MICROBIOLOGÍA ll. Instituto de Tecnología ORT

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1 MICROBIOLOGÍA ll Instituto de Tecnología ORT

2 TRABAJO PRACTICO N 1 ANÁLISIS BACTERIOLOGICO DE AGUAS OBJETIVO: Establecer la potabilidad del agua mediante el análisis bacteriológico de la misma. PRIMER DIA Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas Materiales necesarios por muestra a analizar 6 placas de petri estériles 1 pipeta estéril de 1 ml. 1 punta de pipeta (tip) estéril para micropipeta P micropipeta P ml de medio PCA estéril, fundido y enfriado a 45 C. Estufa de incubación a 37 C Procedimiento Sembrar: 2 placas + 1 ml de la muestra 2 placas ml de la muestra 2 placas ml de la muestra Verter: Incubar: ml de medio PCA, homogeneizar convenientemente. 24 horas a 37 C. Coniformes Totales Materiales necesarios 3 tubos con 10 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, doble concentración. 3 tubos con 9 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, simple concentración. 3 tubos con 9.9 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, simple concentración. 1 pipeta de 10 ml estéril. 1 pipeta de 1 ml estéril Estufa de incubación a 37 C. 1

3 Procedimiento Sembrar: 3 tubos de 10 ml de doble concentración + 10 ml de la muestra de agua 3 tubos de 9 ml de simple concentración + 1 ml de la muestra de agua 3 tubos de 9.9 ml de simple concentración de muestra de agua. Incubar: 37 C por horas. Ausencia de Pseudomona aeruginosa y E. coli en 100 ml de agua Materiales necesarios 1 frasco con 100 ml de caldo lactosado estéril, doble concentración, para E. coli. 1 frasco con 100 ml de caldo verde de malaquita estéril, doble concentración, para Pseudomona. Estufa de incubación a 37 C. Procedimiento Sembrar: frasco de 100 ml de caldo lactosado doble concentración ml de la muestra de agua. Idem con verde de malaquita. Incubar: 37 C por horas. SEGUNDO DIA Lectura de las placas para recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas Informar como: Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml) 2

4 Confirmación de Pseudomona aeruginosa Materiales necesarios 2 placas de petri con medio Agar-Cetrimida 1 ansa rulo Estufa de incubación a 37 C Procedimiento Sembrar: Incubar: Tomar una ansada del crecimiento en los 100 ml del caldo verde de malaquita doble concentración y sembrar por la técnica de agotamiento en superficie sobre una placa de Agar Cetrimida. La segunda placa se utilizará como control de esterilidad del medio. 37 C por 24 horas Confirmación de E. coli Materiales necesarios 2 placas de petri con medio Agar-EMB o Levine 1 ansa rulo Estufa de incubación a 37 C Sembrar: Proceder igual que para Pseudomona aeruginosa. Incubar: Proceder igual que para Pseudomona aeruginosa. Detección de Pseudomona aeruginosa Observación de las placas de Agar Cetrimidda, exposición a lámpara de UV (longitud de onda larga). Es fluorescente. Informar como Presencia o Ausencia. Detección de E. coli (coli fecal) Materiales necesarios Tubos con agar nutritivo en pico de flauta. 1 ansa rulo. Procedimiento: 3

5 Observación de las colonias crecidas en las placas de Agar Levine. A partir de colonias típicas, transferir una porción a medio con agar nutritivo en pico de flauta. TRABAJO PRACTICO N 2 ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE FLUIDA A. Toma de muestra: Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras o los tanques móviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el contenido hasta hacerlo homogéneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en condiciones asépticas en los recipientes de muestreo utilizando para ello un cucharón o tubo de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml. de muestra), estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una temperatura de 0-4 C, y se envían al laboratorio. Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y envían al laboratorio lo más rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 hs. Previamente al análisis, se mezclla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el recipiente o vasija con el fin de lograr una distribución uniforme de los microorganismos en la muestra. B. Preparación de la muestra: Colocar 1 ml. de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml. de agua peptonada 0.1 %. Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes, tomando siempre 1 ml. y transfiriendo este volumen a 9 ml. del medio de dilución. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias según el número de bacterias presentes. C. Metodología de análisis: a. Enumeración de bacterias aerobias mesófilas. b. Enumeración de bacterias coliformes. c. Enumeración de microorganismos psicrotróficos. d. Búsqueda y caracterización de Yersinia enterocolítica. a. Recuento de bacterias totales en la leche Para el recuento de bacterias en la leche, se siguen generalmente 2 métodos: 1- Método microscópico directo. 2- Recuento en placa. 4

6 1- Determinación del número total de bacterias. Método de Breed- Newman El método consiste en contar los microorganismos muertos y vivos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos. Preparación de la película Mezclar bien la muestra por agitación. Leche tal cual. Transferir 0.01 ml. al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm. de lado. Distribuir el material sobre el recuadro, mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto. Secar el extremo al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45 C. Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno / etanol (50: 50) durante 25 a 30 minutos. Luego se seca el extendido al aire. Se lo tiñe con la solución colorante, sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente. Secar cuidadosamente al aire y una vez seco, colocarlo bajo el chorro muy suave de la canilla hasta que ésta no tome color. Secar al aire. Solución colorante Solución madre al 2% de Azul de Metileno ( y fucsina) en alcohol absoluto 96 : Se toman 30 ml. de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1000 ml. de volumen. Examen microscópico La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión. Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml. de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se cuentan como unidades individuales sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre si; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células. Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie. 5

7 Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a dos milímetros de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si la riqueza microbiana es menor de gérmenes se efectuará el recuento de 50 campos. Si es de a gérmenes basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor de gérmenes se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma total de todos ellos. Cálculo Para hacer el cómputo según este método se multiplica el promedio de microorganismos por campo por el Factor Microscópico (FM) y por el número recíproco de la dilución utilizada. RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO / ml o g = Promedio número de microorganismos / campo x FM x Recíproca de la dilución usada Dónde: FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm) FM= 4970 / cm. 2 Determinación del número total de bacterias viables Para determinar el número total de microorganismos mesófilos aerobios, se utilizan 3 diluciones sucesivas elegidas de acuerdo al número de bacterias presumiblemente presentes en la muestra. Se vierte 1 ml. de cada dilución en cada una de dos placas de Petri (6 placas en total) y se agrega el agar fundido para recuento (PCA). Se mezcla hasta lograr una distribución uniforme. Cuando las placas están frías se invierten y se incuban a 37 C durante 48 hs. Se cuentan las colonias que han desarrollado. Para realizar los cálculos se seleccionan las placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas, por el factor de dilución correspondiente y de ahí se deduce el número de bacterias mesófilas aerobias por ml. de leche. b. Determinación de bacterias coliformes b.1 Determinación de bacterias coliformes totales b.1.1 Uso de medio de cultivo sólido Se utilizará para esta prueba el Agar Bilis Rojo Violeta (A.B.V.R) Transferir 1 ml. de leche y 1 ml. de la dilución 1/10 a cada una de dos placas de Petri respectivamente (4 en total). Adicionar 10 o 15 ml. de medio de cultivo por placa, mezclar bien y dejar solidificar. Distribuir luego 3 ó 4 ml adicionales de medio de 6

8 cultivo cubriendo totalmente la superficie solidificada con el fin de inhibir la formación de colonias superficiales. Dejar solidificar. Si se quisiera aumentar la sensibilidad de la prueba, usar 4 ml. de muestra por placa y 14 a 20 ml. de medio de cultivo. Incubar 24 hs. a 37 C. Contar las placas que presenten entre 30 y 150 colonias típicas y expresar los resultados como recuento presuntivo de coliformes por ml de leche. Confirmación de colonias Para la confirmación de coliformes se toman 5 colonias del A.B.V.R y se transfiere cada colonia a tubos conteniendo Caldo Verde Brillante, 2% sales biliares. Los tubos se incuban hs. a 37 C; al cabo de ese tiempo se examina la presencia de gas. Sólo aquellos tubos que muestran producción de gas, son considerados organismos coliformes. El número de coliformes por ml de muestra, se calcula en base a las colonias confirmadas. b Uso de medio de cultivo líquido: Técnica del N.M.P (número más probable) Prueba presuntiva Se utiliza para esta prueba Caldo Verde Brillante, 2 % sales biliares. A partir de la muestra de leche y de las diluciones 1 / 10 y 1 / 100, inocular con cada una de ellas 5 tubos de fermentación. Se agrega 1 ml. de muestra por cada tubo que contiene 5 ml. de medio de cultivo. Incubar a 37 C durante 48 hs. Observar todos los tubos para evaluar la producción de gas, tanto dentro de la campana, o por producción de efervescencia cuando el tubo es agitado vigorosamente. Prueba confirmativa Los tubos que presentan producción de gas, son confirmados por siembra en estría en placas de agar Levine. Incubar las placas durante 24 horas a 37 C. Calcular el número más probable de bacterias coliformes totales por ml. de leche según los resultados de confirmación. Prueba complementaria Aislar colonias típicas de coliformes a partir del agar Levine, y transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 37 C durante 24 hs. A partir de ese inóculo realizar las pruebas I.M.V.I.C para la confirmación definitiva y un extendido para coloración de Gram. 7

9 b.2 Determinación de bacterias coliformes fecales A partir de los tubos de fermentación que mostraron producción de gas en la prueba presuntiva (de cada uno de ellos), inocular con una ansa un tubo de fermentación y uno de caldo triptona. Incubar 44 C ± 0.2 durante hs. Al cabo de 24 hs. de incubación, realizar la prueba del indol en los tubos decaldo triptona. La presencia de gas en los tubos de fermentación y la prueba del indol positiva, confirma la presencia de coliformes fecales. Expresar los resultados como N.M.P de coliformes fecales por ml. de leche. b.3 Determinación de Escherichia coli A partir de los tubos de fermentación de la leche que mostraron producción de gas a 44 C, inocular por estrías, placas de agar levine e incubar durante 24 hs. a 37 C. Examinar las placas para la presencia de colonias típicas de E. coli (colonias de 2-3 mm de diámetro con brillo metálico verdoso a la luz reflejada, con centro oscuro hasta negro en luz transmitida). Si las colonias típicas están presentes, repicar dos colonias por placa a agar nutritivo inclinado. Incubar a 37 C durante 24 hs. Realizar las pruebas I.M.V.I.C para la confirmación definitiva. Examinar además el cultivo por tinción de Gram para confirmar la presencia de bacilos gram negativos no esporulados. c. Determinación de microorganismos psicrotróficos Proceder como en el caso de bacterias viables totales, e incubar a 7 ± 2 C, durante 10 días. Tener especial cuidado en que el medio se haya enfriado a C antes de llenar las placas, para evitar la destrucción de algunas bacterias psicrotróficas. Realizar el recuento de las colonias y expresar los resultados como bacterias psicrotróficas por ml. de leche. Para este ensayo se utilizarán las diluciones 1/10 y 1/100. c. Búsqueda y caracterización de Yersinia enterocolítica Preenriquecimiento no selectivo Transferir 25 ml. de leche a 100 ml. de solución salina de fosfatos tamponada M, ph 2.6. Mezclar e incubar durante 7, 14 ó 21 días a 7 ± 2 C. Enriquecimiento selectivo Transferir 1 ml. de la solución anterior luego de cumplida la incubación, a 10 ml. de caldo Rappaport Verde Brillante Carbenicilina, o a caldo de enriquecimiento Selenito para Yersinia e incubar a 28 C durante 24 hs. 8

10 Aislamiento e identificación Transferir 0.5 ml. del enriquecimiento anterior a 4.5 ml. de KOH 0.5 % en NaCl 0.5%. Mezclar en vórtex y contar 1 minuto. Al cabo de ese tiempo, estriar sobre placas de agar. Incubar a 28 durante 24 hs. Transferir colonias de morfología típica de Yersinia (centro rojo con halo translúcido) a tubos conteniendo caldo Tripticasa Soya, 0.6% extracto de levadura. Incubar a 28 C por 24 horas. Realizar las siguientes pruebas bioquímicas: T.S.I; L.I.A; B.A.M; F.A; movilidad a 23 y 37 C y la fermentación de los siguientes azucares: ramnosa, sacarosa, trealosa, melibiosa y rafinosa. Pruebas in vitro para la detección de cepas virulentas a. Prueba de dependencia al ión Ca a 37 C de Y.. enterocolítica, Sembrar un tubo de caldo tripticasa soya, 0.6 % extracto de levadura e incubar a 28 C por 24 hs. A partir de ese inóculo realizar diluciones convenientes (1 / y 1 / ). Sembrar 1 ml. de cada una de esas dos diluciones en cada una de dos placas de agar MOX (agar magnesio oxalato), y 1 ml. en cada una de dos placas de agar Base Sangre. Incubar a 37 C durante 24 hs. Al cabo de ese tiempo realizar el recuento de colonias y expresar los resultados como se explicó anteriormente. b. Prueba de la autoaglutinación A partir de cultivos en agar inclinado confirmados como Yersinia enterocolítica, estriar en placas de agar Tripticasa Soya para obtener colonias aisladas. Incubar a 28 C durante 24 hs. Una vez crecidas las colonias tomar 9 (3) colonias por placa e inocularlas a tubos con caldotripticasa Soya, 0.5 % extracto de levadura. Incubar a 28 C por 24 hs. Al cabo de ese tiempo inocular 0.5 ml. de cada uno de los tubos a cada uno de dos tubos que contienen caldo Voges Proskauer (10 ml.). Incubar 1 tubo 23 C y el otro a 37 C. Observar los resultados al cabo de 24 hs. de incubación. Sacar conclusiones. D. Antibióticos en la leche: Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibióticos que pueden aparecer eventualmente en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibióticos residuales, pueden producir interferencias en el proceso de fermentación láctica, que se lleva a cabo para la fabricación de quesos y otros productos lácteos. 9

11 Investigación de antibióticos: Un ensayo práctico consiste en calentar 100 ml. de leche en un erlenmeyer, por 2 5 minutos a 83 C para evitar falsos positivos, debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda que la pasteurización reduce pero no elimina completamente. Enfriar a 45 C y agregar una cucharadita de yogur (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophylus). Incubar a 45 C y examinar a las 2,5 3 hs. Si la leche no ha coagulado es posible la presencia de antibióticos. 10

12 TRABAJO PRACTICO N 3 ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE EN POLVO A. Toma de muestra: Para el muestreo, es preferible tomar como muestras los recipientes o paquetes originales, sin abrir; cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomará en un punto cerca del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando primero la capa superficial de polvo con un instrumento esterilizado, y extrayendo después la muestra con una cuchara o varilla esterilizada (la ICMSF recomienda para productos a granel tomar no menos de 30 g). B. Preparación de la muestra: Con una cuchara estéril, mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar asépticamente 10 g. de muestra en un erlenmeyer estéril. Agregar 90 ml. de agua peptona 0.1 % que previamente se ha calentado a no más de 45 C. Agitar hasta disolución de grumos. Las diluciones siguientes (1/100 y 1/1000), se preparan mezclando 10 ml. del líquido de dilución anterior con 90 ml. de agua peptona 0.1%. La mayoría de las leches en polvo, pueden ser disueltas en agua peptona 0.1% o en solución salina de fosfatos tamponada. Las muestras más insolubles (por ejemplo leches con alta acidez) se disuelven bien agregando 1.25% de citrato de sodio al la solución de fosfatos. C. Método de análisis: a. Enumeración de bacterias aerobias mesófilas. b. Enumeración de bacterias coliformes. c. Enumeración de hongos y levaduras. d. Detección de Staphylococcus aureus coagulasa positivos. e. Detección de Salmonella. a. Recuento de bacterias totales b. a 1. Determinación del número de bacterias totales: Método de Breed Newman. Se realiza según lo explicado para leche fluida partiendo de la dilución 1/10. a 2 Determinación del número total de bacterias viables Seguir la técnica detallada anteriormente para leche fluida, utilizando las diluciones 1/10 y 1/ 100. b. Determinación de bacterias coliformes b 1. Uso de medio de cultivo sólido Seguir la técnica detallada anteriormente para leche fluida utilizando la dilución 1/10. 11

13 b 2. Uso de medio de cultivo líquido A partir de la dilución 1/10, sembrar 10 ml. en cada uno de 5 tubos de caldo Verde Brillante, 2% sales biliares doble concentración, y 1 ml. de esa dilución en cada uno de 5 tubos del mismo caldo de concentración simple. De la dilución 1/100 sembrar 1 ml. en cada uno de 5 tubos de los mismos caldos de simple concentración. El total de tubos inoculados es 15. Seguir las técnicas y cálculos detallados anteriormente para leche fluida para la expresión de resultados. b 3. Determinación de coliformes fecales A partir de los tubos de fermentación gas positivos en la prueba presuntiva, continuar la metodología explicada para coliformes fecales en el examen de leche fluida. b 4. Determinación de Escherichia coli A partir de los tubos de fermentación doble concentración que mostraron producción de gas a 44,5 C inocular por estría placas de agar Levine e incubar durante 24 hs. A 37 C. Examinar los resultados para la presencia de colonias típicas de E. coli. c. Recuento de hongos y levaduras A partir de la dilución 1/10, colocar 1 ml. en cada una de 2 placas de Petri. Agregar agar papa glucosa. Antes de preparar la placa, agregar tetraciclina al agar papa para tener una concentración final de 40ppm. Mezclar y dejar solidificar. Incubar a 25 C durante 3 a 5 días. d. Detección de Staphylococcus aureus d 1. Preenriquecimiento no selectivo: Transferir 1 ml. (0.1 g) de la dilución 1/10 a 1 ml. De caldo doble conccentrado Tripticasa Soya. Incubar 2 horas a 37 C d 2. Enriquecimiento selectivo: Agregar 2 ml. de caldo simple concentración Tripticasa soya con 20% de NaCl. Incubar 24 hs. a 37 C. d 3. Aislamiento: Estriar el cultivo anterior en agar Baird-Parker e incubar las placas durante 24 hs. a 37 C Al cabo ese tiempo aislar colonias típicas de Stapylococcus aureus en caldo cerebro- corazón. Incubar los tubos a 37 C durante 24 hs. d 4 Prueba de la coagulasa: Colocar 0.5 ml. de plasma o sangre de conejo o humana citratada diluida al quinto, en suero fisiológico en un tubo de ensayo pequeño. Agregar 0.5 ml. del cultivo caldo cerebro corazón e incubar a 37 C. Paralelamente hacer un blanco sin sembrar, y una siembra con una cepa de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. La aparición de grumos o coágulos al cabo de 1-4 hs. indica que la cepa en estudio es coagulasa positiva. 12

14 d 5. Prueba de la termonucleasa: El resto del cultivo en caldo cerebro- corazón que fue utilizado para la prueba de la coagulasa se calienta a 97 C durante 10 minutos para inactivar otras nucleasas. Se prepara el agar TDA (Azul de Toluidina DNA Agar) y se vierte en placas de Petri. Se realizan luego cavidades con un sacabocado de vidrio previamente flameado. Se toma un volumen suficiente del cultivo inactivado llenando uno o dos orificios realizados en el agar TDA. Incluir un blanco sin sembrar y cepas testigos termonucleasa negativa y positiva. Se incuba la placa a 37 C durante 3 4 horas. Interpretar los resultados. e. Detección de Salmonella: e 1. Preenriquecimiento no selectivo: Pesar en forma aséptica 100 g. de leche en polvo y agregar 900 ml. de caldo lactosado. Incubar 16 hs. a 37 C. e 2. Enriquecimiento selectivo: Tomar 1 ml. del enriquecimiento anterior, e inocularlo en un tubo que contiene 10 ml. de caldo Rappaport. Incubar durante 24 hs. a 42 C. e 3. Aislamiento: A partir del caldo Rappaport, estriar en placas de agar Verde Brillante y agar MLCB (Manitol Lisina Cristal Violeta Verde Brillante). Incubar durante 24 hs. 37 C. e 4. Aislamiento de colonias e identificación bioquímica: Aislar colonias de morfología típica de Salmonella (rosa claro a rosa, opacas o translúcidas en agar Verde Brillante, o colonias grandes con centro negro en agar MLCB) en agar nutritivo inclinado e incubar a 37 C durante 24 hs. Al cabo de ese tiempo de incubación, realizar las siguientes pruebas bioquímicas: TSI, LIA, BAM, citrato de Koser y la fermentación de lactosa, sacarosa, glucosa y manitol en agar Hugh y Leifson. Incubar a 37 C durante 24 hs. e 5 : Tipificación serológica: Realizar la tipificación serológica. Utilizar un cultivo en agar inclinado de 24 hs. de crecimiento. f. Detección de Salmonella (método alternativo). f 1. Preenriquecimiento no selectivo: Reconstituir en condiciones asépticas, 10 gr. de muestra de 100 ml. de agua destilada conteniendo 20 ml. de solución 1% de Verde Brillante. Incubar a 37 C durante 24 hs. f 2. Enriquecimiento selectivo: Transferir 10 ml. del preenriquecimiento anterior a un tubo conteniendo 100 ml. de caldo Verde Brillante, Tetrationato según Mueller Kauffman. Incubar a 43 C, durante 24 hs. 13

15 f 3. Siembra en medios sólidos selectivos: A partir del caldo selectivo según Mueller Kauffman, estriar en placas de agar BPLS (Agar Verde Brillante Rojo fenol Lactosa Sacarosa). Incubar a 37 C durante 24 hs. Las colonias sospechosas de Salmonella son grandes de color rosa pálido sobre fondo rojo en agar BPLS y grandes de color rosa en agar Leifson. f 4. Pruebas bioquímicas: Tomar dos o más colonias sospechosas de cada tipo partiendo de las placas incubadas en agar BPLS y agar Leifson. Inocular por estría y punción tubos con agar TSI ylia. Incubar 24 hs, a 37 C. f 5. Tipificación serológica: Idem método anterior. 14

16 TRABAJO PRACTICO N 4 ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE MANTECA Y MARGARINA 1. Preparación de la muestra y diluciones: Colocar en un tubo estéril y con capacidad para 50 ml. la muestra de manteca o margarina, de forma de no superar el 50% de la capacidad del recipiente. Fundir la muestra en baño de agua a 40 C durante 15 minutos, evitando la separación del suero de la grasa. Transferir con una pipeta precalentada a 40 C, por pipeteado de agua de dilución, 11 gs, del material fundido a un erlenmeyer con 99 ml. de agua de dilución estéril a 40 C (dilución 1/10). Homogeneizar la dilución por agitación vigorosa. Las diluciones sucesivas se efectúan en tubos conteniendo 9 ml. de agua de dilución. 2. Recuento de bacterias coliformes: El medio de cultivo empleado es agar bilis rojo violeta. Sembrar 2,5 ml. de la dilución 1/10 en cada una de dos placas equivalente a una dilución ½. Luego de solidificado el medio, agregar una sobrecapa de 3 a 4 ml. de agar. Incubar 24 hs. a 37 C. Informar el número de bacterias coliformes por gramo de muestra. 3. Recuento de bacterias psicrotróficas: El medio de cultivo empleado es agar para recuento (PCA). Inocular 1 ml. de la dilución 1/10 en cada una de dos placas de Petri. Incubar 10 días a 7 C. Variante: Dado que por lo general las bacterias psicrotróficas son fenil tetrazolio (TTC), se puede practicar un recuento orientativo en forma rápida. El medio de cultivo empleado es agar cristal violeta tetrazolio. Antes de realizar las placas, agregar al medio fundido y enfriado a 45 C 0.5 ml. de TTC 1% por 100 ml. de medio. Incubar 48 hs. a 37 C. Informar el número de colonias psicrotróficas por gramo, considerando como tales a aquellas que reducen el TTC a formazán. 4. Recuento de bacterias proteolíticas: El medio de cultivo empleado es agar para recuento en placa (PCA) con 10 % de leche descremada, que se agrega antes de hacer las placas. Inocular 1 placa con 1 ml. de la dilución 1/10 y una placa con 1 ml. de la dilución 1/100. Incubar a 21 C por 72 hs. Inundar las placas con HCl 1% o ácido acético 10% durante 1 minuto, volcando luego ácido. Informar el número de colonias proteolíticas considerando como tales, aquellas rodeadas por zonas claras. 15

17 5. Recuento de bacterias lipolíticas: Técnica 1 El medio de cultivo empleado es agar tributirina. Sembrar una placa con 1 ml. de la dilución 1/10 y 1 ml de la dilución 1/100. Incubar a C por 3 días. La hidrólisis de la tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias. Informar el número de colonias lipolíticas. Técnica 2 El medio de cultivo empleado es agar grasa de manteca. Utilizar las mismas diluciones que para el agar tributirina. Incubar a C por 4 7 días. Una vez incubado, inundar las placas con 8 10 ml. de solución saturada de CuSO4. Dejar actuar durante minutos y lavar. En la zona de hidrólisis aparece una coloración azul verdosa por la formación de sales cúpricas insolubles de los ácidos grasos liberados en la hidrólisis. Técnica 3 El medio de cultivo empleado es agar Spirit Blue reactivo para lipasas. Usar las mismas diluciones que anteriormente. Incubar a C por 4 7 días. Los microorganismos lipolíticos se reconocen por el desarrollo de una coloración azul debajo de las colonias rodeadas de una zona de lipólisis azul oscura. 6. Recuento de hongos y levaduras: El medio de cultivo empleado es agar papa- dextrosa tetraciclina. Inocular una placa con 1 ml. de la dilución 1/10 y una placa con 1 ml. de la dilución 1/100. Incubar a 21 C por 3 5 días. Informar el número de hongos y levaduras por gramo de muestra. 16

18 TRABAJO PRACTICO N 5 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE QUESO CREMA, QUESO COTTAGE, YOGHURT 1. Preparación de la muestra y diluciones Pesar 11 g del producto en un frasco de boca ancha con tapón esmerilado de 250 ml de capacidad con bolillas de vidrio estériles, agregar 99 ml. de solución estéril de citrato de sodio al 2%, tapar y mezclar por agitación hasta homogeneidad. Para queso crema y yoghurt serán suficiente 3 minutos, para queso cottage puede requerir hasta 10 minutos de agitación. Se realizarán diluciones 1/100 y 1/1000 utilizando tubos con 9 ml. del diluyente. 2. Recuento de bacterias coliformes A partir de la dilución 1/10, inocular 1 ml. del homogenato en agar bilis rojo violeta, con una sobrecapa del agar ( 3 a 4 ml. ). Incubar por 24 hs. a 37 C. 3. Recuento de hongos y levaduras A partir de las diluciones 1/100 y 1/1000, inocular 1 ml. de cada una de ellas en agar papa dextrosa y también en otras dos placas con tetraciclina ( 40 ppm ). Incubar 72 hs. a 30 C. 4. Recuento de bacterias lipolíticas Inocular 1 ml. de cada una de las diluciones 1/100 y 1/1000 en agar tributirina. Incubar a 30 C durante hs. 5. Recuento de bacterias psicrotróficas Inocular 1 ml. de cada una de las diluciones en agar PCA. Incubar 10 días a 7 C. Inocular 1 ml. de cada una de las diluciones en agar cristal violeta tetrazolium. Incubar 48 hs. a 32 C. 17

19 TRABAJO PRACTICO N 6 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE HELADOS Introducción: Los helados y los productos lácteos congelados, son responsables de algunas intoxicaciones e infecciones intestinales. Con la denominación genérica de helados, se entiende a los productos elaborados por la congelación de mezclas líquidas constituidas por leche, leche en polvo, leche condensada, leche evaporada, manteca, crema de leche, zumos o jarabes de frutas, huevos frescos, conservados o en polvo, yemas de huevo, cacao, café, frutas naturales y confitadas, chocolates, colorantes y demás sustancias de uso permitido. Las mezclas deben ser pasteurizadas. El origen de las bacterias y otros microorganismos en los helados, provienen de las distintas materias primas con que se los prepara; los utensilios que se emplean en el manipuleo y cualquier contaminación que puede llegar a ellos durante la preparación. 1. Preparación de la muestra y diluciones. Pesar 11 g. de helado en un erlenmeyer que contiene 99 ml. de agua estéril. Hacer de allí dos diluciones decimales (1/100 y 1/1000) en solución fisiológica. El helado debe estar en estado viscoso para lo cual se lo deja a temperatura ambiente alrededor de 15 minutos, o bien, si está fuertemente congelado se lo deja a no más de 45 C durante 15 minutos. 2. Recuento total de bacterias. La determinación de la carga bacteriana total se hará según la técnica de número total de bacterias viables usada en el análisis microbiológico de leche fluida. 3. Recuento de bacterias psicrotróficas Se utiliza el agar para recuento (PCA) inoculando 1 ml de helado tal cual y 1 ml de la dilución 1/10 en cajas de Petri por duplicado. Incubar 10 días a 7 C. Alternativamente emplear agar cristal violeta tetrazólio con 0,15 ml de TTC por 100 ml de medio. Incubar a 32 C durante 48 hs. Informar el número de colonias psicrotróficas por gramo de muestra. 4. Recuento de bacterias coliformes. Se sigue el método del N.M.P. sembrando tres series de dos tubos en caldo bilis verde brillante al 2% u otro similar partiendo del helado tal cual. Simultáneamente se hacen dos placas colocando en cada una 1 ml de helado y se cubre con agar bilis rojo violeta. En el caso de los helados, las bacterias coliformes no son indicadoras de la presencia de bacterias patógenas, como en el agua. Pueden existir salmonellas, shiguelas y estafilococos provenientes de la materia prima (p. ej: huevos, crema, etc.) 18

20 5. Recuento de Salmonella y Shigella. a) Sembrar por estría el helado tal cual en una caja de agar S.S. Incubar a 37 C durante 24 horas. b) Sembrar por estría el helado tal cual en una caja de agar Verde Brillante. Incubar a 37 C durante 24 horas. c) Sembrar 0.1 ml de helado tal cual en un tubo con 5 ml de caldo selenito. Incubar a 37 C durante 24 horas. Al cabo de 24 horas se observan a) y b), reconociendo las colonias típicas y a partir del caldo selenito se hacen nuevas siembras en los medios S.S. y V.B. Las colonias típicas se repican en el medio B.A.M. o T.S.I. 6. Recuento de Estafilococos patógenos. a) Sembrar por estría el helado tal cual en una caja de agar 110 ó Baird-Parker agar. Incubar a 37 C durante 24 horas. b) Las colonias típicas se repican en agar nutritivo inclinado para hacer la prueba de la coagulasa. 19

21 TRABAJO PRACTICO N 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CARNES Y PRODUCTOS CARNICOS I. Enumeración de bacterias aeróbicas mesófilas. (Recuento aeróbico en placa) 1. Homogenización del alimento Se pesan 25 gr. de la muestra, mezclada asépticamente en una mezcladora esterilizada y se añaden 225 ml de agua peptona 0.1%. Se agita a la velocidad de rpm durante 2,5 minutos como máximo. 2. Dilución: Se mezcla el alimento homogeneizado, agitándolo; se toma 0.1 ml con una pipeta y se vierte en un tubo que contenga 9ml de agua peptona 0.1%; se mezcla cuidadosamente, aspirando 10 veces con una pipeta. Con la misma pipeta se toma 1ml de la primera dilución y se vierte. 3. Preparación de la placas: Se vierte con una pipeta, 1 ml del alimento homogeneizado y de cada una de sus diluciones en cada una de las placas adecuadamente marcadas y por duplicado. Se vierten en cada placa para recuento, 15 ml de agar para recuento que se ha mantenido a 45 C ± 1 C en los 15 minutos siguientes al momento en que realizó la primera medición. Se mezcla bien, y uniformemente la muestra diluida con el medio de agar y se deja solidificar. 4. Incubación: Las placas sembradas se incuban invertidas a 37 C durante 48 horas. 5. Cómputo de las colonias. Cálculo. Se cuentan todas las colonias de las placas de Petri que contengan entre colonias. Se calcula el promedio para cada dilución. El resultado se expresa como bacterias por gramo de muestra. 20

22 II. Enumeración de bacterias psicotrópicas: Aplicar el mismo procedimiento que en 1. Incubar a 20 C durante 4 días. III. Detección de. 1. Homogeneización del alimento: Prepárese tal cual se indica en I Preenriquecimiento: Se vierte asépticamente el alimento homogeneizado (muestra de 25 gr. mezclada con 225 ml de agua peptona tamponada) en un erlenmeyer de 500 ml. Se incuba a 37 C ± 0.5 C por horas. 3. Enriquecimiento: Se vierte 0.1 ml de cultivo preenriquecido en 10 ml de caldo Rappaport. Se incuba a 43 C durante 24 horas. 4. Aislamiento: Se estría el cultivo enriquecido en agar verde brillante y en agar M.L.C.B. (manitol, lisina, cristal violeta, verde brillante). Se incuba a 37 C ± 0.5 C por horas. 5. Confirmación 5.1 Confirmación bioquímica. Se eligen 5 colonias típicas o sospechosas, y se estrían en agar nutritivo. Se incuba a 37 C ± 0.5 C por horas. A partir de este cultivo se inoculan tubos de T.S.I., L.I.A., y B.A.M. 5.2 Confirmación serológica. Se confirman las colonias puras para ver si contienen antígenos sometiéndolas a una aglutinación en platina con sueros mono y polivalentes. IV. Enumeración de Staphylococcus aureus 1. Homogeneización del alimento: Prepárese tal cual se indica en I

23 2. Dilución Prepárese tal cual se indica en I Inoculación Sobre la superficie de las placas con agar Baird-Parker, previamente secas, se vierten con un pipeta, 0.25 ml del homogeneizado y de sus diluciones. Se extienden con una espátula de Drigalsky. De cada dilución deben prepararse placas por duplicado. 4. Incubación Las placas invertidas se incuban a 37 C por 48 horas. 5. Cómputo de las colonias (Presuntas S. aureus) Transcurridas las 48 horas se eligen placas conteniendo entre colonias típicas, éstas son las presuntas colonias de S. aureus. Se someten todas ellas (o un número importante), a la prueba de la coagulasa. Las colonias de algunas cepas de S. aureus, pueden no tener el aspecto de colonia típica ya descripto. Por consiguiente, las colonias sospechosas deben, también, someterse a la prueba de la coagulasa. 6. Confirmación. Prueba de la producción de la coagulasa Las colonias sospechosas de contener S. aureus se pasan a tubos de ensayos que contienen 5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Se incuban a C por horas. Se toman 0.1 ml de la proliferación resultante y se añade a 0.3 ml de plasma de conejo rehidratado contenido en tubos pequeños y se incuban a C. Se examina el tubo a las 6 horas, para ver si se han producido grumos; la formación claramente perceptible de un grumo, es una prueba de la actividad de la coagulasa (3+), si se coagula todo el contenido del tubo, y no se desplaza al invertirlo, la reacción es (4+). Una reacción 3+ ó 4+, se considera como identificación positiva del S. aureus. 7. Cómputo de las colonias El número de S. aureus puede calcularse basándose en el número de colonias confirmadas respecto del número total de colonias (típicas y sospechosas). Se multiplica después por 4 (0.25 ml extendido) y por el factor de dilución. 22

24 V. Enumeración de anaerobios reductores de sulfito (Técnica del número más probable NMP) 1. Homogeneización del alimento: Prepárese tal cual se indica en I Dilución Prepárese tal cual se indica en I Inoculación: De la muestra así preparada se siembran tubos de agar SPS (Agar sulfito polimixina sulfadiacina) de la siguiente forma: Dos tubos con 1 ml de la dilución 1/10. Dos tubos con 1 ml de la dilución 1/100. Al sembrar, tener la precaución de introducir la pipeta hasta el fondo del tubo. Comenzar a eliminar el volumen de homogenato o dilución indicado, a medida que se va retirando la pipeta y describiendo círculos para homogeneizar. 4. Incubación: Los tubos preparados se incuban a 37 C por 72 horas. 5. Cálculo (NMP) Se indica el número más probable por gramo de muestra de acuerdo al número de tubos positivos. Se consideran tubos positivos a los que presentan desarrollo de colonias negras. 23