de confianza 99% 95% > < * Calculado a partir de los datos Man (1975) ** En cada nivel de dilución inocular 1 ml en cada uno de los tres tubos de medio. Para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que señalan, multiplicar el NMP por el factor apropiado de 10, 100, etc. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS INTRODUCCIÓN: La familia Enterobactericeae esta compuesta por bacilos Gram negativos de tamaño mediano, anaerobios facuitativos, móviles e inmóviles, no esporulados. Las enterobacterias crecen bien en medios artificiales, tienen necesidades nutritivas simples, fermentan la glucosa con producción de ácido o ácido y gas, reducen los nitratos a nitritos y son

12 oxidasa negativos; son organismos ubicuos de distribución mundial, encontrándose en el suelo, el agua, la vegetación y formando parte de la microbiota bacteriana normal de casi todos los animales. Algunos géneros de la familia se encuentran normalmente en el humano. Miembros de esta familia se encuentran asociados a cuadros disentéricos, mientras que otros, pueden producir infecciones oportunistas. Las infecciones pueden comprometer muchos órganos o sistemas. METODOLOGÍA: 1. De las enterobacterias aisladas de los alimentos realizar una siembra por agotamiento en agar Mac Conkey, para observar colonias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Incubar a 37 C durante 24 horas. 2. Observar la morfología, tamaño, aspecto y color de las colonias. Aquellas que presenten color rosado habrán fermentado la lactosa. 3. A partir de las colonias lactosa negativas, hacer subcultivos en agar Hecktoen. 4. De las colonias aisladas, obtenidas en los dos agares selectivos. sembrar en los siguientes medios para realizar pruebas bioquímicas: TSI: contiene glucosa, sacarosa, lactosa y rojo de fenol, indicador de ph sulfato ferroso, para observar la producción de H2S. La siembra se hace con asa recta en profundidad y estría en la superficie. lnterpretación: REACCIÓN Fondo ácido* Superficie A/K inclinada alcalina Todo el medio ácido (Amarillo A/A Burbujas Ennegrecimiento del fondo Medio alcalino (rojo) K/K Acido: amarillo Alcalino: rojo INTERPRETACIÓN Fermentación de glucosa Fermentador de glucosa y lactosa Producción de gas Producción de H2S No fermentador

13 Lisina decarboxilasa: La decarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen decarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo (-COOH), dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico. Se siembra igual que el TSI. Interpretación: La prueba es positiva cuando hay cambio de color al púrpura. Los organismos del grupo de los Proteus cambian el color a rojo, debido a la acción de la cadaverina. La reacción se observa rojo en la superficie inclinada y amarillo en el fondo. Se denota como R/A. La prueba es negativa cuando hay cambio de color al amarillo. Citrato de Simmons: Contiene citrato como única fuente de carbono y sales de amonio como fuente de nitrógeno, no contiene aminoácidos. Las bacterias que pueden utilizar el citrato tambien extraen nitrógeno con la producción de amonio que alcaliniza el medio de cultivo; el indicador de ph es azul de bromotimol. Se siembra solamente en superficie. Interpretación: La prueba es positiva cuando se observa crecimiento con un color azul intenso. La prueba es negativa si no se observa cambio de color. Urea de Christensen: Si la bacteria posee la enzima ureasa, hidroliza la urea del medio liberando amonio y C02. EI indicador utilizado es el rojo de fenol. Se siembra en superficie. Interpretación: La prueba es positiva cuando se observa cambio de color al rosado. La prueba es negativa cuando no hay cambio de color.

14 Movilidad: La siembra se realiza por una punción con asa recta entrando por el centro del agar, pero sin Ilegar hasta el fondo del tubo que contiene agar blando. Las bacterias móviles se diseminan en el medio y puede observarse opaco todo el tubo o como una nube alrededor del sitio por donde entro el asa. Cuando Ia bacteria es inmóvil, solo se observa turbidez donde entro el inóculo. Prueba de Indol: Las bacterias que poseen la enzima triptofanosa, son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con la produccion de indol, ácido pirúvico y amonio. Para evidenciar la presencia de indol se adiciona el reactivo de Kovacs. Para sembrar el inóculo se agita el asa en el caldo. Interpretación: La prueba es positiva cuando se presenta un anillo rojo en Ia superficie o todo el medio se torna color mandarina. La prueba es negativa cuando el caldo continúa turbio o se torna de color amarillo. Si la bacteria que se identifica, bioquímicamente, es compatible con Salmonella sp. o Shiguella sp., se hace necesaria la confirmación serológica con antisueros polivalentes y específicos de grupo. BÚSQUEDA DE SALMONELLA INTRODUCCIÓN: La Salmonella es un género bacteriano que se puede encontrar en muchos alimentos, ya sea proveniente de la materia prima o de manipuladres que porten la bacteria. Este examen se le practica rutinariamente a todos los alimentos producidos a base de carne y huevos, en ocasiones se realiza en cierto tipo de alimentos por ejemplo:

15 harinas de trigo y de pescado. Su presencia es suficiente para rechazar un alimento, pues se trata de un índice bacteriológico o sea una bacteria patógena. OBJETIVO: 1. Realizar la prueba cualitativa de detección de Salmonella para aceptar o rechazar un alimento. MATERIALES: a. Erlenmeyer con 225 ml de caldo lactosado b. Tubos con caldos de enriquecimiento Selenito, Tetrationato y Hajna c. Cajas de Petri con Hecktoen d. Medios para pruebas bioquímicas de enterobacterias. e. Micropipetas f. Asas METODOLOGIA: 1. enriquecimiento no selectivo. Pesar 25 gramos del alimento e inocularlo en 225 ml de caldo lactosado e incubar a 37 C durante horas. 2. enriquecimiento selectivo: Transferir 1 ml de caldo crecido a 10 ml de Tetrationato, Selenito o Caldo Hajna. Incubar a 43 C durante 18 horas. AI cabo de la incubacidn, si se observa crecimiento en los caldos de enriquecimiento realice subcultivos en agar Bismuto Sulfito y Mac Conkey e incube a 37 C durante horas. Efectúe la lectura del cultivo y si observa colonias lactosa negativas realice las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de Salmonella e inocule en agar nutritivo para confirmación serológica. 3. aglutinación con antisuero polivalente somático:. Una vez que por pruebas bioquímicas se encuentre frente a una posible Salmonella, debe aglutinar para corroborar su hallazgo. Deposite en agar nutritivo unas 5 gotas de solución salina para hacer una suspensión homogénea; coloque una gota de ella en un portaobjetos y al lado una

16 gota de antisuero, mezclelas y someta a agitación durante unos segundos. Si es Salmonella deben presentarse unos grumos que indican positividad en la prueba. INTRODUCCIÓN: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS Todo el mundo conoce el crecimiento de los mohos en los alimentos, caracterizados por un aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces coloreado; generalmente este alimento se desecha como inadecuado para el consumo. Si bien es cierto que algunos hongos causan el deterioro de los alimentos, otros son útiles en la elaboración de éstos. Además ciertos hongos pueden producir metabolitos tóxicos (micotoxinas). Son contaminantes de harinas, azúcares, granos almacenados, frutas, condimentos, etc. Son muy importantes los recuentos de hongos por que nos brindan una idea de cómo se esta procesando y bajo que condiciones se esta almacenando el producto. OBJETIVOS: 1. Que el estudiante reconozca los medios de cultivos utilizados para realizar los recuentos de hongos. 2. Realice el proceso de recuento de unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro de muestra (UFC/ml) y la identificación de hongos. MATERIALES: Erlenmeyer de 500 ml Espátula Probeta de 250 ml Cajas de Petri estériles Vidrios reloj Asas de vidrio estériles Balanza de precisión y analítica Mecheros de gas

17 Asas micológicas Autoclave Peptona Cloranfenicol METODOLOGÍA. Agitador magnético Agar bacteriológico Glucosa 1. Realice las diluciones de acuerdo con lo especificado en la página 1 y 2. (De 10-1 a 10-3) 2. Inocule en la superficie del agar Saboraud de la siguiente manera: 1 ml de la dilución 10-1 (1:10) 0.1 ml de la dilución 10-1 (1:100) 0.1 ml de la dilución 10-2 (1:1000) 0.1 ml de la dilución 10-3 (1:10000) 3. Distribuya con un asa de vidrio la muestra situada en la superficie del agar Saboraud. 4. Incúbelos a temperatura ambiente por 5 8 días. 5. Haga los recuentos y posible identificación del hongo.

18 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA DE PISCINA. BÚSQUEDA DE Pseudomonas aeruginosa INTRODUCCIÓN: EI agua de piscina debe reunir las características del agua potable, por lo tanto, el análisis a realizar se hace igual que para el agua tratada, con dos variantes: A los 100 ml de muestra se le debe agregar 0.3 mls de Tiosulfato de Sodio al 10%. La busqueda de Pseudomonas aeruginosa se considera un examen rutinario en el análisis bacteriológico, por la implicacidn clinica que pueda tener, como agente etiológico de otitis. MATERIALES: a. Un erlenmeyer con 50 ml de Caldo Olson b. Muestra de agua c. Agar Cetrimide d. Asas bacteriológicas de argolla e. Incubadora a 35 C ± 1 C. f. Mechero METODOLOGIA: 1. Sembrar 50 ml de la muestra en 50 ml de Caldo Olson 2. Incube a 35 C f durante 24 horas 3. Transfiera dos asadas al agar Cetrimide y siembre en superficie por agotamiento. 4. Incube a 42 C durante 24 a 48 horas 5. Informe: Presencia de Pseudomonas aeruginosa: negativa o posiiiva 6. Realice también recuento de mesófilos aerobios viables 7. Haga la prueba de NMP para coliformes totales y fecales

19 INTRODUCCIÓN: ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA La orientación de estos análisis ha basado principalmente su interés en los aspectos sanitarios. No se conocen bien todas las bacterias cuyo medio propio es el agua, en parte porque es difícil que muchas de ellas crezcan en medios de cultivo rutinarios, pero hay otras que se han identi icado como población natural, entre las cuales encontramos Serratia, Pseudomonas, Sarcina, Micrococcus y Caulobacterias Ilamadas también bacterias pedunculadas. Es necesario el análisis bacteriológico del agua para determinar potabilidad para el consumo humano, así como para controlar la eficacia de los métodos de tratamiento. OBJETIVOS: 1. Llevar a cabo análisis bacteriológico de agua tratada y sin tratar para establecer su calidad sanitaria. 2. Aislar Pseudomonas aeruginosa en muestras de agua de piscinas. MATERIALES: a. Solución salina peptonada para las diluciones b. Agar cuenta germenes. Recuento de mesoaerobios c. Cajas de Petri vacias estériles d. Caldo Lauril Sulfato Triptosa. NMP de coliformes totales y fecales e. Caldo Verde brillante o caldo EC NMP de coliformes totales y fecales f. Agar MacConkey : Lactosa negativos y positivos. g. Agar cetrimide. Pseudomona h. Pipetas serológicas graduadas

20 METODOLOGIA: Análisis bacteriológico de agua sin tratar: Recuento estandar de mesofilos aerobios viables (mesoaerobios) : 1. A partir de la muestra de agua tomar 10 ml y agregarlos a 90 ml de solución salina peptonada (diluyente), (dilución 10-1 ), seguidamente hacer diluciones sucesivas hasta Pipelear de cada dilución 1 ml a una caja de Petri vacia y estéril. 3. Teniendo el medio de cultivo fundido y enfriado a una temperatura de 45 C aproximadamente agregar a cada caja de Petri que contiene el ml de las diferentes diluciones el contenido del tubo. Con movimientos suaves en sentido vertical, luego horizontal y finalmente circulares en el sentido de las agujas del reloj y a la inversa, teniendo el cuidado de no formar burbujas, se logra una mezcla uniforme entre la muestra y el medio de cultivo. Debe hacerse siguiendo los pasos anotados para conseguir un crecimiento bacteriano uniforme y rápido, para evitar la solidificación del agar. 4. Una vez solidificado el agar las cajas se invierten y se incuban a 35 37ºC durante 24 a 48 horas. 5. Seleccione para hacer su recuento, aquella dilución donde haya crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias. 6. Cuente las colonias y el numero encontrado deberá multiplicarlo por reciproco de la dilución que utilizo. Prueba presuntiva para determinación de coliformes totales por el méto del NMP: 1. Realice diluciones 1:10, 1:100, 1:1.000, 1: de su muestra de agua. Marque sus tubos de dilución y caldo para sembrar, de tal forma que tenga tubos con caldo para sembrar cada dilución. 2. Transfiera 1 ml de cada dilución a cada uno de los 3 tubos con caldo con LSTB use una pipeta para cada dilución. 3. Incube a 35 C +/- 1 C durante 24 ó 48 horas.

21 4. Anote sus resultados tomando como positivo los tubos que tengan turbidez y gas en el tubo de fermentación. Prueba confirmativa para determinación de coliformes fecales por el medio del NMP 1. De los tubos positivos repicar 0.5 ml a caldo E.C., incubar a 44.5 ± 0.2 durante 24 a 48 horas. 2. Considerar como positivos los tubos que presenten turbidez y producción de gas. 3. Anote sus resultados y busque el NMP en la tabla adjunta. Determinacion de Escherichia coli: 1. A partir de los tubos E.C. positivos transfiera una asada a agar Mac Conkey e incube a 35 C - 37 C durante 24 horas. 2. Escoja colonias aisladas lactosa positivas. 3. Realice pruebas bioquímicas e identifique Escherichia coli.

22 TABLA PARA REALIZAR LA LECTURA DEL NMP DE AGUA* (Coliformes y Enterococo) Indice del NMP y limites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres alicuotas de 10 ml, tres de 1 ml y otras tres de 0.1 ml. Nilmero de tubos positivos Limites de confianza del total de: Indice del NMP 95% 3 tubos 3 tubos de 3 tubos de por 100 ml (nferior Superior 10 ml 1 ml 0.1 ml > * Esta tabla procede de la American Public Health Association. ANALISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA POTABLE Recuento estandar de mesofilos aerobios viables: de la misma forma que para el agua no tratada. Prueba presuntiva para determinación de coliformes totales por el metodo del NMP: 1. A 100 ml de muestra agregar 0.1 ml.de Tiosulfato de Sodio al 10%, para neutralizar la acción del cloro sobre las bacterias.

23 2. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración doble, agregar 10 ml del agua sin diluir. 3. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración sencilla, agregar 1 ml del agua sin diluir. 4. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración sencilla, agregar 0.1 ml del agua sin diluir. 5. Incubar todos los tubos a 35 C - 37 C durante 24 a 48 horas. 6. Tomar como positivos los tubos que tengan turbidez y gas Prueba confirmativa para determinación de coliformes fecales por el metodo del NMP: Realizar el procedimiento de la misma forma que para el agua no tratada. Determinación de Escherichia coli: Realizar el procedimiento de la misma forma que para el agua no tratada. ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE INTRODUCCIÓN: Los productos Iácteos son en general un excelente alimento para ser alterados los microorganismos. La leche no contiene microorganismos que se consideren normales, pero la leche cruda, fresca, de animal sano, contiene microorganismos en relación con la higiene del ordeño, limpieza y manipulación del equipo. La leche dentro de la ubre, debe ser estéril, la leche emana a través del conducto que termina en un esfinter el cual al dilatarse demora dos horas aproximadamente en volver a contraerse, la vaca al echarse contamina el pezón. La leche contiene sustancias bacteriostáticas que limitan el desarrollo de microorganismos, pero el efecto no es duradero y es termolábil la sustancia que lo ejerce. Entre los microorganismos patógenos que pueden provenir de la vaca encontramos: M. tuberculosis, B. abortus, Streptococcus agalactiae Staphylococcus aureus, entre otros.

24 La presencia de micobacterias ha servido para determinar la temperatura empleada en la pasteurización, el cual es un método eficaz que no garantiza la contaminación, posterior y tampoco elimina la totalidad de las bacterias cuando la leche pasteurizada esta muy contaminada. Entre los géneros considerados inocuos para la salud humana, que usualmente se encuentran contaminando la leche cruda encontramos: Leuconostoc (de la familia Streptococcaceae, junto con Aerococcus, Gemella, Pediococcus y Streptococcus no ha sido identificado en humanos); Lactobacillus. Micrococcus. Coliformes, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Bacillus sp. AI ser pasteurizada la leche cruda debe eliminarse toda la población, excepto la bacterias termodúricas principalmente de los géneros Streptococcus, Lactobacillus y Bacillus, las cuales alteran la leche, produciendo ácido láctico a partir de lactosa, bajando el ph, presentándose el cuajado. " Las bacterias termodúricas resisten las temperaturas del tratamiento pero a diferencia de las termofílicas no necesitan estas temperaturas para su crecimiento y metabolismo. Referente a los medios que se utilizan para el análisis microbiológico de la leche Ia A.P.H.A. recomienda que el Caldo Lauril Sulfato Triptosa se utilice para la identificación presuntiva de coliformes por el método de NMP en aguas, afluentes ó aguas residuales, leche y alimentos. En diferentes estudios se ha evidenciado un crecimiento abundante y producción de gas a partir de pequeños inóculos de organismos coliformes. También se ha demostrado su superioridad en el diagnóstico presuntivo de la presencia de coliformes, comparado con el caldo verde brillante al 2%.

25 MATERIALES: Solución salina peptonada LSTB de concentracion sencilla Caldo Brila o caldo EC Agar MacConkey Agar cuenta g8rmenes Pruebas bioquimicas Bano Maria 63 C Pipetas serologicas METODOLOGIA: ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE CRUDA. Se practican siguientes analisis: Recuento de Mesoaerobios (visto anteriormente) Determinacibn del NMP de coliformes totales y fecales y E. coli (visto) ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE PASTEURIZADA Recuento de mesoaerobios Determinacion del NMP de coliformes totales y fecales y E. coli: Recuento de Termodúricos: 1. Homogenizar la muestra de leche y transferir 5 ml a cada uno de 2 tubos de ensayo. 2. Coloque el tubo en bano Maria a 62.8 C - 63 C durante 30 minutos. 3. Enfrie inmediatamente el tubo en una cubeta con hielo hasta que alcance 4 C, en uno de los tubos se coloca el termómetro. 4. Siembre por duplicado en agar para recuento e incube a 30 C durante 48 horas. 5. Realice ei contaje e informe UFC/ml.

26 Prueba de la fosfatasa: 1. Preparación de controles: 2. Negativo: Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de leche y en otro en el cual se introduce además de la leche, un termómetro. Calentar a 90 C durante 1 minuto, agitando continuamente para asegurar un calentamiento uniforme y una destrucción de la fosfatasa. Enfriar rápidamente. 3. Positivo: A 100 ml de leche previamente calentada a 90 C durante 1 minuto y enfriamiento rápido adicionar 1.0 ml de leche cruda y fresca. Metodología: 1. Pipetear 1 ml de cada muestra de leche a un tubo de ensayo limpio y seco. 2. Pipetear 5 ml de reactivo p-nitrofenildisódico a cada uno de los tubos con leche y a los controles. 3. Tapar los tubos, mezclar bien y someterlos a incubación en baño maria a 35.6 C durante 2 horas. 4. Después de la incubación, colocar los tubo a la luz del día o bajo luz fluorescente (no se recomienda luz amarilla). Interpretación: Si las muestras de leche no presentan cambio de color, o un amarillo débil, pero que no es más intenso que el color del control negativo, la prueba se considera negativa e indica que las muestras fueron pasteurizadas adecuadamente. Si por el contrario, se presenta un color amarillo la prueba es positiva. Se recomienda repetir la prueba repasteurizando la leche para excluir un falso positivo dado por la fosfatasa bacteriana, la cual es más resistente al calor que la fosfatasa alcalina de la leche cruda.

27 RECUENTO DE LACTOBACILLUS Algunos alimentos son preparados inoculando en un sustrato adecuado, cierto cultivo bacteriano que se utiliza para producir una sustancia que le dá el sabor característico al alimento. Tal es el caso de algunas bacterias fermentadoras, productoras de ácido láctico que son empleadas en la industria de derivados lácteos, néctares y jugos: Un género bacteriano importante en este tipo de industria son los Lactobacillus, los cuales deben estar en un alimento en cantidades controladas para evitar la descomposición prematura del producto. OBJETIVOS: 1. Cuantificar la cantidad de Lactobacillus presentes es un alimento. MATERIALES: 1. Todos los elementos necesarios para realizar la dilución. 2. Cuando el alimento es un producto ácido, el diluyente es una solución amortiguadora ph Agar Rogosa en tubos, fundido y enfriado a 45ºC. 4. Cajas de Petri 5. Pipetas 6. Estufa incubadora PROCEDIMIENTO: 1. Prepare diluciones de la muestra, empleando como diluyente agua peptonada o buffer segúnun sea el caso. 2. Mida 10 ml de la muestra homogenizada y mezclela con 10 ml de buffer, ph 7.0. Saque 2 ml de esta mezcla y transfiéralos a un tubo que contiene 8 ml de agua peptonada y a partir de esta solución realice las diluciones como se ha hecho siempre.

28 3. Depositar l ml da cada una de las diluciones en cajas de Petri vacias y estériles. 4. Adicionar a la muestra 15 ml de agar rogosa fundido. mezclar, dejar solidificar. 5. Agregar 5 ml de agar para cubrir la superficie. 6. Incubar a 35ºC durante 3 dias LECTURA: Después de incubación, busque la dilución donde haya entre 30 y 300 colonias de 0.5 a 1 mm, opacas, blanquecinas y de borde bien definido. Realice coloración de Gram para constatar que se trata de una bacilo Gram positivo. Haga la prueba de Catalasa, la cual debe ser negativa. Informe como UFC de Lactobacilos.. PRUEBA DE ESTERILIDAD DE ENLATADOS Esta prueba se practica básicamente a los alimentos enlatados, tanto cárnicos, vegetales y lácteos; su calidad bacteriológica se evalúa bajo las normas de la prueba de "esterilidad comercial" o "viabilidad bacteriana" incluyendo las fases de preincubación y la de identificación del microorganismo causante del deterioro, logrando su aislamiento en agares o por el crecimiento obtenido en medios líquidos. OBJETIVOS 1. Familiarizar al estudiante con la técnica de esterilidad comercial 2. Observar la relación que existe entre la presencia de microorganismos y cualquier cambio presentado en la lata. MATERIALES a. Muestras de latas a analizar b. Incubadoras a 35~C y 55~C.

29 c. Alcohol d. Abrelatas estéril e. Tubos con caldo cerebro corazón f. Pipetas g. Láminas portaobjetos h. Coloración de Gram METODOTOLOGÍA 1. Tomar un número de muestras de acuerdo al tamaño del lote. 2. Limpiar y retirar la etiqueta, marcar las latas con fecha, número de muestra, temperatura de preincubación. 3. Desinfectar las latas. 4. Posteriormente incubar entre dos hojas de papel de filtro la mitad de las latas a 35ºC durante 10 días y el resto a 55 C durante 5-7 dias. 5. Revisar períodicamente las latas (cada dos días), retirar las abombadas o que presenten fugas de su contenido. 6. Terminado el tiempo de incubación proceder a evaluar la presencia de microorganismos. Para este efecto desinfecte cuidadosamente la lata y Abrala asépticamente; transfiera 5 ml de la muestra a cada uno de 3 tubos que contienen caldo cerebro corazón e incubelos a 35 C y 55 C, según la temperatura que haya empleado, durante horas. Algunas veces, cuando hay sospecha, se deben hacer cultivos de anaerobios. Practicar la lectura observando los tubos que presentan crecimiento. 7. Del contenido que queda aun en la lata hacer un frotis para colorear con Gram, observar cambios físicos, especialmente el.color, aspecto, olor, textura, estructura y ph. 8. Debe haber concordancia entre el examen microscópico y el resultado del cultivo.

30 a. Interpretacion b. El abombamiento de las latas puede deberse a contaminación bacteriana. c. Una lata no abombada no excluye la presencia de microorganismos. d. Debe haber por lo menos 2 tubos con crecimiento. Uno solo hace pensar en contaminación durante el proceso de la siembra. e. Considerar que el producto es comercialmente estéril, cuando máximo un tubo muestra desarrollo. Sin embargo, si esto ocurre mejorar la asepsia durante las manipulaciones. RECUENTO BACTERIANO DE S. aureus POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE INTRODUCCION: EI Número Más Probable (NMP) es un método de realizar recuento bacteriano basado en la probabilidad que existe en el laboratorio de aislar bacterias en un sistema de medios de cultivo liquidos donde se siembran los inóculos, empleando series de 3 y 5 tubos por cada dilución. Esta técnica que es tal vez una de las más sensibles, se puede aplicar a muchos microorganismos. en nuestro caso lo utilizaremos en la búsqueda de Coliformes totales y fecales, E. coli, y Enterococcus como indicadores bacterianos de contaminación fecal y para Staphylococcus aureus, índice bacteriano. EI NMP para S. aureus es especialmente recomendado para el análisis de leche en polvo. EI NMP comprende la prueba presuntiva confirmativa y la completa. Objetivos: 1. Familiarizar al estudiante con la técnica y los medios de cultivos empleados para realizar el NMP de S. aureus. 2. Buscar índices bacterianos en cierto tipo de alimentos.

31 Materiales: Tubos de 20 x 200 mm con 19 ml de caldo de enriquecimiento para Staphylococcus segun Giolitti y Cantoni más 0.1 ml de telurito de potasio al 10%. Cajas de Petri con Agar Baird Parker. Agar al 2% o parafina sólida estéril Pipetas Pasteur Asas de vidrio para extender en superficie. Pipetas serológicas Metodología: Prueba presuntiva: 1. Preparar el alimento en diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3 en solución salina peptonada. 2. Pipetear un ml de cada dilución en tubos con caldo Giolitti y Cantoni, por triplicado. Si el caldo ha sido preparado mucho tiempo atras debe regenerarse (Calentar a 100 C por 20 minutos y enfriarlo). 3. Cubrir la superficie del medio con agar al 2% fundido y enfriado con el fin de hacer anaerobiosis. 4. Incubar a 37 C por horas. 5. Registrar como presuntivamente positivos los tubos que muestren ennegrecimiento del medio. PRUEBA DE LA COAGULASA Realizada con plasma de conejo, donde la producción de coagulasa por parte de Estafilococo induce la coagulación del plasma. Tradicionalmente se ha interpretado como sinónimo de patogenicidad..la capacidad para producir coagulasa y decir, Estafilococo Coagulasa Positivo es hablar de S. aureus, pero se sabe que la coagulasa puede ser producida por otros Estafilococos distintos al aureus (S. intermedius y S. hyicus) y aún cepas

32 de S. aureus no reaccionan positivamente, ya sea porque no la producen o lo hacen en poca cantidad y también por el tipo de plasma y antiocoagulante con que fue tomado. No se recomienda el nitrato porque es metabolizado por la bacteria. COAGULASA EN PLACA Detecta la coagulasa ligada. Haga en solución salina sobre un portaobjetos una suspensi6n de la bacteria y observe si no realiza autoaglutinación, pues algunas cepas rugosas lo hacen. Adicione una gota de igual tamaño de plasma de conejo, mézclelas y' egítelas unos segundos; la prueba positiva se manifiesta por la formación de grumos. COAGULASA EN TUBOS Detecta la coagulasa libre. Se realiza cuando la prueba en placa fue negativa.o la cepa autoaglutinó y existe sospecha que se trata de S. aureus. En un tubo de ensayo de 12 x 75 mm deposite 0.5 ml de plasma de conejo, adiciónele luego 0.5 ml de un caldo donde este creciendo la bacteria y sométalo a incubación en baño María a 37ºC. Prepare un control positivo; realice la lectura cada media hora y. hágalo hasta que el control positivo produzca coagulación. (4 horas más o menos). La intensidad de la reacción se puede clasificar como +, ++, +++ dependiendo de la consistencia del coagulo formado. PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA a. Es confirmatoria y específica del S. aureus. Consiste en la detección de una DNasa estable al calor. b. Transfiera una colonia de Estafilococo a un caldo BHI e incube a 37ºC, si es necesario 18 horas (puede hacerse en 6). c. Caliente el tubo con el crecimiento en agua hirviendo durante 15 minutos y dejélo enfriar.

33 d. En el medio DNasa Test Agar haga perforaciones de 4 mm diámetro suficientemente separadas. e. LLene los pozos con el cultivo calentado y enfriado. Haga un control positivo y otro negativo. f. La lectura de la prueba se realiza al día siguiente y se consideran Termonucleasa positivos aquellos pozos que estén rodeados de un halo rosado que contrastan con el azul del medio de cultivo. g. Este halo es debido que la bacteria tiene DNasa termoestable (termonucleasa) e hidrolizó el DNA que posee el medio de cultivo. RECUENTO DE PSICOTROFOS Tomado de: CARMONA F., ASTUDILLO M, BARONA G Y DAZA L.H. Manual de Bacteriología Especial. Universidad del valle, Facultad de Salud, Departamento de Microbiología, Sección de Bacteriología. Santiago de Cali Las bacterias psicrotrofas son aquellas que tienen la capacidad de crecer a temperaturas de refrigeración y congelación. Bacterias del género Bacillus, Pseudomonas, Enterocococcus, Listeria y algunas enterobacterias psicrotrofas. METODOLOGÍA: El procedimiento de siembra y recuento es igual que para mesófilos, pero la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 5 7ºC durante 7 a 10 días. El resultado se expresa en UFC/ml o gramo de bacterias psicrotrofas.

34 RECUENTO BACTERIANO DE Enterococcus POR LA TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE. INTRODUCCIÓN: Los enterococos son cocos Gram positivos incluidos en el grupo D de los estreptococos; son componentes de la microbiota intestinal del hombre y de los animales, son resistentes al NaCl y a ciertos productos químicos empleados en la industria de alimentos, resisten también bajas temperaturas. Por su alto grado de resistencia se consideran buenos indicadores de contaminación fecal en alimentos crudos y procesados, almacenados en refrigeración y congelación. OBJETIVOS: 1. Dar a conocer a los estudiantes las técnicas y los medios de cultivo empleado para realizar el NMP de Enterococcus 2. Aplicar los indicadores bacteriológicos de contaminación fecal. MATERIALES: a. Los materiales y medios necesarios para hacer las diluciones. b. 9 Tubos con caldo glucosa azida c. 9 Tubos con caldo purpura de bromocresol d. 12 Pipetas de 1 ml. METODOLOGIA: Prueba presuntiva: 1. Preparar la muestra de alimento con los 90 mls de solución salina peptonada y a pariir de ella hacer diluciones hasta Inocular 1 ml de la dilución 10-1, en cada uno de tres tubos que contengan caldo glucosa azida.

35 3. Continuar sembrando 1 ml de cada dilución por triplicado hasta Ilegar a la dilucidn Incubar a 37 C por 24 a 48 horas. 5. Registrar como positivos los tubos que presenten turbidez. Prueba confirmativa: 1. De los tubos positivos de la presuntiva, transferir 1 ml a otro tubo que contenga caldo púrpura de bromocresol azida. 2. Incubar a 37 C por 24 a 48 horas. 3. Considerar como positivos los tubos en los cuales se ha producido un cambio de coloración del púrpura al amarillo. Anotar el número de tubos confirmados en cada dilución. 4. Realizar la lectura con ayuda de la tabla adjunta. RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS INTRODUCCIÓN: Las enterobacterias son una familla que posee varios géneros que tienen corno característica bioquímica general la capacidad de fermentar la glucosa. Por ser un grupo más numeroso que los coliformes, tiene el examen bacteriológico mas amplia cobertura y proporciona un dato más preciso del grado de contaminación que posee un alimento, adquirida generalmente por un proceso de manipulación inadecuado y posterior a la preparación misma del producto. OBJETIVOS: 1. Dar a conocer a los estudiantes las técnicas y los medios de cultivo empleados para el recuento de enterobacterias.

36 2. Medir el grado de contaminación bacteriana de un alimento, tomando como indicadores los géneros de la familia Enterobacteriaceae. MATERIALES: a. Los materiales y medios necesarios para hacer las diluciones. b. Cajas de Petri estériles c. Pipetas de 1 ml graduadas d. Agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis Glucosa e. Agar Glucosa f. Agar Nutritivo g. Reactivo de Oxidasa METODOlOGÍA: 1. Preparar la muestra de alimento y hacer las diluciones. 2. Transferir 1 ml de cada dilución a una caja estéril vacía y depositar en cada una de ellas el Agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis glucosa (15 ml) y practicar los movimientos necesarios para conseguir una perfecta homogenización de la muestra. Dejar solidificar el agar. 3. Seguidamente, cubrir el agar solidificado con 10 ml mas del medio de cultivo; después de endurecida la segunda capa invertir las cajas e incubar a 37 C por 24 horas. 4. AI término de la incubación escoja (a dilución que contenga entre 20 y 200 colonias de color rojo, rodeadas de un halo de precipitado rojizo. EI número de colonias contadas corresponde al dato presuntivo de enterobacterias. Prueba confirmativa:

37 1. Al azar escoger 1 colonia de las características anteriormente anotadas y sembrar en la superficie de Agar Violeta Rojo Neutro Bilis Glucosa. Incubar a 37 C durante 24 horas. 2. Simultáneamente con el paso anterior, sembrar en la superficie de agar nutritivo inclinado, y por punción profunda en 2 tubos de agar glucosa y cubrir uno de ellos con agar al 2% e incubar a 37 C durante 24 horas. 3. Después de la incubación realizar la prueba de Oxidasa utilizando el crecimiento del agar nutritivo. Si ella es negativa y el tubo de agar glucosa que estaba sellado con agar viró a amarillo; indica que hubo fermentación y se confirma que se trata efectivamente de la familia Enterobacteriaceae; la tabla adjunta sirve para identificar los géneros de esta familia. CONTROL DE HIGIENIZACIÓN DEL EQUIPO Método de enjuague : Utilizar un tanque de retención donde se pueda esterilizar casi por completo durante 10' agua de grifo tratada con 2.5. p.p.m. (partes de cioro por millón). Bombear dicha agua de enjuague a través de todo el equipo con el objeto de descubrir fuentes muy pequeñas de contaminación. Técnica: 1. Prepare envases para toma de muestra del agua de lavado; con Tiosufato de sodio estéril al 10%. 2. Transfiera 10 ml de muestra al caldo nutritivo ó a medios diferenciales. 3. Transfiera 1 ml y 0.1 ml a cajas petri. 4. Multiplique el número de colonias de la placa con 1 ml; por el número total de mililitros de agua de enjuague pasado por el equipo,

38 MÉTODO DE CONTACTO CON HISOPO Se aplica cuando no se puede usar el método de enjuague debido al tamaño e irregularidad del equipo. Material: Esterilizar hisopos de algodón. Tubos con solución amortiguada de buffer fosfatos. Preparación: Agregue 1.25 ml de solución madre de fosfatos, agregue 5 m1 de Tiosulfato de sodio al 10% disuelvase en proporciones de 100 gr por litro de H20 destilada. Filtrese mantengase en refrigerador. Técnica: Humedezca el hisopo en la solución amortiguadora, quitando el exceso de agua. Frótese una superficie de aproximadamente 52 cm2 (1.25 de ancho x 40 cm de largo) tres o mas veces. Repita este procedimiento en 5 áreas diferentes usando para cada área un hisopo. Coloque el hisopo en el tubo con la solución amortiguadora cuidando de quebrar asépticamente por encima del algodón el palillo del hisopo. Siembre la solución de enjuague, cuente las colonias. Realización de lectura Notifique como número de unidades formadoras de colonia por ml de muestra. Normas de higienización