FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

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1 FERMENTACIÓN DE AZÚCARES Fundamento: determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono específico incorporado a un medio base, produciendo ácido, o ácido con gas visible. Se emplea caldo nutritivo (medio base) adicionado del hidrato de carbono a probar. Cuando el indicador utilizado es azul de bromo timol, se considera: Producción de gas en la campana de Durham: (+) gas: El desalojo de aproximadamente 1/3 de líquido en la campana de Durham basta para registrar la producción de gas. Microorganismo aerogénico. (-) gas: el microorganismo es anaerogénico (no se observan burbujas de gas).

2 HUGH-LEIFSON Fundamento: permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo (generalmente se utiliza glucosa como sustrato) Algunas bacterias pueden: -oxidarla completamente convirténdola en CO 2 y H 2 O (generalmente aerobios estrictos), -fermentar anaeróbicamente la glucosa (anaerobios obligados), -metabolizarla por ambas vías (anaerobios facultativos), o -ser incapaces de utilizar la glucosa. Oxidación Fermentación Ni fermentación ni oxidación Aerobio Anaerobio facultativo Anaerobio Obligado También se puede determinar: -producción de gas -movilidad Indicador: Azul de bromo timol

3 PRUEBA AGAR TRIPLE AZÚCAR HIERRO (TRIPLE SUGAR IRON; TSI) Fundamento: el principio de esta prueba es determinar la capacidad de un microorganismo para utilizar 1 a 3 hidratos de carbono, generar gas y, producir H 2 S. Las fermentaciones de azúcares son características de los grupos, géneros o especies bacterianas, sobre todo entre la familia Enterobacteriaceae, ayudan a determinar género. Fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa: pico de flauta: amarillo profundidad: amarillo. Si el microorganismo es aerogénico: hay producción de CO2 e H2 No fermenta glucosa, sacarosa ni lactosa (para organismos no entéricos): superficie alcalina: color rojo profundidad: color rojo. Si utiliza solamente glucosa: pico de flauta (superficie): reacción alcalina (color rojo) (metabolismo oxidativo y uso de NH 3 ) profundidad: reacción ácida (amarillo) (metabolismo fermentativo) Hay precipitación del FeS de color negro Indicador: Rojo de fenol

4 PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER (VP) Y ROJO DE METILO (RM) Se utiliza el medio de Clark y Lubs que es una solución buffer de peptona glucosada. VOGES-PROSKAUER (VP) Fundamento: algunos microorganismos producen acetil metil carbinol (acetoína), intermediario en la producción de 2,3-butanodiol a partir de la fermentación de glucosa por vía butilenglicólica. acetoína y 2,3-butanodiol Oxidados O 2, álcali diacetilo Guanidina (peptona) alfa-naftol creatinina (+): color rojizo oscuro: acetoína. (-): color amarillo. ROJO DE METILO (RM) Fundamento: capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa (vía ácido-mixta) y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. En Clark y Lubs se agregan 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo. (+): color rojo definido (ph 4.4) (-): color amarillo (ph 6)

5 PRUEBA DE UTILIZACIÓN DEL CITRATO Fundamento: esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Este medio contiene azul de bromotimol como indicador de ph. citrato oxalacetato + 2 formato oxalacetato piruvato + CO 2 (+): crecimiento con viraje al azul intenso en el pico de flauta (a veces todo el medio). (-): crecimiento ni cambio de color del medio (permanece verde).

6 PRUEBAS A REALIZAR EN MEDIO SIM (SULFURO DE HIDRÓGENO, INDOL, MOVILIDAD) SH 2 Fundamento: determinar si un microorganismo es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática sobre los aminoácidos que contienen azufre (metionina, cistina, y cisteína).se emplea un medio con peptona, sulfato de hierro y amonio. S 2 O 3 = red H 2 S H 2 S + Fe 3+ SFe (negro) (+):coloración negro-parduzca en la línea de punción (con difusión cuando el microorganismo es móvil) (-): no hay cambio de color INDOL Fundamento: determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el triptofano produciendo indol. Para la realización de la prueba se utilizan medios a base de peptona, dentro de cuyos aminoácidos se encuentra el triptófano. Peptonas triptofanasas Indol (triptofano) Indol + p-dimetilaminobenzaldehído (Rvo de Kovacs) (+): anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica (-): toma el color del reactivo (amarillo) MOVILIDAD Fundamento: muchos microorganismos poseen flagelos, que son responsables de su movilidad, la que se puede poner de manifiesto por observación en fresco, o bien, sembrando en agar blando y observando el crecimiento. (+):crecimiento por debajo de la línea de punción. En caso de microorganismos muy móviles el medio queda totalmente turbio (-): el crecimiento se circunscribe a la línea de punción

7 REDUCCIÓN DE NITRATO Fundamento: determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitritos, amoníaco o nitrógeno libre. Esta reducción tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias ya que la enzima que interviene, la nitratasa, es sensible al oxígeno. En estas condiciones el microorganismo obtiene el oxígeno del nitrato, siendo este proceso de oxidación una respiración anaerobia Medio: Caldo nutritivo + KNO 3 Campanita de Durham Nitrógeno: se evidencia por la presencia de gas en la campanita. Amoníaco: reactivo de Nessler a la alícuota restante del cultivo. (+): color rojo ladrillo Nitrito: reactivo de Islova van Islovay (ácido sulfanílico y alfa-naftilamina) reacciona con el grupo nitrito compuesto diazoico parasulfobenceno-azo-alfanaftilamina (+): rosado o rojo intenso

8 Fundamento: PRUEBA DE FENILALANINA FENILALANINA desaminación oxidativa FENILPIRUVICO + FeCl 3 al 10% (+): produce un color verde por formación de compuestos coloreados debido a la presencia de ácido fenilpirúvico. (-): no se observa cambio de color. PRUEBA DE LA UREASA Fundamento: permite determinar la capacidad de un microorganismo para hidrolizar la urea, por acción de la enzima ureasa. El ph óptimo para la actividad de la enzima es 7. (H 2 N 2 )C=O + H 2 O ureasa CO 2 + 2NH 3 (+): viraje del indicador del amarillo (rojo fenol) al rojo violáceo o púrpura. (-): amarillo pálido

9 Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios Citocromo citocromooxidasa PRUEBA OXIDASA H 2 O 2 o H 2 O El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametilp-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. PRUEBA DE LA CATALASA Fundamento: la mayoría de los microorganismos tienen la propiedad de producir la enzima catalasa, la que desdobla el agua oxigenada liberando O 2. 2 H 2 O 2 catalasa 2 H 2 O + O 2 La actividad de la enzima se pone de manifiesto adicionando unas gotas de agua oxigenada sobre una colonia en medio sólido o un cultivo en caldo. (+): desprendimiento de gas con formación de burbujas. (-): no se observan burbujas.

10 PRUEBA DEL FACTOR CAMP-REVERSO Pone en evidencia el efecto sinérgico entre las hemolisinas de C. perfringens y S. agalactiae (group B). En un agar sangre sembrar una cepa de Streptococcus agalactiae como una estría recta central. Perpendicularmente, sembrar una estría recta de C. perfringens. Incubar en anaerobiosis. Un resultado positivo se observa por una zona de hemólisis en punta de flecha en la unión de las 2 estrías. AGAR YEMA DE HUEVO (EYA) triglicéridos Lipasa glicerol + ác. grasos libres opacidad con brillo iridiscente sobre las colonias lecitina Lecitinasa diglicérido + fosforilcolina opacidad visible alrededor de la colonia A diferencia de lecitinasa, la lipasa no es difusible y la reacción ocurre sólo en la vecindad de las colonias.

11 LIPASA Y LECITINASA: DÓNDE CORTAN? TG glicerol + ác. grasos libres ( producto no difusible) Lecitinasa Lecitina diglicérido + fosforilcolina (difusible)

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13 Prueba de lipasa Agar yema de huevo (EYA) Positivo: (Halo iridiscente o perlado alrededor de las estrías) Negativo Soria J. M.Trab. Final Biol. Mol. 2013

14 Prueba de lecitinasa Lecitinasa = fosfolipasa C = alfa toxina (disuelve lípidos de membrana) Reacción de NAGLER = neutralización de lecitinasa Agar yema de huevo (EYA)

15 Prueba de lecitinasa en agar EYA Clostridium perfringens Microorganismo no productor de lecitinasa

16 Reacción de NAGLER positiva

17 DIGESTION DE LA CARNE Fundamento C. perfringens sintetiza proteasas, colagenasas, hialuronidasas y otras enzimas que pueden producir la degradación del tejido muscular. Esto se pone en evidencia cuando se cultiva en medio carne cocida. (+): Partículas de carne desintegradas o en forma de polvo. Se observa producción de gas evidente por elevación del émbolo de vaselina. HIDRÓLISIS ALMIDON Fundamento Algunos microorganismos anaerobios se caracterizan por producir la enzima amilasa que hidroliza almidón. Se emplea Agar infusión de corazón + Almidón soluble. Para saber si el almidón ha sido hidrolizado o no, se utiliza el reactivo iodo/ioduro (lugol) que en presencia de almidón forma un complejo de color oscuro (azul o marrón). (+): una zona incolora alrededor del desarrollo indica hidrólisis del almidón (-): una zona oscura a púrpura, indica que no hubo hidrólisis

18 DIGESTIÓN DE LA CARNE -Medio carne cocida -VasPar -Incubación 21 días -Resultado positivo: -pulverización de la carne -producción de gas

19 SISTEMA API DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -. Básicamente consta de 21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta.

20 A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 ml de solución salina (1% de NaCl) o 5 ml de agua estéril. Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos. Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Incubar a 37 C durante h. La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo. Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para realizar esta operación hay programas informáticos.

21 La sigla IMV i C incluye cuatro pruebas: Son un conjunto de reacciones empleadas comúnmente en la identificación de miembros de la familia enterobacteriaceae. I = Prueba del Indol; M = Prueba de Rojo de Metilo V = Prueba de Voges-Proskauer C = Prueba de utilización de Citrato E. coli (++--) El principal objetivo del Manual es asistir a la identificación de bacterias e indicar las relaciones que existen entre los distintos grupos. Publicado en 1982, corresponde a la 9 edición y consta de 4 subvolúmenes. Estos son: Gram negativos de importancia general, médica o industrial Gram positivos (excluyendo actinomycetes) Archaebacteria, cyanobacteria y el resto de gram negativos Actinomycetes Las claves para ingresar correctamente al Manual Bergey son: Tipo de metabolismo Forma y disposición celular Coloración de Gram MANUAL BERGEY Esto conducirá a la acertada elección de 1 de los 4 subvolúmenes.

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