SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM

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1 MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº65 BLGO. ELIZABETH ANAYA RAMÍREZ DRA. CECILIA MORÓN CORTIJO BLGO. PATRICIA ARIAS PAREDES T.M. JOHANN CHAUCA TORRES TÉC. LAB. RAÚL ROMÁN CUÉLLAR 2007

2 I. IDENTIFICACION Código del proyecto OGITT: Centro de Referencia: Centro Nacional de Salud Pública Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas Título del Proyecto: Serodiagnóstico de Rickettsiosis por prueba ELISA e Inmunofluorescencia IFI IgM Autores: Blgo. Elizabeth Anaya Ramírez Dra. Cecilia Morón Cortijo Blgo. Patricia Arias Paredes T.M. Johann Chauca Torres Téc. Lab. Raúl Román Cuéllar Lugar de ejecución: Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud Año de ejecución:

3 II. RESUMEN Objetivo: Implementar y validar una prueba ELISA e IFI IgM para rickettsiosis, demostrar la detección temprana de anticuerpos IgM en pacientes agudos y contribuir con el diagnóstico diferencial de etiologías con cuadro febril indiferenciado. Material y Método: Para éste estudio se aplicó una modificación del método IFI utilizado en el Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud, descrito en el Manual de Referencia del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas UTMB (1) y una modificación del método ELISA descrito en McDade et al, 1988 (2). Se tomaron 55 sueros negativos y 100 sueros positivos de pacientes procedentes de la seroteca del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del INS. Finalmente se seleccionaron 15 sueros de pacientes con diagnóstico serológico confirmado para otras enfermedades bacterianas como brucelosis, leptospirosis y sífilis. Se utilizó como antígeno para la prueba ELISA un lisado total del referencial Rickettsia akarii cepa Kaplan y para la prueba IFI fueron células Vero infectadas con R. akarii cepa Kaplan proporcionadas gentilmente por el Dr. D.Walker del UTMB-Galveston-Texas-EUA. Resultados: La prueba ELISA indirecta IgM mostró una Sensibilidad de 78% (78/100), una Especificidad de 80% (44/55), un VPP de 87.6% (78/89), un VPN de 66.7% (44/66) y una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 20% (3/15), mientras que la prueba de Inmunofluorescencia IFI IgM mostró una Sensibilidad de 82% (82/100), una Especificidad de 90.9% (50/55), un VPP de 94.3% (82/87), un VPN de 73.5% (50/68) y una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 13.3% (2/15). Conclusiones: El método ELISA indirecta IgM estandarizado en el presente trabajo no es una prueba útil para ser aplicado en el diagnóstico de rickettsiosis debido a su limitada sensibilidad y especificidad, sin embargo; la prueba IFI IgM presenta una mejor sensibilidad (82%) y especificidad (90.9%) lo que indica que puede ser utilizada en estudios epidemiológicos y en la vigilancia de la Rickettsiosis en el Perú..

4 III. INTRODUCCION La rickettsiosis es una enfermedad causada por una bacteria coco bacilar gram negativa, intracelular obligatoria y pertenece al grupo de las patologías bacterianas metaxénicas porque dentro del ciclo biológico está involucrado un artrópodo (3,4). La bacteria pertenece al género Rickettsia y se caracteriza por ser intracelular obligatoria. Estos microorganismos mueren al separarlos de la célula huésped (4,5). En la última edición del Manual de Bergey (6), las rickettsias están clasificadas de la siguiente manera: Phylum BXII Proteobacteria phy. nov, Orden II Rickettsiales, Familia I Rickettsiaceae, Genero I Rickettsias. El género Rickettsia está clasificado es base a proteínas de superficie inmunodominantes rompa y rompb (proteínas externas de membrana A y B) permite la diferenciación de dos grupos; el grupo de las fiebres manchadas (SFG) y el grupo tifus (TG). El gen que expresa rompa se ha identificado en casi todas las especies del SFG y no se ha encontrado en el TG (3,4,7). Los vectores involucrados en la transmisión de la enfermedad son las garrapatas, ácaros, piojos corporales humanos y pulgas, estos artrópodos son ectoparásitos de animales asociados con el hombre como animales domésticos y roedores (3,4,5). La enfermedad está relacionada a las condiciones en que habita el ser humano, esto se refleja en ocurrencia de epidemias explosivas de tifus epidémico cuando las condiciones socio culturales son precarias como en época de guerra, pobreza, hacinamiento, etc (3,8,5). Perú reporta mas del 50 % de los casos notificados de Tifus epidémico a nivel mundial procedentes de zonas endémicas de la sierra sur y central, en los departamentos de Cuzco, Apurimac, Ayacucho, Puno y Arequipa confirmados por exámenes de laboratorio (9,10), teniendo como causas principales: las condiciones precarias en que viven los pobladores de nuestras provincias y las deficientes medidas del control de brotes o endemias (11), estudios posteriores han determinando la importancia de las pulgas, piojos, garrapatas y ácaros en la transmisión de las rickettsiosis (12). Desde 1999 se ha reportado casos de rickettsiosis en nuevas zonas de Perú (13,14) que incluyen zonas de altura, áreas tropicales y semitropicales. Anticuerpos de clase IgM pueden ser detectados a partir de la primera semana de fase aguda de la enfermedad por lo cual es

5 necesario contar con métodos apropiados de diagnóstico como IFI y ELISA IgM, procedimientos altamente sensibles y específicos (15,16). Rickettsiosis es una enfermedad metaxénica emergente y reemergente en diferentes zonas de Perú, con cuadro febril indiferenciado por lo que es importante que sea considerado como un diagnóstico diferencial de etiologías como, dengue, leptospirosis, bartonelosis, influenza entre otras, donde es necesario considerar el incremento de febriles negativos a etiologías endémicas de la zona, así como la presencia de vectores potencialmente infectivos para la transmisión de rickettsiosis (piojos, pulgas, garrapatas y ácaros). La detección de anticuerpos IgM por ELISA e IFI aún no ha sido implementada en el país para la captación de casos agudos de rickettsiosis, debido a que los anticuerpos IgG presentes en la muestra sérica actúan competitivamente con los anticuerpos IgM dando como resultado falsos positivos, por lo que se hace necesario aplicar sistemas de pre tratamiento óptimos a los sueros a fin de evitar falsos positivos (21). Las enfermedades asociadas a Rickettsias como por ejemplo Grupo Tifus y Grupo de Fiebres Manchadas, constituyen causas importantes de morbi-mortalidad alrededor del mundo. En México, en un brote de una enfermedad febril aguda no determinada al inicio, que parecía compatible con dengue, se realizo una investigación que demostró la existencia de una infección por Rickettsias del Grupo Fiebre Manchada (17,18). La presentación clinica de Rickettsiosis del Grupo Tifus y sobre todo Fiebre Manchada es poco especifica lo que puede llevar a confusion en el diagnostico diferencial con otras infecciones que existen en áreas endémicas del país como dengue, leptospirosis, influenza, fiebre tifoidea, etc. Los síntomas y signos del tifus y en general de las demás rickettsiosis son variados y dependen del órgano afectado asi como de la liberación de citoquinas en el torrente sanguineo. Fiebre, tos, cefalea, escalofríos, mialgias, artralgias, anorexia, vómitos y dolor abdominal ocurren en diferentes proporciones en los pacientes afectados por tifus. Otros síntomas y signos incluyen la presencia de brotes cutáneos maculopapulares, purpúricos y petequiales; síntomas asociados con el SNC tales como convulsiones, ataxia, fotofobia; hepato/esplenomegalia e ictericia también se pueden presentar. Todos estos síntomas son inespecíficos, y por tanto el diagnóstico preciso descansa en criterios claves clínicos y epidemiológicos, los cuales son confirmados por el laboratorio (19).

6 El diagnóstico de laboratorio del tifus se ha basado históricamente en la serologia, inicialmente con la aglutinación con Proteus vulgaris cepa OX-19 cuya sensibilidad y especificidad es muy baja. Pruebas serológicas más específicas incluyen la inmunofluorescencia indirecta (IFI), e inmunoperoxidasa, consideradas como gold standard para el diagnóstico serológico de tifus y rickettsias en general. Un título de 1:64 es considerado el valor mínimo para diagnóstico presuntivo de infección por rickettsia. Criterios para un diagnóstico de infección reciente por rickettsia son: (a) un aumento del título serológico al cuádruple del valor obtenido con la primera muestra; (b) un título mayor o igual de 1:256 en la etapa aguda. El número real de casos de tifus no se conoce debido en parte a la dificultad en el diagnóstico clínico, puede ser confundida con otras enfermedades como influenza, dengue, fiebre tifoidea, malaria, leptospirosis, arbovirus, enterovirus, arenavirus, entre otros. Aún en áreas en donde infecciones por tifus son bien conocidas por la comunidad médica, el diagnóstico clínico correcto inicial de tifus se hace solo en 5 a 10% de casos (20). La prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) es la prueba gold estándar de las pruebas serológicas, permite detectar anticuerpos IgG, IgM o ambas. Las infecciones por Rickettsias del SFG y TG no son diferenciadas por esta prueba; existe reacción cruzada entre ambos grupos. La prueba demostró tener una especificidad del 100% y una sensibilidad del 84.6% (22). Otra técnica descrita para el diagnóstico de rickettsiosis, es una ELISA de tipo indirecta (23,24,25,26), donde la mayor complejidad radica en la producción del antígeno (8), debidoa que los métodos descritos, exigen separación total de Rickettsias de la célula huésped por métodos de separación con gradiente de densidad con Renografina (27,28,29). La Renografina es un compuesto formado por diatrozoato de meglumina, diatrozoato de sodio utilizado para dar un contraste idóneo en radiografías a las vías urinarias y exploraciones angiografías (30), también ha sido utilizado para el aislamiento de clamidias y mitocondrias (28). Este método logra separar 3.3mg por huevo embrionado, 0.27mg por frasco de cultivo celular de Rickettsia typhi y Rickettsia prowazekii del huésped eucarionte, y resulta sumamente costoso (29).

7 Las técnicas de separación con gradiente de sucrosa también han sido probadas, la eficiencia del método es nula debido a que en el proceso se pierde la capacidad antigénica de la bacteria (27,29). Por otro lado, técnicas menos sofisticadas de separación no han sido probadas. Este mismo problema esta presente en la purificación de varios tipos de virus, es por eso que se han publicado técnicas basadas en centrifugaciones progresivas a diferentes gravedades, las cuales logran separar parcialmente el virus del huésped eucarionte para luego usar este extracto purificado utilizado en inmunoensayos como la prueba ELISA (31). Los ELISA que usan antígeno purificado presentan una alta sensibilidad a diluciones de suero de hasta 1/10000, además de ser mas sensible que técnicas como Micro aglutinación (MA) y Fijación de Complemento (CF) por solo necesitar una concentración de 0.5 ug/ml de antígeno (24), también se reporta que aunque ELISA es más sensible, la prueba IFI es más específica (23, 25, 32). Si bien existe una prueba ELISA para diagnostico de Rickettsiosis, aún no se ha probado con antígeno total lo cual reduciría enormemente el costo de la prueba. Las técnicas en nuestro país para el diagnostico de esta enfermedad son poco desarrolladas y no se ha realizado la estandarización de una prueba ELISA indirecta ni IFI IgM con antígeno crudo total. Es importante resaltar que el presente trabajo tiene importancia en la epidemiología de la enfermedad, además de reforzar la vigilancia en zonas endémicas del país.

8 IV. MATERIAL Y METODOS: Material biológico: La cepa de Rickettsias utilizada en el estudio es de una Cepa Referencial de Rickettsia akarii del Laboratorio Referencial de la UTMB (University Texas Medical Branch) Sueros: Se seleccionó 100 sueros positivos de pacientes con rickettsiosis de diferentes áreas geográficas del Perú y remitidos al Instituto Nacional de Salud, procedentes de la seroteca del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas (INS). Todos fueron diagnosticados positivos para anticuerpos IgTotal (IgM+IgG+IgA) contra al antígeno rickettsial con la prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Los sueros negativos (n=55) fueron seleccionados de pacientes que fueron negativos para IFI tanto para anticuerpos IgTotales como para IgG contra antígeno rickettsial. Conjugado: Conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado a peroxidasa (SIGMA) para la prueba ELISA y conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado a isotiocianato de fluoresceína-fitc (CALBIOCHEM) para la prueba IFI. Producción de antígeno rickettsial: Se utilizó cultivos celulares VERO incubados a 37 C (incubadora, MEMMERT) en frascos para cultivo celular de 75 cm 2 (FALCON) con una monocapa formada en un 80% (ver Fig. Nº1) enriquecida con medio EMEM (Medio Mínimo Esencial con sales de Earles, GIBCO) y 10% de suero bovino fetal (SBF). Se retiró el medio y se añade una suspensión de antígeno Rickettsia akarii reconstituida en un 1ml de agua destilada estéril y diluida 1:15 en buffer sucrosa fosfato glutamato estéril o, cultivos positivos criopreservado. Incubar a 34 C por 1 hora, agitando suavemente cada 15 min., agregar medio EMEM con 5% SBF sin antibiótico e incubar a 34 C por 7-10 días (3). Monitorear el cultivo con ayuda de un microscopio de luz invertida (CARL ZEISS) hasta observar efecto citopático (ECP) en % (ver Fig. N 2), desprender las células infectadas con tripsina (GIBCO), y centrifugar por 10minutos a 5000 rpm, recuperar el pellet, resuspender en PBS y centrifugar. Repetir el proceso 2 veces mas (5). Finalmente el pellet se diluye en PBS 1X y se hace un conteo de células en microscopio de luz invertida (400x) con Cámara de Neubauer (ver Fig. N 3).

9 El antígeno rickettsial crudo fue procesado según Cruz y col. (31), sin embargo, la ruptura celular fue realizada por sonicación con seis toques de 10 segundos cada uno con intervalos de 10 segundos a 4 ºC., centrifugar a 2000 rpm, separar el sobrenadante para inmufluorescencia y determinación de concentración proteica por método de Lowry (33). Fig.N 1: Cultivo normal de células VERO. A 400x. Fig.N 2: Cultivo infectado de células Vero con Rickettsia akarii. A 400x. Figura N 3. Cámara de Neubauer usada para conteo celular. Titulación de antígeno: Se prepararon diferentes diluciones de antígeno con PBS ph 7.2 y se utilizaron microplacas para ELISA Polysorp (NUNC NALGENE) de 8 x 12 pocillos de fondo plano, donde se dispenso 100μL de las diluciones del antígeno. Se incubaron 24 horas a 4 C (23,24). Luego de la incubación se elimino el excedente de las diluciones y se guarda a -20 C. Titulación del suero: Se diluyó los sueros controles con PBS Tween-20 al 3% de leche descremada. Las diluciones se dispensaron 100 μl a cada pocillo. Se incubaron por 30min. a 37 C y se lava por 6 veces (24). Titulación de conjugado: Se prepararon las diluciones con buffer PBS Tween-20 al 3% de leche descremada (24), se incubaron por 30min.a 37 C y se lavaron seis veces, se agregó el sustrato o

10 fenilendiamina (OPD) con peroxido de hidrógeno diluido en buffer citrato y se incubaron 15min.a temperatura ambiente (24). Se agregó solución de parada ácido sulfúrico 1M y se leyó a 490nm en un lector para ELISA ThermoLabsystem. Prueba de Inmufluorescencia Indirecta IgM: Descongelar las láminas 30 min. antes de realizar la prueba. Diluir el suero del paciente en buffer PBS 1:4, tomar un volumen de ésta dilución y diluir 1:4 con el reactivo Diluyente IgM PreTreatment (FOCUS), incubar a temperatura ambiente por 15min, centrifugar y diluir 1:4 con PBS + skim milk 3% y agregar 10ul del suero diluido a cada círculo de la lámina e incubar en cámara húmeda a 37 C por 30min. Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS ph 7.2 por 10 minutos cada vez, dejar secar a temperatura ambiente o por 5 min. a 37 C, una vez seco agregar 10μL del conjugado (diluido 1:10) por cada circulo de la lamina incubar por 30min. en cámara húmeda a 37 C. Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS ph 7.2 por minutos cada vez. Dejar secar y realizar el montaje para observar al microscopio de inmunofluorescencia con objetivo 40x (LEICA DMLS). Ensayo ELISA IgM: Se diluyeron los sueros en buffer diluyente (ver anexo), se dispenso 100 μl en cada pocillo de la placa (Polysorb, NUNC nalgene) y se incubaron por 30 min. a una temperatura de 37 C, lavar seis veces con 300 μl de buffer de lavado (ver anexo) por cada lavado en un lavador automático (Thermolabsystem). Se agrego 100μL de conjugado diluido en buffer diluyente, se incubo por 30 min. a una temperatura de 37 C (24). Finalmente, agregar 100μL de sustrato, incubar por 15 min. a temperatura ambiente y agregar la solución de parada (ver anexo)(24). Se leyó a 490nm en un lector ELISA Thermolabsystem. ANALISIS DE DATOS: Obtenidas las lecturas, se procedió a analizar los datos para obtener los valores de Especificidad, Sensibilidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo de la prueba, aplicando las siguientes fórmulas:

11 PRUEBA (ELISA IgM PRUEBA REFERENCIA (IFI IgTotal) / IFI IgM) POSITVO NEGATIVO TOTAL POSITIVO a b a+b NEGATIVO c d c+d TOTAL a+c b+d n Tabla Nº 1. Modelo de Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM e IFI IgM. Sensibilidad (Se): Es la probabilidad de que la prueba de resultado positivo cuando la enfermedad esta presente (34,35). Se positivos a a positivos falsos negativos c Especificad (Sp): Es la probabilidad de que la prueba de resultado negativo cuando realmente no existe la enfermedad (34,35). d negativos Sp negativos ( d) falsos positivos b Valor Predictivo Positivo (VPP): Es la probabilidad de presentar la enfermedad cuando es positivo a la prueba (34,35). VPP positivos a a positivos falsos positivos b

12 Valor Predictivo Negativo (VPN): Es la probabilidad de estar sin la enfermedad cuando eres negativo a la prueba.(34,35) VPN negativos negativo ( c) c falsos negativos d Valor de Corte ( VC ): Se procedió a realizar el cálculo del Valor de corte en base a las lecturas de los controles negativos y positivos obtenidos, aplicando la siguiente fórmula: VC= XCN + 2DS

13 V. RESULTADOS V.1. Producción del antígeno Rickettsial: se observó que lisar las células con sonicador es mejor que siguiendo el protocolo original shock térmico (31). Para elegir la dilución de antígeno apropiada se obtuvo 70.37µg/mL de concentración proteica con una producción en masa de antígeno de R. akarii. V.2. Titulación del antígeno y suero: Se probaron 3 diferentes diluciones seriadas (Tabla Nº2), de las cuales se obtuvieron valores de densidad óptica (OD) del pool de sueros positivo y del pool de sueros negativos. Para determinar la mejor dilución se dividió el valor del OD del pool de sueros positivos entre el valor del OD del pool de sueros negativos, y obtener el valor (ratio) que represente la dilución optima a la cual el valor del OD del pool positivo se separa mas del valor del OD del pool negativo, reportándose que la dilución optima del antígeno fue 1/50 con un ratio de 3.27 con una dilución de suero de 1/50. (Tabla Nº2). DILUCIONES DE SUERO 1/100 1/50 1/25 DILUCION ANTIGENO 1/ / ELISA IgM 1/ Tabla Nº 2. Titulación de antígeno a diferentes concentraciones de suero, el conjugado se trabajo a dilución 1/1000. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio. V.3. Titulación del conjugado y suero: Los datos también son representados con ratios, además también se probaron distintas soluciones la mismas diluciones del pool de sueros positivo y negativo (Tabla Nº3). La dilución óptima de conjugado fue 1:1000 con un ratio de 4.93 (Tabla Nº3 ).

14 DILUCIONES DE SUERO 1/100 1/50 1/25 DILUCION CONJUGADO 1/ ELISA IgM 1/ Tabla Nº 3 Titulación del conjugado a diferentes diluciones de suero. El antígeno se trabajo a una dilución de 1/50. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio V.4. Análisis de datos: Después de encontrar la dilución óptima del antígeno, del suero, y del conjugado se procesaron por la prueba ELISA IgM e IFI IgM los sueros controles y los casos confirmados por IFI IgTotal, y se halló el punto de corte con lo que se calculó la sensibilidad, especificidad, VPP, VPN para cada prueba, tal como se muestra en la Tabla N 4, 5 y 6. PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal PRUEBA (ELISA IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL POSITIVO a 78 b 11 a+b 89 NEGATIVO c 22 d 44 c+d 66 TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155 Tabla Nº 4. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM en rickettsiosis. k=0.83

15 PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal PRUEBA (IFI IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL POSITIVO a 82 b 05 a+b 87 NEGATIVO c 18 d 50 c+d 68 TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155 Tabla Nº 5. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar IFI IgM en rickettsiosis. k=0.88 RESULTADO FINAL ABREV. VALOR (%) ELISA IgM VALOR (%) IFI IgM VALOR DE CORTE VC / 64 SENSIBILIDAD Se ESPECIFICIDAD Sp VALOR PREDICTIVO POSITIVO VPP VALOR PREDICTIVO NEGATIVO VPN Tabla N 6: Resultado de las evaluaciones realizadas para las pruebas ELISA IgM e IFI IgM para rickettsiosis hallados en el presente trabajo. Se observa en la Tabla N 6 que la prueba IFI IgM para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo presentó una mejor especificidad y sensibilidad, en comparación con la prueba ELISA IgM.. En la Tabla N 4 y 5 se muestran los resultados de ELISA e IFI IgM y se compara ambas pruebas con índices de concordancia como el índice Kappa que con una valor de 0.83 y 0.88 nos indica que hay una mejor concordancia para la prueba IFI IgM.

16 VI. DISCUSION El antígeno producido en el presente trabajo (31) es un extracto crudo, lo que indica que puede presentar reacción no especifica en la prueba (34). Muchos protocolos de purificación de antígeno utilizan Renografina para hacer una gradiente de separación y obtienen hasta una cantidad de 3.3 mg de Rickettsias purificadas por frasco de cultivo celular (27, 28, 29), nuestros resultados muestran que a partir de 05 frascos de cultivo celular (24mL aproximadamente con una concentración 1.5 x 10 7 células/ml) es posible obtener una concentración de antígeno rickettsial de µg. La cantidad de antígeno purificado con Renografina es mucho mayor que la obtenida en el presente trabajo, sin embargo; la diferencia en los costos es muy significativa. Es importante señalar que debe utilizarse un mismo lote de preparación de antígeno para estandarizar y validar la prueba (34). La estandarización de la prueba ELISA (24) fue adaptada a las condiciones de laboratorio relacionadas al tipo de placa, buffer de sensibilización, agente bloqueador, y conjugado. La placa de elección fue NUNC polysorb, por ser una placa de baja adherencia que solo se enlaza con partículas hidrofóbicas, al trabajar con un antígeno parcialmente purificado esta selección en el enlace es un ventaja porque hay menos probabilidad que se adhiera proteínas que den reacción no especifica (36). En relación al buffer de sensibilización se selecciona al que más se aproxime al punto isoeléctrico de la proteína que se va adherir al plástico (34). En nuestro trabajo, el antígeno utilizado tiene una mixtura de proteínas y por lo tanto no se puede calcular el punto isoeléctrico, por ello se requiere un buffer neutral como PBS a un ph 7.2 (34). Se han probado antígenos mas específicos como con LPS (lipopolisacaridos de membrana) con costos elevados y donde se reportan 100% de sensibilidad y 87.5% de especificidad (25), sin embargo; en el presente estudio se muestra una aceptable sensibilidad y especificidad con una producción de antígeno a menor costo. La sensibilidad y la especificidad fueron calculadas por el método de análisis de casos, el mas conocido es el punto de corte que se halla calculando el promedio de los seis negativos mas tres desviaciones estándar (34) y necesita 30 casos como mínimo para su evaluación (35) pudiendo resultar una limitante para otros estudios.

17 La prueba IFI IgM presenta los mejores resultados en la evaluación tanto en sensibilidad (82%), especificidad (90.9%) y concordancia en relación a la prueba gold estandar IFI IgTotal utilizada en el INS (k=0.88) y teniendo en cuenta la menor complejidad que requiere para su implementación (20,21,22) por lo que sería de gran utilidad en estudios epidemiológicos de zonas endémicas para rickettsiosis y mejorando aún más su especificidad podría ser de aplicación en el diagnóstico.

18 VII. CONCLUSIONES La lisis del antígeno rickettsial con ultrasonido (sonicador) ofrece mejores resultados que la producida con shock térmico. La concentración de antígeno para revestir el pocillo de la microplaca de ELISA IgM es de 1.4μg/mL (1/50), mientras que en la IFI IgM se requiere 10 3 células/ml sin aplicación de lisis celular. La dilución del conjugado anti-human IgM (u cadena especifica) sintetizado en cabra y ligado con peroxidasa fue 1/1000, mientras que la dilución del conjugado anti-human IgM ligado a FITC fue de 1/100. La sensibilidad y especificidad detectada para la prueba IFI IgM fue mayor que la encontrada en la prueba ELISA IgM,

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23 Buffer salino fosfato (PBS al 1M) SOLUCIONES Y BUFFER Cloruro de sodio (NaCl) 8g Cloruro de potasio (KCl) 0.2g Fosfato monobásico de sodio anhídrido (Na 2HPO 4) 0.91g Fosfato monobásico de potasio anhídrido (KH 2PO 4) 0.14g Agua bidestilada 1 L Regular hasta ph 7.2 con Ácido Clorhídrico 1M y con Hidróxido de sodio 1M Buffer de lavado Buffer PBS Buffer de dilución Buffer PBS Tween 20 al 0.5% Skim milk al 2.5% Tween 20 al 0.5% Buffer citrato Ácido cítrico (C 6H 8O 7) 5.1g Fosfato monobásico de potasio anhídrido (Na 2HPO 4) 7.47g Agua destilada 1L Preparación de sustrato Reactivo parada: Buffer citrato 12.5 ml Ácido sulfúrico (H 2SO 4) al 1N Pastilla de OPD (1 unidad) 5 mg Ácido sulfúrico (H 2SO 4) 53 ml Peroxido de hidrogeno H 2O 2 5 µl Agua destilada 100 ml

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