11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A61L 2/04

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A61L 2/04 A61K 3/16 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Composición para estabilizar el plasma sanguíneo durante el pasteurizado y procedimiento de pasteurizado que comprende la utilización de esta composición. kprioridad: FR k Titular/es: Association pour l Essor de la Transfusion Sanguine dans la Region du Nord 21, rue Camille Guerin F-9012 Lille, FR k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Burnouf, Miryana (née Radosevich) k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Dávila Baz, Angel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Composición para estabilizar el plasma sanguíneo durante el pasteurizado y procedimiento de pasteurizado que comprende la utilización de esta composición. La invención se refiere a una composición que permite estabilizar el plasma sanguíneo durante el pasteurizado, a un procedimiento que utiliza la citada composición y a las soluciones plasmáticas así obtenidas, particularmente destinadas a las terapias para el nivelado del plasma o a las terapias de substitución en factores de la coagulación sanguínea. El plasma humano total o desprovisto de crioproteínas se utiliza aún como terapia de nivelado para los grandes quemados, los sujetos gravemente traumatizados o que hayan sufrido importantes intervenciones quirúrgicas, es decir en todo aquellos casos en los que los pacientes sufran importantes pérdidas de fluidos. Generalmente se utiliza, para este tipo de terapia, plasma procedente de donadores unitarios, de sujetos sanos y previamente controlados, para evitar los riesgos de transmisión de enfermedades virales. Este procedimiento no permite, sin embargo, eliminar todos los riesgos de contaminación por virus en fase preserológica, en particular los diferentes virus de la hepatitis y del SIDA. Así pues parece siempre importante proseguir la puesta a punto de métodos de inactivación viral y de composiciones estabilizantes que preserven las funciones biológicas esenciales del plasma. Se ha demostrado que el virus de la hepatitis B era totalmente inactivado por medio de un calentamiento a C durante horas, en presencia de citrato de sodio 0, M (Tabor et al. Thrombosis Res. 22, 1981, ). Sin embargo este tratamiento entraña una pérdida de actividad biológica de ciertas proteínas del plasma (Tabor et al. y Barrowcliffe et al. Fr. J. Haematology, 1983, 37-46). Se han podido someter diferentes proteínas de interés terapéutico, purificadas a partir del plasma sanguíneo, a un pasteurizado clásico a C durante horas en presencia de diversos estabilizantes. Se comprueba sin embargo que las composiciones que estabilizan una actividad biológica pueden ser totalmente ineficaces sobre otra. Estos diferentes datos experimentales han conducido a la idea de que la inactivación viral del plasma total (plasma fresco o plasma fresco congelado) o del plasma desprovisto de crioproteínas no podía realizarse por medio de un pasteurizado. Sin embargo, debido a la necesidad médica existente en plasma total, la solicitante ha buscado poner a punto composiciones que aseguren la protección simultánea de la actividad biológica de todos los factores de interés terapéutico del plasma contra el desnaturalizado durante el pasteurizado. De este modo, en la solicitud de patente WO la solicitante ha mostrado que una mezcla de sorbitol, de heparina, de lisina y de CaCl 2 estabilizaba eficazmente la actividad biológica de los factores plasmáticos durante el procedimiento de pasteurizado. Sin embargo, la presencia de heparina en esta mezcla estabilizante y, por lo tanto, en la prepa ración final, no permite inyectar este plasma a pacientes ya sometidos a un tratamiento con heperina. Este es el motivo por el cual la solicitante ha buscado otra composición que cumpla la misma función de estabilizado. Habiéndose observado precedentemente que el sorbitol ofrecía una cierta protección contra el desnaturalizado térmico, pero con resultados variables de una muestra de plasma a otra y con bajos rendimientos, la solicitante ha buscado diferentes aditivos cuya mezcla con el sorbitol aumentaría su poder estabilizante y, en particular, ha obtenido buenos resultados por adición de una cantidad de sacarosa próxima al 0 % de la cantidad de sorbitol. Por otra parte, la observación de una inestabilidad del CaCl 2 en el transcurso del calentamiento prolongado ha conducido al su reemplazmaiento por el gluconato de calcio que resiste bien a las condiciones de pasteurizado. Además, la adición de citrato trisódico ha mejorado el efecto protector de la mezcla, a condición de ajustar cuidadosamente la concentración, en efecto, una dosis demasiado baja permite la coagulación espontánea del plasma y una dosis demasiado fuerte retrasa la actividad ulterior de los factores de coagulación en el curso de la utilización terapéutica del plasma. Finalmente la mezcla se combina con al menos dos ácidos aminados, preferentemente la lisina y la arginina. De este modo, la composición estabilizante según la invención está constituida por una mezcla de sorbitol, de sacarosa, de gluconato de calcio, de citrato trisódico, de lisina y de arginina. Se ajustan las concentraciones siguientes de los diferentes aditivos para un litro de plasma inicial a ser pasteurizado: - sorbitol, de 800 a 1.0 g y preferentemente 1.0 g, - sacarosa, de 0 a 0 g y preferentemente 14 g, - gluconato de calcio, de 3 a mm y preferentemente 4 mm, - citrato trisódico, de 8 a 2 mm y preferentemente 1 mm, - lisina, de 1 a g y preferentemente g, - argina, de 1 a g y preferentemente g. La composición según la invención se combina con plasma fresco o con plasma fresco congeladodescongelado, antes de someterlo a un pasteurizado por calentamiento a C±1 C, en estado líquido, durante horas. Tras el pasteurizado, la temperatura se disminuye progresivamente hasta C y la solución se somete a una diálisis para eliminar el sorbitol y la sacarosa. El tampón de diálisis tiene un ph de 7, y contiene citrato trisódico mm, gluconato de calcio 4 mm, cloruro de sodio 0,1 M, lisina a una concentración de g/l y arginina a una concentración de 3 g/l. Tampones de diálisis de composición diferente pueden utilizarse también en función de las necesidades. La solución se concentra a continuación para restablecer la dosificiación fisiológica de las proteínas plasmáticas.

3 3 ES T3 4 La solución resultante se somete a una filtración clarificante y seguidamente esterilizante, se acondiciona y seguidamente se congela o se liofiliza. La invención se refiere también al procedimiento de pasteurizado del plasma que comprende la adición de la composición según la invención en el plasma, antes de su calentamiento y, seguidamente la diálisis del plasma pasteurizado contra el tampón tal como se ha definido más arriba. Este procedimiento es particularmente ventajoso puesto que puede ser aplicado a grandes lotes de plasma procedentes de varias recogidas independientes. De este modo el pasteurizado de lotes del orden de litros o mas permite, tras haber efectuado los controles apropiados, garantizar una constancia de calidad bioquímica del producto. La invención se refiere también a las soluciones plasmáticas pasteurizadas obtenidas por el procedimiento según la invención, las citadas soluciones comprenden el plasma total o el plasma desprovisto de ciertas proteínas (como las proteínas del crioprecipitado) y destinadas a un uso terapéutico, bien para la substitución del plasma total, bien para compensar una deficiencia en un factor sanguíneo particular. La composición y el procedimiento según la invención pueden aplicarse del mismo modo al plasma de origen animal. Ventajosamente se aplicarán al suero fetal bovino utilizado como aditivo para los cultivos celulares mas particularmente destinados a la preparación de productos terapéuticos. El ejemplo siguiente describe un modo de realización de la invención sin por ello limitar su alcance. Ejemplo Se combinan sesenta litros de plasma descongelado con la mezcla siguiente, bajo agitación suave: sorbitol sacarosa gluconato de calcio citrato trisódico lisina arginina cantidad por litro de plasma inicial 1.0 g 14 g 4 mm 1 mm g g El pasteurizado se realiza en una cuba termostatada, por calentamiento a C durante horas. Tras el pasteurizado la temperatura se reduce progresivamente hasta C y seguidamente la solución se somete a una diálisis para eliminar el sorbitol y la sacarosa. La diálisis se efectúa, por ejemplo, sobre un sistema de ultrafiltración sobre chasis (Pellicon (M) ). La composición del tampón de diálisis es la siguiente: -citratosódico mm - lisina g/l - arginina 3 g/l - gluconato de calcio 4 mm - cloruro de sodio 0,1 M. La eliminación del sorbitol se verifica por valoración colorimétrica y la de la sacarosa por valoración enzimática, sobre el producto acabado La diálisis puede ir seguida, en caso dado, de una concentración sobre el mismo material para retornar los grados en factores de coagulación casi a1u/mlcomoen un plasmaterapéutico de buena calidad. El producto se dializa a una osmolaridad de 370 mosmol/l y a un ph de 7-7,. El producto se esteriliza a continuación por filtración, por ejemplo sobre filtro Millipack (M) (Millipore (M) )conporosde0,22µm. Seguidamente se efectúa la distribución del material en bolsas de plástico o en frascos por congelación o por liofilizado. La eficacia del pasteurizado sobre la inactivación viral ha sido evaluada sobre una elección de virus recomendada por el grupo de expertos en biotecnología/farmacia de las instancias europeas para la validación de los procedimientos de eliminación y de inactivación viral de los productos biológicos. Los resultados está representados en la tabla siguiente: Virus Ge- Es- Reducción Duración noma tructura de la capacidad de infección (log ) VIH ARN E > < min Polio Sabin 1 ARN NE >6,23 < horas Vacuna ADN E >4, <1 hora Herpes de Aujeszky ADN E >4,1 > horas Parainfluenza tipo 3 ARN E >6, <2 horas Reovirus tipo 3 ARN NE >3,28 horas Sindbis ARN E >,74 < horas E = desarrollado NE = no desarrollado. Los resultados de los controles de calidad efectuados sobre 6 lotes piloto consecutivos están indicados en las tablas siguientes. TABLA II Recuperación de los factores sanguíneos Concentración Rendimiento (U/ml) (%) Proteínas (g/l),0 ± 6 93 ± 2 Factor VIII:c (1 tiempo) (UI/ml) 1, ± 0,26 94 ± 7 Factor VIII: c 0,70 ± 0,09 83 ± 13 (cromogénico) 1,12 ± 0,2 83 ± 4 Factor V: c 0,98 ± 0,06 88 ± 7 Factor XI: c 0,64 ± 0, 9 ± 7 Factor IX: c 0,6 ± 0,0 67 ± 6 Factor VII: c 3, ± 0,28 92 ± Fibrinógeno Ag (g/l) Fibrinógeno coagulable (g/l) 2,0 ± 0,17 92 ± 3 Actividad antitrombina III (g/l) 0,99 ± 0,04 92 ± 3 Actividad alfa-1-antitripsina (g/l) 0,96 ± 0, 92 ± 3 APTT 3-38 seg. - 3

4 ES T3 6 TABLA III Control de calidad: ausencia de proteasas y de productos de degradación Concentración (U/ml) Trombina <0,01 PKA ( %) <2 Calicreina ( %) 3 Factor IXa (U/ml) <0,1 Factor Xa (U/ml) <0,1 Factor VIIb/FVIIa 0,97 Actividad proteolítica (S DO/mn) 0,03 Productos de degradación del fibrinógeno (ng/ml) < 1 TABLA IV Control de calidad sobre modelos animales, in vivo Ensayo sobre ratas: -tensión arterial < -2% -ritmocardíaco inalterado - toxicidad (inyección) intravenosa - 2 ml/kg) ausencia de toxicidad Ensayo sobre conejos: - pirogenicidad no pirógeno El plasma pasteurizado en presencia de la composición estabilizante definida mas arriba responde a las normas previstas para una utilización terapéutica

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Composición para estabilizar el plasma sanguíneo durante el pasteurizado, caracterizado porque está constituida por una mezcla de sorbitol, de sacarosa, de gluconato de calcio, de citrato trisódico, de lisina y de arginina. 2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de sorbitol está comprendida entre 800 y 1.0 g/litro de plasma inicial. 3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada porque la concentración de sorbitol es de 1.0 g/l. 4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la concentración de sacarosa está comprendida entre 0 y 0 g/l.. Composición según la reivindicación 4, caracterizada porque la concentración de sacarosa es de 14 g/l. 6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a, caracterizada porque la concentración de gluconato de calcio está comprendida entre 3 y mm. 7. Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la concentración de gluconato de calcio es de 4 mm. 8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la concentración de citrato trisódico está compren- 1 2 dida entre 8 y 2 mm. 9. Composición según la reivindicación 8, caracterizada porque la concentración de citrato trisódico es de 1 mm.. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque las concentraciones de lisina y de arginina están comprendidas entre 1 y g/l. 11. Composición según la reivindicación, caracterizada porque las concentraciones de lisina y de arginina son de g/l. 12. Procedimiento de pasteurizado del plasma sanguíneo caracterizado porque comprende la adición de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el plasma, antes de la etapa de calentamiento y, seguidamente, la eliminación de los azúcares de la citada composición, tras la etapa de calentamiento, por diálisis contra tampón que contiene citrato trisódico, gluconato de calcio, cloruro de sodio, lisina y arginina. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el tampón de diálisis contiene citrato trisódico mm, gluconato de calcio 4 mm, cloruro de sodio 0,1 M, g/l de lisina y 3 g/l de arginina. 14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque es aplicable a volúmenes de plasma comprendidos entre 1 litro y varias centenas de litros NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.